美国国家科学院院刊。2010年12月14日；107(50): 21848–21853.
通过Cre依赖性靶向和修饰狂犬病病毒的补体追踪体内单突触回路
,a、，b条 ,c（c） ,一 ,一和a、，b、，1
尼古拉斯·R·沃尔
一加利福尼亚州拉霍亚市索尔克生物研究所系统神经生物学实验室，邮编92037；
b条加利福尼亚大学圣地亚哥分校神经科学研究生项目，加利福尼亚州拉霍拉，邮编：92093；和
伊恩·维克沙姆（Ian R.Wickersham）
c（c）马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院霍华德·休斯医学研究所及脑与认知科学系，邮编02139
阿里·塞廷
一加利福尼亚州拉霍亚市索尔克生物研究所系统神经生物学实验室，邮编92037；
毛里西奥·德拉帕拉
一加利福尼亚州拉霍亚市索尔克生物研究所系统神经生物学实验室，邮编92037；
爱德华·M·卡拉威
一加利福尼亚州拉霍亚市索尔克生物研究所系统神经生物学实验室，邮编92037；
b条加利福尼亚大学圣地亚哥分校神经科学研究生项目，加利福尼亚州拉霍拉，邮编：92093；和
一加利福尼亚州拉霍亚市索尔克生物研究所系统神经生物学实验室，邮编92037；
b条加利福尼亚大学圣地亚哥分校神经科学研究生项目，加利福尼亚州拉霍拉，邮编：92093；和
c（c）马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院霍华德·休斯医学研究所及脑与认知科学系，邮编02139
已编辑*由加利福尼亚州帕萨迪纳加利福尼亚理工学院的David J.Anderson于2010年11月4日批准（2010年8月10日收到供审查） 作者贡献：N.R.W.、I.R.W.、A.C.和E.M.C.设计的研究；N.R.W.和M.D.L.P.进行了研究；N.R.W.和A.C.提供了新的试剂/分析工具；N.R.W.分析数据；N.R.W.和E.M.C.撰写了这篇论文。
- 补充资料
支持信息
GUID:E384C3F0-53E0-45D4-9299-B4786AEC13DB
GUID:DC88535D-343B-4F42-B7EB-BDC7F0EE794E
摘要
我们描述了一个强大的系统，通过使用Cre依赖性辅助病毒和改良狂犬病病毒，在Cre表达转基因小鼠中揭示特定细胞类型的直接单突触输入。我们产生了靶向Cre表达细胞基因表达的辅助病毒，使我们能够控制狂犬病病毒的初始感染和随后的单突触逆行传播。研究人员可以使用该系统以高通量的方式阐明与所需细胞类型的连接，仅受Cre鼠系可用性的限制。这种方法可以识别那些用其他方法研究起来非常繁琐或不可能的电路，并且可以用于在同一大脑区域内的许多不同类型的细胞上建立输入的子电路图。此外，通过表达狂犬病基因组中的各种转基因，该系统还具有在不干扰邻近细胞的情况下操纵靶向神经元回路的潜力。
关键词：跨突触体、假型病毒、腺相关病毒、EnvA、TVA
系统神经科学中最棘手的问题之一是对完整哺乳动物大脑中神经连接的系统描述。许多不同类型的神经元，每个神经元都具有不同的连接和功能，可以位于同一大脑区域。即使在一个新皮质柱内，数十种类型的投射神经元和局部中间神经元也会进行计算，最终导致该柱的峰值输出。通过使用分子和细胞生物学技术、电子显微镜和电生理学的艰苦研究，我们开始了解神经元的连接性如何在其嵌入的电路中促进其功能，但我们缺乏在体内进行电路级分析的有效手段。特别是在具有相当多神经元异质性的大脑区域，我们在研究细胞群如何形成精细连接、这些连接如何随时间变化以及这种可塑性如何影响细胞类型在动态电路中的计算作用方面的能力仍然非常有限。
标准的顺行和逆行神经元示踪剂可以揭示投射到特定脑区或来自特定脑区的神经元的位置，但无法识别实际接收突触连接的细胞类型。将顺行追踪与电子显微镜相结合可以克服这一困难，但此类研究极其繁琐，往往需要数年时间才能阐明其中一小部分可能的联系。此外，即使是EM研究也无法轻易揭示哪些细胞类型有助于顺行标记的突触，或者哪些细胞类型接受这些连接。在过去的二十年里，在活体脑切片上进行的电生理实验使得更容易以高分辨率检测连接成为可能。尽管仍然相对繁琐，但这些研究表明，连通性非常精确，使研究人员能够破译许多局部电路连通性的规则。然而，切片研究在揭示遥远神经元之间的联系方面能力有限，而这些联系往往是特定细胞上突触输入的主要来源。
病毒学和基因技术的现代进步现在开始补充更传统的方法，并有望彻底改变我们对复杂大脑结构中神经回路精确组织的理解(1). 例如，最近有可能在来源于已知来源和细胞类型的轴突中表达通道视紫红质，然后通过脑切片中的细胞内记录来测试可能的突触后功能连接靶点(2). 小麦胚芽凝集素（WGA）或破伤风毒素C片段的Cre依赖性表达可允许跨神经元追踪Cre表达小鼠系中特定细胞类型之间的连接(三,4)；然而，跨神经元扩散后缺乏扩增可能会限制弱连接的检测，而多突触扩散会导致细胞直接连接与间接连接的模糊。逆行性跨突触疱疹病毒（“伪狂犬病病毒”，PRV）的产生，其复制依赖Cre(5)和WGA-Cre融合蛋白的表达(6)提供可以放大的系统，因此可能更加敏感。尽管这些系统具有潜在的强大功能，但无法区分直接连接到起始种群的神经元和间接连接的神经元。此外，即使是减弱的PRV株也会在几天内杀死神经元(7)WGA可以顺行和逆行两个方向经神经传播(三,6,8).
我们在本工作中的目的是使用以细胞类型特异性方式表达蛋白质的转基因和敲除小鼠，结合修饰的狂犬病病毒，产生一种有效的系统，将直接的单突触输入标记到定义的细胞群上。先前的研究表明，糖蛋白基因缺失（ΔG）狂犬病病毒假型感染禽肉瘤白血病病毒糖蛋白EnvA（EnvA-ΔG狂犬病毒）可局限于表达TVA、，一种鸟类受体蛋白，除非通过基因传递载体提供，否则在哺乳动物细胞中不存在(9). 通过在同一细胞中选择性地分别表达狂犬病糖蛋白（G），病毒的逆行传播可以限制到直接突触前神经元。狂犬病基因组报告基因的表达直接揭示了突触连接的神经元(9)受感染的神经元可以存活数周(10).
我们的最终目标是扩展这项技术，以开发一种稳健、可靠和准确的方法来识别体内特定细胞群的直接输入，并使这项技术普遍适用于各种脑区和细胞类型。为了实现这些目标，我们开发了表达狂犬病病毒感染和跨突触传播所需蛋白的Cre依赖性病毒载体。我们选择这种方法是因为立体定向注射Cre-dependent病毒提供了一种以空间定位方式传递感兴趣基因的方法，使我们能够在我们选择的特定脑区中靶向特定的细胞类型。此外，最近有研究表明，具有Cre依赖性基因盒的腺相关病毒（AAVs）可以限制转基因在体内表达Cre重组酶的细胞中的表达(11——13). 该策略允许研究人员使用数百种以受限方式表达Cre的现有鼠标线，以及许多其他正在积极开发的Cre线。Cre鼠标生成的高吞吐量示例包括艾伦研究所的工作(14)以及GENSAT项目(15).
在本文中，我们描述了一种双病毒系统，该系统能够可靠地针对大脑中的特定细胞类型，并标记其在体内的直接单突触连接。该系统可以应用于许多不同的大脑区域，只需进行最小的修改，并为在哺乳动物大脑中执行电路级研究提供了一种吸引人的方法。它有可能在不干扰相邻神经元回路的情况下，将各种基因编码工具提供给靶向网络，从而进一步扩大其在神经科学界的应用。
结果
为了利用在特定细胞类型中表达Cre的小鼠系，我们开发了辅助病毒，表达EnvA-ΔG狂犬病病毒感染、互补和单突触逆行传播所必需的基因(). 这些辅助病毒在表达Cre重组酶的细胞中选择性地表达其基因有效载荷，并使用FLEX双丝线系统以Cre依赖的方式可靠地表达基因(13). 因为泄漏的少量TVA足以促进EnvA伪型病毒感染(16)我们还删除了Cre-dependent盒中所有基因的ATG起始密码子，并将一个Kozak序列置于FLEX盒的前面。Cre重组酶作用于逆转基因序列，并将盒锁定在正确的转录方向和框架中(). 我们使用口蹄疫2A型元件连接多个基因(17,18)允许从单个ORF生产多种蛋白质产品。我们将Cre-dependent盒包装成AAV血清型9载体（AAV9），因为该血清型在小鼠大脑中具有广泛的感染潜力。
使用Cre-dependent辅助病毒靶向狂犬病病毒感染和单突触逆行传播。(A类)将Cre依赖性辅助病毒（绿色）注射到一只在特定细胞类型中表达Cre的小鼠的大脑中(Cre公司+). 在Cre重组后，该辅助病毒表达两种蛋白质，这两种蛋白质对随后的狂犬病病毒感染（TVA）和单突触逆行传播（狂犬病糖蛋白B19G）是必要的。TVA是一种禽类受体蛋白，具有感染狂犬病病毒假型禽肉瘤白血病病毒糖蛋白EnvA（红色）的能力。在没有TVA的情况下，EnvA伪型狂犬病病毒无法感染哺乳动物神经元，从而限制狂犬病感染TVA表达细胞。狂犬病病毒自身的糖蛋白基因已从基因组中删除，这使得该病毒在缺乏狂犬病糖蛋白另一来源的情况下无法逆行传播。辅助病毒补充了这一缺陷，使狂犬病病毒逆行传播一个突触。这种突触前神经元群不表达狂犬病糖蛋白，因此狂犬病病毒无法进一步传播，从而限制了狂犬病感染少数Cre表达细胞及其直接突触前伙伴。(B类)产生依赖Cre的AAV血清型9辅助病毒载体，以表达GFP和TVA（AAV9-pEF1α-FLEX-GT；上部)或TVA和狂犬病G（AAV9-pEF1α-FLEX-GTB；下部)在目标细胞类型中。使用FLEX双floxed系统赋予Cre依赖性，其中Cre重组酶作用于相互排斥的lox位点集[lox2272（紫色三角形）和loxP（红色三角形）]，以将反向补体基因序列锁定到正确的转录方向。从所有基因中去除起始ATG，并在双固定盒外添加单个Kozak序列，以消除任何剩余的泄漏表达。为了在单个启动子的控制下表达多个基因，编码序列通过口蹄疫病毒2A型元件（蓝框）连接。(C类)狂犬病病毒基因组已被修改，糖蛋白基因（G）被荧光报告基因mCherry取代。然后用EnvA对狂犬病病毒进行假分型，以产生（EnvA）SAD-ΔG-mCherry。
辅助病毒基因盒的Cre依赖性重组。辅助病毒携带反向互补的基因序列，两侧有两组相互排斥的lox位点，称为FLEX(13). Cre可以作用于任一对lox位点，lox2272（紫色三角形）或loxP（红色三角形），但不能介导不同类型的lox位点之间的重组。通过Cre介导的反平行lox位点的反转，然后Cre介介导的相同平行lox位置的删除，这种双漂浮系统将Cre依赖性盒稳定在适当的方向，从而实现高水平的基因表达。
然后我们使用了这个系统，如中所示，直接证明狂犬病病毒感染和特定突触后神经元群的单突触逆行传播。我们开发了编码禽病毒受体TVA和狂犬病G的Cre依赖性辅助病毒，并感染了感兴趣的大脑区域(; “助手病毒”）。在Cre表达神经元中表达TVA和G后，我们将表达荧光蛋白的EnvA-ΔG狂犬病注射到同一脑区(; 狂犬病病毒）。这种狂犬病病毒只能感染表达EnvA结合伴侣TVA的细胞(9)从而将狂犬病病毒感染靶向Cre-expressing细胞。然后，新合成的狂犬病病毒颗粒可以与这些细胞中表达的狂犬病毒糖蛋白互补，从而使狂犬病毒在突触接触处逆行传播，直接标记突触前神经元。狂犬病感染细胞由狂犬病基因组表达的荧光蛋白唯一标记(，红色神经元）。由于突触前神经元不表达狂犬病糖蛋白，这些细胞不能产生感染性狂犬病病毒颗粒，从而限制了对目标细胞类型及其直接单突触输入的感染(9,10,19).
为了证明概念，我们首先使用这个系统来重述小鼠小脑中已知的电路。为了证明我们可以靶向辅助病毒基因的表达，并进一步将EnvA-ΔG狂犬病病毒感染到特定的细胞类型，我们注射了180 nL的Cre依赖性辅助病毒，表达由T2A元件（AAV9-pEF1α-FLEX-GT）连接的GFP和TVA几乎只在小脑浦肯野细胞中表达Cre的小鼠的小脑[L7-Cre小鼠(20)] (). 然后，3周后，我们将180 nL mCherry-expressing（EnvA-ΔG-mCherry）狂犬病病毒注射到同一位置(). 注射狂犬病病毒1周后提取脑组织并进行处理。正如预期的那样，Cre依赖型AAV几乎只在Purkinje细胞中表达GFP()EnvA伪型狂犬病病毒只能感染这些表达TVA的细胞。在一只代表性动物中，每六个切片计数一次，用mCherry标记的151/151个细胞中也有GFP阳性，其中145个（96%）是Purkinje细胞。在缺乏狂犬病糖蛋白的情况下，狂犬病病毒不能通过突触体传播(). 此外，在WT动物中，AAV和狂犬病病毒的报告基因表达几乎完全无法检测到，没有细胞表达GFP，8.0±8.0细胞（平均值±SEM）表达mCherry(n个=2只动物）(). 这些结果与进一步控制实验的结果相结合(图S1)证明EnvA-ΔG狂犬病病毒在没有TVA的情况下不能感染神经元，Cre依赖性辅助病毒能够在体内将TVA传递给特定的细胞类型，EnvA--ΔG病毒只能感染那些表达TVA的细胞。
辅助病毒介导狂犬病病毒感染并在L7-Cre小鼠小脑中传播。(A–C)将表达Cre依赖性eGFP和TVA的辅助病毒（AAV9-pEF1α-FLEX-GT）注射到L7-Cre小鼠的小脑中(A类和B类)和WT小鼠(C类)并允许在没有狂犬病病毒的情况下表达3周(A类)或随后注射表达mCherry的狂犬病病毒[（EnvA）SAD-ΔG-mCherry](B类和C类). (A类)正如预期的那样，Cre依赖型AAV几乎只在L7-Cre小鼠的Purkinje细胞中表达GFP。(B类)（EnvA）SAD-ΔG-mCherry只能感染表达GFP和TVA的细胞。在缺乏狂犬病糖蛋白的情况下，狂犬病病毒无法从Purkinje细胞传播到突触前颗粒细胞，在Purkinje细胞层正下方用蓝色DAPI染色浓密标记。顶行绿色Purkinje细胞位于狂犬病病毒注射的核心区域外，而底行位于狂犬病毒注射球的边界内。(C类)Cre-dependent AAV不能检测到GFP的表达，并且（EnvA）SAD-ΔG-mCherry不能感染WT动物的神经元，这表明Cre-depndent AAV有效地限制TVA仅表达于Cre阳性细胞。(D–F型)将表达TVA和狂犬病糖蛋白的Cre依赖性AAV（AAV9-pEF1α-FLEX-GTB）（eGFP在基因组中但未检测到表达）注射到L7-Cre小鼠的小脑中(天和E类)和WT小鼠(F类)3周后注射（EnvA）SAD-ΔG-mCherry。(天)（EnvA）SAD-ΔG-mCherry可直接感染L7-Cre小鼠Purkinje细胞，并在TVA和狂犬病G存在下通过突触前直接向突触前中间神经元和颗粒细胞扩散。狂犬病标签D–F型使用中的Redhot查找表进行可视化F类并覆盖在DAPI信号（蓝色）上，用于可视化小脑层。(E类)（EnvA）SAD-ΔG-mCherry可以从直接感染的浦肯野细胞通过攀爬纤维突触传播，并可以直接标记L7-Cre小鼠下橄榄中的突触前细胞。(F类)正如预期的那样，在WT动物中未检测到狂犬病病毒感染，这证实了在没有Cre的情况下TVA的表达受到了适当限制。（比例尺：100μm）
接下来，我们希望证明EnvA-ΔG狂犬病病毒在辅助病毒提供的狂犬病糖蛋白存在下的互补性和单突触逆行传播。由于Purkinje细胞的输入是已知的，我们很快就能评估该策略的有效性。我们产生了一种表达GFP-T2A-TVA-E2A狂犬病G的辅助病毒（AAV9-pEF1α-FLEX-GTB），并将该病毒注射到L7-Cre小鼠的小脑中，然后在3周后注射EnvA-ΔG-mCherry狂犬病病毒(). 使用这种辅助病毒不能可靠地检测到GFP，但TVA和狂犬病G都有功能性表达。正如预测的那样，在Purkinje细胞及其已知的直接单突触输入中检测到明亮的mCherry信号。在当地，数千个颗粒细胞及其平行纤维被标记()以及局部连接的小脑中间神经元。每六个部分取样一只示例动物，包含63 mCherry-expressing Purkinje细胞，以及数千个颗粒细胞，平均密度为85个细胞/100μm三区域，横跨≈2 mm×1 mm×250μm的带。此外，我们可以可靠地检测到下橄榄中标记鲜明的细胞，这表明狂犬病病毒可以有效地感染并逆行穿越长距离连接(). 在没有Cre的情况下，狂犬病病毒感染几乎完全无法检测到（0.5±0.5个细胞；n个= 2;)在Cre小鼠中没有检测到意外的连接（即引起小脑苔藓纤维输入的神经元），这表明狂犬病病毒不会虚假传播或突触外传播。这些结果表明，EnvA-ΔG狂犬病病毒可以感染特定的细胞群体，并在Cre依赖型TVA和狂犬病G存在时选择性标记其直接的单突触输入。
为了证明这种双病毒系统在小鼠新皮层中的效用，我们首先将AAV9-pEF1α-FLEX-GT（表达GFP和TVA）注射到小白鼠（PV）-Cre小鼠的桶皮层中，然后在3周后注射EnvA-ΔG-mCherry狂犬病病毒。正如预期的那样，我们检测到这两种病毒的荧光蛋白表达主要在PV中+中间神经元，但也观察到病毒蛋白在少量第5层锥体细胞中的表达(图S2). 尽管这些结果最初令人困惑，但最近的一篇论文(14)据报道，该小鼠系第5层的一些GABA阴性细胞实际上表达低水平的PV，因此也表达Cre。
为了证明我们可以将单突触输入标记到PV上+在新皮质的细胞中，我们将AAV9-pEF1α-FLEX-GTB（表达TVA和狂犬病G）注射到PV Cre小鼠的桶状皮质中(21)3周后出现EnvA-ΔG-mCherry狂犬病。正如预期的那样，我们在注射部位附近检测到数千个原发性和逆行性感染的神经元(). 此外，在已知投射到桶状皮层的脑区检测到逆行标记，包括对侧S1、同侧S2()和同侧丘脑核团VPm和Po(). 每六个断面取样一只PV-Cre动物，发现包含约600个局部感染神经元和约20个远距离投射神经元。在没有Cre的情况下很少检测到mCherry的泄漏表达（9.3±2.6个细胞；n个=6只动物），并且这些细胞仅在注射部位附近观察到(). 在缺乏Cre的情况下，未标记远程投射(). 这些结果表明，该系统也能有效地靶向细胞类型，并选择性地标记其在新皮层中的单突触连接。
狂犬病病毒标签直接输入PV+PV-Cre小鼠大脑皮层的细胞。将辅助病毒（AAV9-pEF1α-FLEX-GTB）和狂犬病病毒[（EnvA）SAD-ΔG-mCherry]注射到PV-Cre小鼠或WT对照动物的大脑皮层。mCherry信号是使用中的Redhot查找表可视化的B类. (A类)狂犬病病毒可以感染初级体感皮层的PV细胞及其逆行连接的伙伴。(B类)相反，狂犬病感染在WT动物中几乎完全没有。(C类和天)在PV-Cre小鼠的次级体感皮层中可以检测到逆行感染细胞(C类)但从未出现在WT动物身上(天). (E类)PV-Cre小鼠丘脑的逆行标记。丘脑核团VPm和Po可靠地检测到躯体和致密轴突终末，已知其投射到初级躯体感觉皮层的桶状野。轴突末端标记来自皮质丘脑投射细胞，这些细胞在A类. (F类)不出所料，WT动物的丘脑中没有mCherry信号。（比例尺：100μm）
讨论
我们证明，将Cre依赖性辅助病毒和EnvA伪型、G-缺失狂犬病病毒结合起来，可以有效地识别与Cre表达神经元的直接本地和远程连接。我们发现，Cre依赖性辅助病毒可用于将EnvA-ΔG狂犬病病毒感染靶向大脑中的特定细胞类型，狂犬病G以Cre依赖的方式表达后，狂犬病毒可从预定的细胞群逆行传播到其直接连接的伙伴。我们的发现也提供了有力的证据，证明在没有TVA的情况下，EnvA-ΔG狂犬病病毒不能在体内感染细胞，并且狂犬病在与狂犬病G互补时，病毒只会特异性地传播到已知的突触输入。
将这些方法用于在特定类型的神经元中选择性表达Cre重组酶的各种小鼠系，将有可能识别向任何相关小鼠系可用的细胞类型提供直接单突触输入的来源和细胞类型。然而，我们对PV-Cre细胞系中少量第5层锥体细胞的观察表明了使用这种电路追踪系统时的一个重要观点：标记特异性仅与进行实验的Cre小鼠细胞系一样紧密。由于Cre依赖性病毒可以将广泛不同水平的Cre重组酶表达转化为高水平的转基因表达，因此该系统可能无法完全重现其他小鼠系中Cre表达的先前特征。因此，有必要使用结果全面描述目标细胞类型及其输入。
虽然GFP不容易从FLEX-GTB辅助病毒中检测到，但我们已经证明该病毒在功能上同时表达TVA和狂犬病糖蛋白，使EnvA伪型病毒能够特异性感染Cre靶细胞并从其传播。然而，在辅助病毒的当前形式中，在某些系统中很难区分突触前连接的细胞和突触后起始群体。任何远离狂犬病病毒注射部位的标记神经元都必须进行突触前连接，但注射部位附近的细胞可能更难识别。使用TVA-only辅助病毒对Cre株进行特征描述，可以很好地了解最初将被感染的细胞的空间范围、大致数量和类型；然而，FLEX-GTB辅助病毒中缺乏功能性荧光团，因此无法定量确定突触后细胞的数量和局部连接细胞群的相对丰度。虽然这种辅助病毒缺乏GFP表达最初令人困惑，但多项研究也发现类似的结果，即通过C-末端2A元件与其他基因相连的荧光蛋白不能发出荧光(22,23). 这种差异可能在未来通过使用改进的2A元件来纠正(24)或者通过重新排序Cre-dependent盒中的基因。商用抗体目前无法特异识别TVA或狂犬病G，因此具有功能荧光团或抗体标签将在该系统的未来迭代中有用。
值得注意的是，逆行标记的神经元群代表了连接的完整补充。最近一篇使用同一株狂犬病病毒的论文表明，体内约50个细胞是从单个皮层神经元逆行感染的(25). 然而，我们的系统受益于这样一个事实，即我们从一个相对较大的突触后种群开始，甚至可以标记稀疏的连接。虽然狂犬病病毒具有广泛的神经亲合性，但将非假型狂犬病毒直接注射到感兴趣的大脑区域也有助于识别可被狂犬病感染的突触补体。
我们提出的双病毒系统通过阐明对各种大脑区域中已知细胞类型的直接输入，为理解大脑电路提供了强有力的手段，为构建神经元连接的电路级模型提供了灵活且通用的方法。此外，分子生物学、病毒学和遗传学的最新进展将使研究人员能够将其研究扩展到神经解剖学领域之外。由于狂犬病病毒本身是一种基因传递载体，因此可以操纵狂犬病基因组，使受感染的神经元表达本文所示荧光报告基因以外的基因。因为狂犬病病毒感染的细胞可以存活数周(10)将电路追踪与体内功能研究相结合是可能的。例如，通过将通道视紫红质直接输入到定义的细胞类型上，研究人员可以控制这个连接的神经元群体的活动，而不激活相邻的、未连接的神经元，从而可以更精确地分析直接突触输入在调节感兴趣细胞活动中的作用。使用全套基因工具来监测或操纵受感染的神经元(1)研究人员应该能够修改该系统，以在体内探测各种以前无法使用标准电生理技术回答的电路级问题。
材料和方法
所有使用活体动物的实验都是根据索尔克研究所机构动物护理和使用委员会批准的方案进行的。
AAV生产。
最初的AAV基因传递质粒（pAAV-FLEX-hGTB；#26196）由gene先生从头生成。我们通过从pAAV-FLEX-hGTB质粒中删除一个或多个元素，然后将双floxed基因盒亚克隆到现有载体pAAV-EF1α-double-flox-eYFP-WPRE中，生成了本研究中使用的EF1α启动子质粒（pAAV-EF1α-FLEX-GTB；Addgene#26197和pAAV-EF1α-FLUX-GT；#26198；Addgene）(26). 这些质粒使用FLEX双floxed序列，而不是以前工作中使用的DIO序列(11). 两种EF1α启动子AAV都是通过转染一个15 cm的HEK293T细胞板，然后对细胞进行冻融裂解和细胞内内容物的粗提取来分离的。基因组滴度均约为～108每毫升的基因组拷贝数。
狂犬病病毒生产。
EnvA伪型、G-缺失狂犬病病毒的产生方式与前面描述的类似(27). （EnvA）SAD-ΔG-mCherry的功能滴度为～2×1010通过感染表达TVA-的HEK293T细胞确定的每毫升感染单位。
动物手术和病毒注射参数。
L7-Cre系列(20)和PV-Cre小鼠(21)保持在C57BL/6背景下，并在动物2-6个月龄时选择进行实验。在所有实验中，年龄和性别匹配的C57BL/6小鼠被用作对照。为了将立体定向病毒注射入大脑，在异氟醚下短暂诱导小鼠，然后注射氯胺酮/噻嗪（100 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg噻嗪无菌盐水）以实现稳定麻醉。然后将这些小鼠安装在啮齿动物立体定向仪（David Kopf Instruments 900系列）中，并使用耳杆、咬杆和鼻夹进行头部固定。在头骨上方的皮肤上做一个小切口，以暴露前角、羊羔和所需的注射部位。使用三轴微操作器测量bregma和lambda的空间坐标。使用标准坐标，相对于这些地标计算注射位置。使用了以下注射坐标（给出的所有数值均与前角有关）：小脑（前后径，−5.88 mm；侧径，+0.75 mm；背腹径，-1.50 mm）；初级体感皮层的桶形区（前后，-0.75毫米；内侧晚，+3.00毫米；中央背，-1.50毫米）。在注射部位上方的颅骨上钻了一个小钻孔，露出了大脑。将拔出的玻璃吸管（尖端直径≈30μm）装入病毒，然后将其放入大脑中至适当的坐标。使用Picospritzer（General Valve）将病毒脉冲送入大脑。
以15–20 nL/min的速度将总共180 nL辅助病毒注射到大脑中，每脉冲约输送350 pL。为了防止病毒回流，注射完成后，将吸管留在大脑中5分钟。取下注射吸管后，将小鼠从立体定向仪中取出，并用伤口夹封闭切口。狂犬病病毒感染前，允许小鼠恢复3周。在这些实验中，注射狂犬病病毒的条件和注射量与最初注射AAV的条件和剂量相同。在灌注和组织处理之前，允许狂犬病病毒复制并传播7天。
组织处理和成像。
为了保存脑组织以便成像和随后的分析，用50 mL含有4%多聚甲醛的溶液在0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）中对小鼠进行心内灌注。灌注后，将大脑分离并转移到含有4%多聚甲醛和30%蔗糖的PBS固定后溶液中，然后在4°C的旋转摇床上培养过夜。
第二天，使用冷冻切片机制备40-50μm的冠状脑切片，并将组织分为四到六组，以便进行多次组织操作。未立即使用的组织组置于冷冻保存液中（PBS中30%的甘油和30%的乙二醇），并储存在−20°C。
按照标准方案对固定组织进行免疫染色。为了保存GFP信号，我们使用了一种鸡抗GFP的一级抗体（1:500；Aves Labs），并用Cy2-偶联的抗鸡二级抗体进行了扩增（Jackson ImmunoResearch）。为了保存mCherry信号，我们使用了抗DsRed的兔多克隆抗体（1:250；Clontech），并用Cy3-偶联的抗兔二级抗体进行扩增（Jackson ImmunoResearch）。为了标记细胞体，在冲洗掉任何二级抗体后，用10μM DAPI对组织染色10分钟。用鼠抗PV单克隆抗体（1:1000；Sigma-Aldrich）标记PV+新皮质中的细胞。
将免疫染色的组织贴在铬胶基质载玻片上，隔夜晾干。使用一系列乙醇和二甲苯浸泡步骤对组织进行脱水和脱脂。然后使用Krystalon（Harleco）安装介质和玻璃盖玻片盖玻片。图像是用改良的Olympus BX51显微镜采集的，该显微镜进行了全局γ调节以降低背景，并使用ImageJ（美国国立卫生研究院）进行了伪彩色处理。通过合并ImageJ中的颜色通道生成显示定量共定位的图像。仅使用DAPI表示底层大脑结构的图像被覆盖在Photoshop（Adobe Systems）中，DAPI作为底层。
致谢
我们感谢Karine Von Bochmann提供的技术援助，Karl Deisseroth博士（加利福尼亚州斯坦福大学）提供的用于带有EF1α启动子的病毒的DIO载体主干，John Young博士提供的有用建议，以及Takuma Mori博士（加利福尼亚拉荷亚索克研究所）提供的mCherry-expressing狂犬病病毒。N.R.W.是伯特和埃瑟尔·阿金斯基学者奖的获得者。这项工作得到了美国国立卫生研究院MH63912、EY10742、NS069464和人类前沿科学计划的支持。
工具书类
1Luo L，Callaway EM，Svoboda K。神经回路的遗传解剖。神经元。2008;57:634–660. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 2Petreanu L、Huber D、Sobczyk A、Svoboda K、Channelrhodopsin-2辅助的长程胼胝体投射回路映射。自然神经科学。2007;10：663–668。[公共医学][谷歌学者] 三。Braz JM、Rico B、Basbaum AI。通过Cre介导的转基因小鼠中小麦胚芽凝集素的诱导，对不同CNS回路进行跨神经元追踪。美国国家科学院程序。2002;99:15148–15153. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 4Maskos U、Kissa K、St Cloment C、Brólet P。绿色荧光蛋白的逆行跨突触转移允许转基因小鼠的神经回路的遗传图谱。美国国家科学院程序。2002;99:10120–10125. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5DeFalco J等。病毒辅助神经输入到下丘脑喂食中心的映射。科学。2001;291:2608–2613.[公共医学][谷歌学者] 6Gradinaru V等人。用于使光遗传学多样化和扩展的分子和细胞方法。单元格。2010;141：154–165。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7Enquist LW，Card JP。嗜神经病毒用于回路分析的最新进展。神经生物电流。2003;13:603–606.[公共医学][谷歌学者] 8LeVay S，Voigt T。小麦胚芽凝集素从猫的视觉皮层逆行跨神经元转运至视网膜。实验脑研究。1990;82:77–81.[公共医学][谷歌学者] 9Wickersham IR等。单个基因靶向神经元跨突触追踪的单突触限制。神经元。2007;53:639–647. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 10Wickersham IR、Finke S、Conzelmann KK、Callaway EM。缺失突变狂犬病病毒逆行神经元追踪。自然方法。2007;4:47–49. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Cardin JA等人。驾驶快速尖峰细胞会诱发伽玛节律并控制感官反应。自然。2009;459:663–667. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 12Kuhlman SJ、Huang ZJ。通过Cre激活的病毒基因表达对小鼠脑中特定神经元类型进行高分辨率标记和功能操作。公共科学图书馆一号。2008;三：e2005。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 13Atasoy D、Aponte Y、Su HH、Sternson SM。FLEX开关将视紫红质2靶向多种细胞类型，用于成像和远程电路映射。神经科学杂志。2008;28:7025–7030. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 14Madisen L等人。用于整个小鼠大脑的强大、高通量Cre报告和表征系统。自然神经科学。2010;13:133–140. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15龚S等。基于细菌人工染色体的中枢神经系统基因表达图谱。自然。2003;425:917–925.[公共医学][谷歌学者] 16Seidler B等人使用禽逆转录病毒载体在体内进行条件性体细胞基因表达和敲除的基于Cre-loxP的小鼠模型。美国国家科学院程序。2008;105:10137–10142. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 17De Felipe P、Izquierdo M.用于基因转移的三顺反子和四顺反子逆转录病毒载体。人类基因治疗。2000;11:1921–1931.[公共医学][谷歌学者] 18de Felipe P、Martín V、Cortés ML、Ryan M、Izquierdo M。使用口蹄疫病毒2A序列生成逆转录病毒载体用于基因治疗。基因疗法。1999年；6:198–208.[公共医学][谷歌学者] 19Etessami R等。G缺陷狂犬病病毒重组体的传播和致病特性：体外和体内研究。维罗尔将军。2000;81:2147–2153.[公共医学][谷歌学者] 20Barski JJ，Dethleffsen K，Meyer M.Cre重组酶在小脑浦肯野细胞中的表达。起源。2000;28:93–98.[公共医学][谷歌学者] 21Hippenmeyer S等。DRG神经元对ETS转录因子信号的反应中的发育开关。《公共科学图书馆·生物》。2005;三：e159。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 22Hasegawa K，Cowan AB，Nakatsuji N，Suemori H。转基因在人类胚胎干细胞中的高效多顺反子表达。干细胞。2007;25:1707–1712.[公共医学][谷歌学者] 23Lengler J、Holzmüller H、Salmons B、Günzburg WH、Renner M.FMDV-2A序列和蛋白质排列有助于CYP2B1-报告蛋白融合蛋白的功能。分析生物化学。2005;343:116–124.[公共医学][谷歌学者] 24唐伟，等。通过2A肽自我处理忠实表达多种蛋白质：一种操作脑回路的通用可靠方法。神经科学杂志。2009;29:8621–8629. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 25Marshel JH，Mori T，Nielsen KJ，Callaway EM。靶向单个神经元网络，用于体内基因表达和细胞标记。神经元。2010;67:562–574. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 26Tsai HC等。多巴胺能神经元的阶段性放电足以进行行为调节。科学。2009;324:1080–1084. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Wickersham IR、Sullivan HA、Seung HS。糖蛋白缺失狂犬病病毒的产生，用于神经元的单突触追踪和高水平基因表达。国家协议。2010;5:595–606.[公共医学][谷歌学者] 
