EMT是人类结肠癌的主要治疗方案

摘要

背景

结肠癌长期以来被认为是一种分子异质性疾病。这种异质性被认为是难以确定解释疾病生物学和行为的统一分子假说的原因。结肠癌的分子谱分析是一种相对有效的早期和中期疾病预后判断方法。我们和其他人已经确定了影响多种程序（如粘附、侵袭和血管生成）的生物复杂特征，并与癌症进展和复发密切相关。这些特征似乎支持温伯格的假设[1]多个项目导致癌症的发展和进展。这些签名通常使用被监督的机器学习技术，在预先确定的预后良好和预后不良的患者群体上训练他们的模型[2-6]. 结肠癌不同于乳腺癌，在乳腺癌中已经确定了管腔和基础“固有”亚型[7-13]或膀胱癌复发的内在特征已经确定[14,15]，尚未分类无监督的，分子分析方法。我们认为，试图揭示可能导致结肠癌的无偏见的本土生物特征是很重要的。

方法

结果

我们完全接受了无监督的从临床分期谱对326例结直肠癌进行分类的方法。我们着手确定差异表达最明显的基因，并使用第一主成分（PC1）（约5000个差异表达基因）来描述两个主要亚群（图1a、b). 支持“固有”PC1特征的约5000个基因的生物学并非来自通常识别与复杂特征相关的多条通路的标准功能分析算法。事实上，通过Ingenuity、Kegg和GeneGo方法对PC1进行的分析确定了多种可能导致观察到的分子亚类化的潜在途径（附加文件1). 这种方法并没有准确地阐明观察到的基因表达变化背后的生物学原理，但表明粘附和细胞外基质受到了显著影响。为了更好地描述PC1的功能，我们检测了许多（~300）细胞系衍生和肿瘤衍生的信号，以确定它们与PC1的关联。该分析确定了细胞系衍生的上皮-间充质转化基因表达特征与^-135)带PC1（图​（图1c）。1个). 这一特征来自对93个肺癌细胞株的分析，这些细胞株之前已经通过两个与EMT表型相关的基因CDH1和VIM进行了全局分子分析和分类（图​（图1d，1天，其他文件2). 然后将细胞系分为两组，其中一组被认为是上皮的（高CDH1，低VIM），并考虑一个间充质的（低CDH1，高VIM）（附加文件三). 然后，这两个组被用来鉴定约300个基因，这些基因将进一步区分上皮细胞和间充质细胞系。这组基因随后成为细胞系衍生的“EMT特征”。更重要的是，EMT信号的上下臂与PC1呈定向相关（P<10^-16，Fisher精确测试）（附加文件4). 重要的发现是无监督的代表结肠癌“固有”亚型分类器的PC1特征似乎由上调和下调基因的核心EMT程序驱动（附加文件4). 事实上，92%映射到EMT UP基因集的探针（在间充质细胞和上皮细胞系中上调的基因）与PC1呈正相关，82%的EMT DOWN基因集探针（分别下调的基因）对应于Fisher精确测试p值2×10^-16[18].

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图1

人类结直肠癌的内在分子分层.无监督通过对来自结直肠癌病例的全球基因表达数据进行分析和层次聚类，确定了两个主要的“固有”亚类（青色和品红色），这两个亚类由最可变基因的第一主成分（PC1）区分。这两个关键的本地亚型在（a）莫菲特癌症中心（MCC）数据集（n=326）和（b）EXPO数据集（n=269）中都得到了明确的识别。后来发现PC1与来源于细胞系的EMT信号密切相关，为两个数据集中这两个内在类别的生物学基础提供了解释。PC1明确区分了两个亚类，随后被确定为上皮和间叶。在面板（a）和（b）上，均显示了以平均值为中心的探针强度，并使用基于皮尔逊相关的距离和沃德链接对探针进行聚类。此外，行表示样本，列表示数组探测。面板（c）显示了莫菲特癌症中心数据集上EMT特征得分和PC1（第一主成分得分）的散点图。面板（D）显示了93个肺癌细胞系中波形蛋白（VIM）和E-cadherin探针的探针强度之间的散点图。显示上皮样表型的细胞系以绿色显示；那些表现出间充质样表型的显示为红色。

我们进一步证实了在独立的ExPO数据集（n=269）中同样的嵌入式基因表达模式（PC1）的表达（图​（图1b），1亿)这表明EMT是一个支持结肠癌生物学的普遍项目。为了进一步阐明EMT与PC1特征的相关性，对先前与EMT程序相关的基因，如VIM、FGFR、FLT1、FN1、TWIST、AXL和TCF进行了单独评估，发现它们与PC1/EMT呈正相关（图​（图2）。2). 同样，CDH1、CLDN9、EGFR和MET等基因与PC1/EMT呈负相关。图中还显示了多基因签名（黑色标签），如EMT、TGF-β、RAS、增殖和MYC；TGF-β是EMT的已知驱动因素，因此与PC1和EMT相关。或者，RAS激活/依赖/成瘾已被证明与EMT反相关[19]. K-RAS依赖性细胞呈现上皮形态，表达显著的皮质CDH1，但VIM很少。相反，RAS依赖性细胞表达少量CDH1，但VIM显著。我们的结果与这些发现一致。感兴趣的是，增殖和这种效应物（MYC）都与EMT反相关。

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图2

通过文本挖掘方法评估的前100个基因的层次聚类分析与EMT程序密切相关，如PC1分类的326个MCC结肠肿瘤所示100个基因集包含单个基因（CDH1、CLDN9、FGFR1、FN1、TWIST 1&2、AXL、VIM）以及基因特征（PC1、EMT、TGFbeta、增殖、MYC和RAS），这些基因在间叶肿瘤中上调（以洋红色显示），在上皮肿瘤中上调。相关基因签名的名称以黑色显示。样本（行）按PC1排序。利用皮尔逊相关和沃德连锁对基因（列）进行聚类。热图显示以平均值为中心的探针强度。

确定EMT特征是否受特定microRNA的调控[20]，我们使用~415全球MiR平台重新分析了~70例I-IV期结肠癌，该平台先前已通过微阵列分析进行了评估。在这70个样本中，有49个样本在数据处理和质量控制后用于分析。在所有测试的MiR中，MiR 200家族与PC1/EMT签名的反相关性最高（图​（图3，三，其他文件5，其他文件6). 虽然从冷冻组织中进行PC1基因表达分析，但使用匹配的福尔马林固定石蜡包埋组织（FFPE）进行MiR分析，这加强了观察结果穿过平台。

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图3

49例结直肠癌的microRNA分析（~700）与PC1/EMT的相关性表明MiR200家族与PC1/EMT呈强负相关（上部图）。Mir 200家族与抑制EMT（促进上皮表型）通过抑制已知的CDH1转录抑制因子Zeb 1和2。瀑布图显示，MiR 200过度表达与上皮性肿瘤多于间叶性肿瘤相关，MiR 200表达不足与上皮性癌少于间叶性癌相关（图较低）。

在确定PC1是与EMT程序密切相关的内在基因表达特征后，我们想确定间充质的表型（高PC1/EMT评分）可预测疾病复发。令我们惊讶的是，尽管PC1是采用非监督方法开发的，但它能够区分预后良好与不良，并且与疾病的复发和进展密切相关，即使是在中期II期和III期（图​（图4a，4a类，其他文件7,8,9,10). 它还与癌症进展和分化不良状态有关。我们在Lin et al[21]、NKI和EXPO数据集（附加文件11). 此外，在莫菲特癌症中心的结肠癌数据集中，PC1也预测了无病生存率（图​（图4b）。4b个). 然而，更重要的是，PC1也预测了另外两个完全独立的数据集。在NKI的数据集中，PC1预测了无转移生存率（图​（图4c）4c类)在Lin等人的数据集中[21]，PC1预测复发（图​（图4d）。4天). 当PC1信号应用于不同复发率的癌症时，结肠癌、肺癌和胰腺癌（结肠癌＜肺癌＜胰腺癌）之间也有明显差异（其他文件12,13,14,15和16).

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图4

协方差矩阵显示PC1与疾病复发的相关性（a）尽管PC1是通过非监督方法开发的，但似乎与EMT、疾病复发、疾病进展和分化状态密切相关，但与腺瘤与癌、MSI状态或粘液性与非粘液性癌相关的基因特征无关。此外，PC1与RAS、MYC、增殖和结肠侧化呈反相关。PC1在MCC数据集（b）以及两个独立测试集中区分预后良好和较差的患者：（c）荷兰癌症研究所（NKI，#13）（L.V.V.）和（d）Lin等人数据集[21].

我们还测试了已知的签名，或在结肠癌数据集中开发了许多其他签名，这些签名与PC1没有很好的相关性。其中包括预测MSI状态的特征码[22]、分离左、右结肠肿瘤的特征、分离粘液性和非粘液性肿瘤的特征以及增殖特征[23]（图​（图4a）。4a类). PC1信号在区分上皮性和间叶性肿瘤的同时，也可用于细胞系的分类。这种分类无疑将有助于利用这些细胞系作为模型进一步分析癌症中的EMT。了解哪种细胞系最能代表上皮与间充质表型，将有助于确定后续药物干预和靶向验证研究的最佳模型，并将细胞系映射到人类肿瘤。为此，我们使用肿瘤衍生的PC1特征（附加文件16).

讨论

迄今为止，结肠癌被认为是一种异质性很强的疾病[24,25]. 很难确定一个统一的生物学主题来进行治疗干预。以前确定的预后特征需要有监督的学习来阐明预测基因集。我们的数据首次表明，通过非监督方法发现的PC1信号似乎是结肠癌的固有亚型分类器，根据EMT生物学预测复发、进展阶段和不良预后。发现PC1评分可以预测结肠癌II期和III期的复发，并且它与EMT生物学密切相关，因此这种特征可能在这些阶段有助于识别辅助化疗的反应性。我们的数据表明，分子和病理上的异质性疾病可以分解为结肠癌的两个主要分子亚型：上皮的或间充质的.

将全球microRNA图谱数据与全球基因表达数据集相关联的额外分子研究进一步支持了固有EMT程序的鉴定。从该分析中，MiR 200家族和相关MiR被确定为与PC1高度负相关。这一发现意义重大，因为MiR 200家族与EMT项目密切相关。以前已经证明，MiR 200过表达可能导致ZEB1/2的抑制，进而导致CDH1转录抑制因子的抑制，从而允许CDH1的表达和上皮表型的表达[26,27]. 因此，MiR200与促进间充质表型的EMT特征呈负相关是一致的。MiR 200和PC1之间的关系很强，即使使用非镜像FFPE组织代替原始冷冻标本，也可以在相对较少的肿瘤上检测到，这表明EMT程序在原发肿瘤中普遍存在。此外，MiR 141（MiR 200家族成员）也被确定与EMT呈负相关，证实了先前的观察结果。最后，已经确定了许多之前尚未报告与EMT相关的其他MIR。

PC1与EMT以外的生物程序相关的分析也提供了信息。有趣的是，MSI肿瘤通常倾向于更好的预后和右侧倾向，但PC1评分相对较低。与这些数据一致，最近的研究支持了MSI肿瘤与EMT不相关的假设[28]. 同样，粘液性肿瘤与局部复发有关，而不是与远处复发有关，因此这些肿瘤更多是上皮性的，而不是间充质的，这一发现在生物学上是一致的。最有趣的是，以前用于识别预后不良的乳腺癌和肺癌的增殖特征与预后良好的结肠癌有关，表明增殖可能不在结肠癌的进展中起着关键作用，但我们知道它对结肠上皮细胞的隐窝基底部生物学很重要。与此一致的是最近的观察结果，即结肠转移瘤的增殖指数低于原发性非转移瘤[29]. 对这一观察结果的一种解释可能是，转移病灶可能经历了间充质向上皮的转变（MET）[30]. 因此，PC1是向间充质状态过渡的先兆，可以预测在许多观察到的临床场景中的不良结果与良好结果。这些PC1反相关信号为结肠癌的生物学提供了进一步的线索。

我们的数据也支持这样一个概念，即与TGF-B激活相关的间充质亚型可能与疾病的进展阶段、分化不良状态和远处复发有关，但与RAS、MYC、MSI或增殖无关。RAS激活与EGFR等基因驱动的上皮表型相关，似乎与PC1/EMT或间充质特征反相关。

对其他癌症（如胰腺癌和肺癌）的分析表明，EMT在各种疾病（结肠<肺<胰腺）中的谱可以解释这些癌症（结肠>肺>胰腺）的不同生存率、不同的复发率以及对治疗的反应[31]. 如我们所示，现在可以利用这些观察结果对治疗干预模型的细胞系进行分类。我们预计PC1评分可能有助于对间充质和上皮表型的肿瘤进行分类，这些肿瘤可能对新类别的药物敏感，例如Src、Notch和FGFR抑制剂与EGFR抑制剂。

结论

总的来说，我们的数据表明，由强大的EMT生物学支持的“固有”PC1特征对结肠癌复发具有高度预测性，可能有助于将多种癌症亚类化，并可能为下一代新疗法提供识别敏感亚群的方法。

缩写

上皮间充质转化；PC1：第一主成分；MET：间充质-上皮转化

竞争性利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

AL、MN、JW、CB、DH进行了数据分析，解释了结果，并为手稿创建了数字。PS和PH提供了科学指导、批判性审查和数据解释。LVV和RT为测试集提供了临床样本。DA为实验的设计和分析提供了科学依据。AL和TY是手稿的主要作者。

发布前历史记录

本论文的出版前历史可从以下网址获取：

http://www.biomedcentral.com/1755-8794/4/9/prepub

补充材料

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