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神经生物老化。作者手稿；PMC 2012年12月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
神经生物老化。2011年12月；32（12）：2323。e27–2323.e40。
2010年7月31日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.neurobiolaging.2010.06.010
预防性维修识别码：项目经理2997923
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院219033
PMID：20674093

肌萎缩侧索硬化突变体FUS核定位序列及应激颗粒的诱导

Jozsef Gal公司,1 张嘉玉,1 大卫·M·昆特,1 翟建军,1 洪格佳,2 贾建航,1,2和朱海宁1,*
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摘要

据报道，FUS突变可导致一部分家族性肌萎缩侧索硬化症（ALS）病例。野生型FUS主要定位于神经元的细胞核，但ALS突变体部分定位于细胞质，并可形成内含物。关于FUS亚细胞定位的调节或ALS突变如何改变FUS功能，目前知之甚少。在这里，我们证明FUS的C末端32个氨基酸残基构成了一个有效的核定位序列（NLS），因为它将β-半乳糖苷酶（LacZ，116 kDa）靶向细胞核。NLS内ALS点突变或缺失导致FUS细胞质定位错误。此外，我们还鉴定了多聚A结合蛋白（PABP1），一种应激颗粒标记物，作为FUS的相互作用伙伴。PABP1形成了与突变FUS内含物共定位的大细胞质病灶。在存在野生型FUS的情况下，未观察到类似应力颗粒的此类病灶。此外，在功能上与应力颗粒相关的加工体与突变FUS内含物相邻，但不与之共存。我们的结果表明，FUS的C末端NLS中的ALS突变会损害FUS的核定位，并导致细胞质定位错误、包涵体形成和RNA代谢的潜在扰动。

关键词：ALS、FUS/TLS、核定位序列（NLS）、聚A结合蛋白1（PABP1）、应激颗粒、加工体、RNA代谢

介绍

肌萎缩侧索硬化症（ALS，也称为Lou Gehrig病）是一种进行性和致命的神经退行性疾病。肌萎缩侧索硬化症的一般症状是运动神经元失去神经支配而引发的肌肉无力和消瘦。大多数ALS病例为散发性，约10%为家族性。一些ALS基因已被鉴定为其突变可导致家族性ALS。首次发现铜/锌超氧化物歧化酶（SOD1）突变(Rosen等人，1993年)约占家庭病例的20%。最近，一种名为融合肉瘤/脂肪肉瘤易位RNA处理蛋白（FUS/TLS）的突变被发现可导致家族性6型ALS(Kwiatkowski等人，2009年,Vance等人，2009年). 此外，在散发性ALS病例中也有FUS突变的报道(Belzil等人，2009年,Corrado等人，2009年,Dejesus-Hernandez等人，2010年). 有趣的是，近年来在家族性ALS中也报道了另一种名为TAR DNA结合蛋白（TDP-43）的RNA代谢蛋白的突变(卡巴希等人，2008年,Sreedharan等人，2008年,Van Deerlin等人，2008年). 此外，在大部分家族性和散发性ALS病例中发现核周泛素化TDP-43蛋白病(Kwong等人，2007年,Mackenzie等人，2007年,Neumann等人，2006年). 虽然TDP-43在过去几年中得到了深入研究，但FUS在ALS中的作用基本上是未知的，这也是本研究的重点。

FUS是一种广泛表达的多域蛋白，属于RNA结合蛋白和EWS（尤因肉瘤）的FET家族(Bertolotti等人，1996年). 在神经元和胶质细胞中，FUS几乎只局限于细胞核(阿曼等人，1996年,Andersson等人，2008年). FUS参与快速的核质穿梭，在细胞核和细胞质中结合RNA，并可能在细胞核和胞质之间穿梭RNA(Zinszner等人，1997年). FUS蛋白也在神经元树突局部翻译的mRNA转运中发挥作用(Fujii等人，2005年,富士和Takumi，2005年). 此外，据报道，FUS还能结合单链和双链DNA(Baechtall等人，1999年)并在包括DNA修复在内的各种过程中发挥作用(Baechtall等人，1999年)同源DNA配对与细胞增殖(Bertrand等人，1999年)，转录调控(Prasad等人，1994年,Tan和Manley，2010年)和mRNA剪接(Yang等人，1998年).

退化运动神经元中的蛋白质内含物是ALS的特征(Piao等人，2003年). 在FUS突变引起的家族性ALS病例中，检测到FUS异常定位于细胞质和FUS阳性细胞质内含物(Belzil等人，2009年,Corrado等人，2009年,Kwiatkowski等人，2009年,Vance等人，2009年). 然而，这种改变定位的机制尚不清楚。因此，在本研究中，我们着手确定突变型FUS定位错误的潜在机制和潜在后果。

FUS亚细胞定位的调控尚不完全清楚。人类FUS蛋白的计算分子量为53426道尔顿，尽管它在SDS-PAGE中以约70 kDa的带迁移。通过核孔复合体的被动扩散截止值估计在40-60 kDa之间变化(Gerace，1995年,彼得斯，2009年,Route等人，2003年). 因此，FUS通过被动扩散迁移穿过核孔复合体在理论上是可能的，但可能很难。FUS中有一个预测的核出口序列（NES）(拉盖尔·图伦和克利夫兰，2009年)，其序列显示相似性，但与一致的NES序列不匹配。FUS中没有报道或预测经典核定位序列（NLS）。生物信息学尝试表明没有经典的可预测NLS（例如，位于的PredictNLS服务器http://cubic.bioc.columbia.edu/services/prefectNLS, (Cokol等人，2000年)). 然而，EWS中报告了一种潜在的NLS，它与FUS的C末端同源(Lee等人，2006年,Zakaryan和Gehring，2006年). 还需要注意的是，迄今为止发现的大多数FUS突变集中在蛋白质的C末端(Kwiatkowski等人，2009年,Vance等人，2009年). 因此，我们验证了FUS的C末端作为NLS在FUS的核定位中起关键作用的假设。

序列分析使我们首先测试了C-末端17残基，该残基含有几个带正电荷的残基，可能构成与之前序列不同的基序。17个残基的缺失导致了细胞质的严重定位错误和细胞质内含物的形成。17个残基与GFP的融合足以在细胞核中引起GFP的积累，然而，将17个残基标记到一个大蛋白β-半乳糖苷酶（LacZ）上，在将LacZ靶向细胞核方面效果甚微。我们的结果表明，C末端17残基对FUS核定位至关重要，但可能不足以作为有效的NLS发挥作用。基于最近发现的缺乏C末端32个残基的ALS截短突变FUS，我们测试并证明了32个残位片段在将LacZ靶向细胞核方面非常有效。此外，C末端片段中的ALS点突变显著削弱了其将LacZ和GFP靶向细胞核的能力。这些结果支持FUS的C末端确实在其核定位中起着关键作用。利用蛋白质组学技术，我们鉴定了应激颗粒成分，即聚a结合蛋白1（PABP1）作为FUS相互作用的伙伴。共聚焦显微镜分析表明，突变型FUS内含物与以PABP-1和TIA-1为标记的应激颗粒共定位，而在表达野生型FUS的细胞中未诱导应激颗粒。此外，突变FUS内含物与功能上与应力颗粒相关的加工体相邻，但不与之共存。

材料和方法

质粒构建

野生型（WT）或突变型FUS序列是使用pDEST53-WT FUS质粒（马萨诸塞大学医学院劳伦斯·J·海沃德博士慷慨捐赠）进行PCR扩增的。将扩增产物插入p3XFLAG-CMV10（Sigma）、pEGFP-C3（Clontech）和p5xMyc UAST(刘等，2007)向量使用Bgl公司II和千磅I位点或pEBG谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合载体(田中等人，1995年)使用巴姆HI和千磅I站点。FUS C末端片段K510-Y526、R495-Y526和R495-G509通过在GFP和LacZ载体的C末端插入双链寡核苷酸，融合到GFP和LacZ载体C末端Bgl公司II和千磅pEGFP-C1（Clontech）或Nhe公司我和Xho公司pHM829（Addgene Plasmid 20703）的I位点(索格和斯塔明格，1999年)使用QuikChange II位点导向突变试剂盒（Stratagene）将R518K、R521G和R521H突变导入LacZ-FUS（R495-Y526）构建物。

小鼠运动神经元原代培养

按照先前报道的方案，纯化并培养小鼠原代运动神经元(Gingras等人，2007年). 简单地说，脊髓是通过仔细解剖从胚胎第13天的小鼠中获得的。然后通过研磨分离脊髓细胞，并使用NycoPrep（Accurate Chemical）溶液梯度差速离心纯化运动神经元。然后将运动神经元置于聚赖氨酸处理过的玻璃盖玻片上，并在37°C、5%CO下孵育2在添加生长因子的培养基中。在第六天用脂质体转染细胞在体外（DIV6）并固定在DIV 10上用于共焦显微镜。

细胞培养和转染

将NSC34、N2A和HEK293细胞培养在补充有10%FBS和青霉素/链霉素的DMEM培养基（Invitrogen）中，在37°C的培养箱中，在5%的CO中培养2/如上所述95%空气(Strom等人，2008年). 使用脂质体转染试剂（Invitrogen）以6孔格式转染细胞。S2细胞在施耐德培养基中培养果蝇属含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的培养基（Invitrogen）。如前所述，使用标准方案进行转染和免疫染色(Liu等人，2007年).

核-胞质醇分馏

按照中所述进行核分馏(Vance等人，2009年). 简单地说，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗转染细胞，在PBS中重新悬浮，在1000 RCF下造粒，并在裂解缓冲液中重新悬浮（50 mM K-HEPES，pH 7.5，10 mM KCl，1.5 mM MgCl21 mM EDTA、1 mM EGTA、Sigma P-8340蛋白酶抑制剂混合物（1:1000稀释液和0.2 mM PMSF）。在室温下培养2分钟并在冰上培养10分钟后，将Triton-X100添加到悬浮液中，使其最终浓度达到0.5%。将悬浮液在冰上再孵育10分钟，并在13000RCF下沉淀1分钟。分别收集上清液和颗粒，用SDS负载缓冲液煮沸，分别用作细胞溶质和核部分。SOD1和组蛋白H4分别作为细胞溶质和核标记物。

蛋白质印迹

转染两天后制备细胞培养提取物。Western blotting中使用的主要抗体是抗肌动蛋白（Santa Cruz，sc-1616）、抗GFP（Santa Cruz，sc-8334）、抗GST（Santa Cruz，sc-459）、抗FUS（Santa Croz，sc-47711）、抗SOD1（Santa克鲁兹，sc-11407）、抗PABP1（Santa Curuz，sc-32318）和抗乙酰基-雌酮H4（Upstate 17-630）。使用ECL试剂（Pierce）观察蛋白质带。

荧光显微镜

将细胞培养并转染在无菌明胶涂布盖玻片上，并进行前面描述的荧光显微镜分析(Gal等人，2009年). 简言之，转染后48小时用PBS清洗细胞，并在37°C的PBS中用4%多聚甲醛固定15分钟。具有GFP荧光的细胞与PBS/0.1%Triton-X100中的4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，Invitrogen）孵育，然后用Vectashide固定介质（Vector Laboratories）固定在玻璃载玻片上。免疫荧光染色的细胞如上所述固定，用PBS/0.25%Triton-X100渗透，用10%BSA封闭PBS，用3%BSA/PBS稀释的一级抗体孵育。一级抗体为抗FLAG（Sigma F3165）、抗β-半乳糖苷酶（Promega Z3781）、抗PABP（Santa Cruz sc-32318）、，抗TIA-1（Santa Cruz sc-28237）和抗GE-1（Santa Cruz sc-8418）。随后用PBS洗涤载玻片，并与DAPI和Alexa Fluor 488抗小鼠（Invitrogen A21202）、Alexa Fluor 594抗小鼠（Invitrogen A21203）或Alexa Fluor 594抗兔（Invitrogen A11012）二级抗体在3%BSA/PBS中以1:400稀释孵育。然后用PBS清洗盖玻片，并使用Vectashide安装介质进行安装。荧光显微镜是使用徕卡SP5倒置共聚焦显微镜进行的，该显微镜具有63倍或100倍物镜。

使用ImageJ程序进行图像分析。使用随机选择的细胞的共焦显微图像对细胞核和细胞质中的荧光强度进行定量分析。对于每个单个细胞，通过追踪获得的DAPI通道图像来确定细胞核的边界。用GFP或LacZ免疫荧光图像同样追踪细胞边界。细胞质是上述定义的细胞核和细胞边界之间的区域。然后，ImageJ宏使用这些追踪区域计算细胞核（N）和细胞质（C）内像素的GFP或LacZ免疫荧光平均强度。从每组至少20个随机选择的细胞中计算这些平均强度的比率（N/C）。采用Student t检验进行统计分析。

将PABP1确定为FUS交互伙伴

将GST-FUS（WT和R521G）构建物转染到HEK293细胞中。转染后两天，在RIPA缓冲液（Millipore）中制备细胞裂解物，并使用先前发布的谷胱甘肽Sepharose 4B（GE Healthcare 17-0756-01）进行下拉(张等，2007). 洗脱的蛋白质通过SDS-PAGE进行解析，对感兴趣的单个凝胶切片进行胰蛋白酶消化。如前所述，使用QSTAR XL（应用生物系统）通过LC-MS/MS分析提取的肽混合物(Fukada等人，2004年). LC-MS/MS结果通过当地的Mascot服务器（Matrix Science）进行处理，以进行蛋白质鉴定。

结果

在培养细胞中重述FUS突变体的体内病理学

我们首先使用GFP标记的野生型和家族性ALS突变体FUS构建体测试了FUS突变体的病理细胞质定位是否在初级运动神经元中复制。选择R518K、R521G和R521H是因为它们是报告中更常见的突变(Kwiatkowski等人，2009年,Vance等人，2009年). 如所示图1A，除细胞核外，所有三个突变体在核周和轴突中都很明显，明显表明细胞质定位错误。相反，WT FUS定位于细胞核，几乎检测不到细胞质信号。

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家族性ALS突变FUS在原代运动神经元和N2A细胞中的细胞质定位错误

（A） ●●●●。转染GFP标记WT或突变FUS的小鼠胚胎初级运动神经元的共焦显微图像。ALS突变体R521G、R521H和R518K在细胞质中观察到部分定位，但WT FUS主要定位于细胞核。（B） ●●●●。转染GFP标记WT或突变FUS的N2A细胞的共焦显微图像。同样，观察到突变FUS的细胞质定位。此外，在表达突变FUS的细胞中也观察到内含物。（C） ●●●●。表达WT或突变FUS的细胞的细胞质和细胞核部分的Western blot。与WT FUS相比，细胞质组分中的突变FUS水平增加。对照细胞核FUS标准化的细胞质FUS相对丰度的定量显示为图底部的C/N值。使用核蛋白组蛋白4（H4）和细胞质蛋白超氧化物歧化酶1（SOD1）来证明组分的纯度。N2A细胞内源性FUS的Western blot结果表明，内源性WT FUS主要存在于细胞核部分，而细胞质部分也存在弱条带。所有比例尺均为10μm。

然后，我们测试了FUS突变体的病理细胞质定位错误和包涵体形成是否也在几个不同的细胞系中观察到，包括NSC34、N2A、HEK293和果蝇属S2电池。如所示图1B，突变体的细胞质定位错误在N2A小鼠神经母细胞瘤细胞中也很明显。转染N2A细胞的核-细胞溶质分馏表明，与WT蛋白相比，突变FUS蛋白分馏到细胞溶质中的量更高(图1C). 同时，内源性FUS几乎只在核组分中检测到。此外，在一些表达突变FUS的细胞中观察到细胞质内含物(图1B). 在运动神经元样NSC34细胞、HEK293细胞和果蝇属S2电池(补充图S1). 在一些NSC34和S2细胞中也观察到突变型FUS的内含物，但在HEK293细胞中更为突出。我们的结果表明，FUS家族性ALS突变体的病理特征可以在所测试的细胞培养系统中复制，包括初级运动神经元。

FUS序列分析

FUS是一种多域RNA结合蛋白(Bertolotti等人，1996年,拉盖尔·图伦和克利夫兰，2009年). 它包含一个富含Gln、Gly、Ser和Tyr残基的N末端结构域，然后是一个富含Gly的区域、一个RNA识别基序（RRM）结构域、两个由RanBP2型锌指分隔的富含Gly的区域和一个C末端结构域。富含Gly的区域包含多个嵌入的Arg-Gly基序，序列为“RG”、“RGG”或“RGGG”（在本研究中称为RGG基序）。

来自多种生物体的FUS的C末端区域的序列比对，果蝇属CaZ蛋白和几个与FUS密切相关的人类蛋白如图所示图2AFUS的C-末端17-残基片段与包含RGG基序的前一区域明显不同。C-末端17残基通过一个Gly-Pro-Gly序列从RGG基序中分离出来，该序列具有较高的转环倾向(Leszczynski和Rose，1986年,Rose等人，1985年). 因此，从结构角度来看，这个C末端片段可能是一个独立的基序。此外，大多数报道的FUS家族性ALS突变是聚集在C末端的点突变(图2A) (Kwiatkowski等人，2009年,Vance等人，2009年). 此外，据报道，EWS的C末端具有NLS的功能(Zakaryan和Gehring，2006年). 我们首先假设，尽管FUS中缺乏经典的NLS，但C末端17残基可能作为NLS或核保留序列（NRS）在FUS的核定位中发挥关键作用。

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C末端17残基对FUS的核定位至关重要

（A） ●●●●。多种生物FUS C末端区域的序列比对，果蝇属CaZ和几个与FUS密切相关的人类蛋白。X（X）：相同的残基；X（X）：保护性强；X（X）：较弱的保守性/相似性。▼ 表示已知家族性ALS突变的位置。标记了RG-丰富结构域、RGG15基序、C-末端17-残基序列（C17）和C-末端32-残基片段（C-32）。（B） ●●●●。转染GFP标记WT或C17缺失突变FUS的小鼠胚胎初级运动神经元的共焦显微图像。FUS-Δ17在核周、突起和细胞核中表达，而WT FUS主要定位于细胞核。（C） ●●●●。在N2A细胞中也观察到类似的FUS-Δ17细胞质定位。此外，在表达突变FUS的细胞中也观察到内含物。（D） ●●●●。表达WT FUS、R521G或Δ17突变体的细胞的细胞质和细胞核部分的Western blot。与WT FUS相比，细胞质组分中的突变FUS水平增加。相对于核FUS标准化的细胞质FUS相对丰度的量化如图底部的C/N值所示。H4和SOD1分别用作核标记和细胞质标记。（E） ●●●●。使用GFP标记的FUS或FLAG标记的FUS-的免疫荧光染色，在HEK293细胞中也观察到类似的细胞质定位和FUS-Δ17内含物。所有比例尺均为10μm。

FUS C末端17残基缺失的影响

为了研究FUS的C末端17残基在蛋白质核定位中的作用，我们生成了一个缺乏C末端17残留物的FUS截短突变体（FUS-Δ17）。17个残基的缺失显著改变了FUS蛋白的亚细胞定位。在初级运动神经元中，GFP标记的FUS-Δ17融合蛋白在轴突、核周和细胞核中都很明显(图2B). 在N2A细胞中，GFP标记的FUS-Δ17主要定位于细胞质或均匀分布于细胞核和细胞质(图2C). 此外，在许多转染细胞中可见GFP-FUS-Δ17内含物(图2C). 转染N2A细胞的分馏也表明FUS-Δ17定位于细胞质甚至比R521G突变体更大(图2D). 在HEK293细胞中也获得了类似的结果(图2E)和NSC34细胞(补充图S2). 为了消除GFP标签本身的潜在偶然效应，还产生并测试了3xFLAG标记的FUS-Δ17融合蛋白。抗-FLAG免疫荧光研究表明，在转染的HEK293细胞中，3xFLAG-FUS-Δ17的定位也主要是细胞质和内含物(图2E). 综上所述，结果表明FUS的C末端17残基在蛋白质的核定位中起着重要作用。

C-末端17残基对核定位的影响

我们将C端17个残基（K510-Y526）融合到增强型GFP（GFP-C17）的C端，并测试其对GFP定位的影响。GFP-C17蛋白在HEK293细胞核和细胞质中的分布几乎相同，而在细胞核中明显积聚(图3A). 我们还在全长FUS（GFP-C17-R521G）中对应R521G突变的C末端C17残基中产生了一个突变。R521G突变严重损害了FUS的C末端17残基驱动GFP核积累的能力(图3A). 通过测量核/细胞质荧光强度比（N/C）对结果进行量化。如所示图3BGFP-C17蛋白的N/C比（2.94）是GFP对照蛋白（1.24）的两倍多。与GFP-C17相比，R521G突变显著降低了GFP-C17-R521G蛋白的N/C比率（1.49）。统计分析表明，上述两对的差异具有统计学意义（p＜10-6). 结果清楚地支持了C末端17残基可以促进GFP的核积累，而片段中的R521G突变可以削弱核积累。

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C-末端17残基对GFP和LacZ核定位的影响

（A） ●●●●。转染GFP载体控制、GFP-C17或GFP-C17-R521G的HEK293细胞的共焦图像。将FUS的C末端17残基标记为GFP可导致GFP-C17在细胞核内大量积累。C-17片段内的ALS突变R521G导致GFP-C17-R521在整个细胞中几乎均匀分布。（B） ●●●●。从至少20个随机选择的细胞中量化细胞核和细胞质荧光强度（N/C）的平均比值，见材料和方法。（C） ●●●●。单独转染LacZ（无标记）、LacZ-SV40或LacZ-C17的HEK293细胞的共焦图像。用SV40大T抗原的NLS标记LacZ，导致LacZ-SV40显著重定位到细胞核。相反，LacZ-C17主要留在细胞质中，细胞核荧光相对较弱。（D） ●●●●。核和细胞质荧光强度作为N/C比率的量化。与无标记的LacZ相比，C-末端17残基导致LacZ-C17的N/C比率轻微但具有统计学意义的增加。SEM作为误差线进行计算，并进行Student t检验，以获得（B）和（D）中的p值。*，p<0.0001；**，p<10-6。所有比例尺均为10μm。

这组实验的一个警告是GFP的分子量低于30kDa，它可以通过被动扩散进入原子核(彼得斯，2009年,索格和斯塔明格，1999年)与GFP定位于细胞核和细胞质的观察结果一致(图3A). 为了克服这一警告，我们选择了分子量为116kDa的细菌β-半乳糖苷酶（LacZ）来进一步评估C末端17残基的影响。当在哺乳动物细胞中表达时，LacZ是一种细胞质蛋白，如果它被NLS标记，则可以导入细胞核(Sorg和Stamminger，1999年). 我们将FUS的C末端17残基融合到LacZ的C末端（LacZ-C17）。我们还用众所周知的SV40大T抗原NLS（PKKKRKV）生成了阳性对照构建物(Kalderon等人，1984年)融合到LacZ的C末端（LacZ-SV40）。

免疫荧光显微镜检查的LacZ蛋白的亚细胞定位如所示图3C未标记的LacZ主要位于细胞质中，LacZ-SV40蛋白主要位于细胞核中，分别作为阴性和阳性对照。令人惊讶的是，FUS的C末端17残基在将LacZ靶向细胞核方面不如SV40大T抗原NLS有效(图3C). 仔细量化（参见图3D)核/细胞溶质荧光强度比显示，与未标记的LacZ（0.36）相比，LacZ-C17蛋白的N/C比（0.49）略有增加，但具有统计学意义（p<0.0001）。将LacZ-SV40与LacZ对照或LacZ-C17进行比较的p值小于10-6(图3D). 中的结果图2和​和3三共同表明，尽管FUS的C末端17残基对FUS蛋白的核定位至关重要，但该片段不是有效的NLS。

FUS的C末端32残基对LacZ定位的影响

根据上述结果，我们推测FUS的C末端的较大片段可能作为一个更胜任的NLS发挥作用。基于最近在家族性ALS患者中发现的R495X无义突变（缺少残基R495-Y526）（与劳伦斯·海沃德博士的个人交流），我们测试了C末端32残基是否可以作为NLS发挥作用。图4A显示了典型的共焦图像和图4B显示了对所检查的不同LacZ结构的N/C比率的定量分析。FUS的C端32个残基融合到LacZ的C端（LacZ-C32）。当在HEK293细胞中表达时，LacZ-C32蛋白显著重定位到细胞核（p<10-6). 在C32片段中引入R518K、R521G和R521H ALS单点突变均导致LacZ-C32的核定位显著降低（p<10-6). 值得注意的是，R521G突变在所测试的三个点突变中导致LacZ-C32的核定位降低最为显著。由于C-末端17残基不能作为有效的NLS，我们进一步测试了C-末端32残基的第一个15-残基片段是否单独作为NLS。我们将15个残基RGG基序（R495-G509）融合到LacZ的C末端（LacZ-RGG15）。LacZ-RGG15主要局限于细胞质中，与未标记的LacZ无法区分(图4A)表明RGG15基序本身不是NLS。综上所述，我们的结果表明FUS的C末端32残基可以作为一个强有力的核定位序列。

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C末端32个残基是一种有效的核定位序列（NLS）

（A） ●●●●。转染LacZ（无标记）、LacZ-C32、LacZ-C32-R521G、LacZ-C32-R518K、LacZ-C32-R5121H或LacZ-RGG15的HEK293细胞的共焦图像。LacZ-C32在细胞核内高度富集。C-32序列中的ALS突变（R521G、R518K或R521H）都增加了融合蛋白的细胞质定位。R521G突变导致LacZ-C32-R521G在细胞质和细胞核之间的分布近似均匀，而LacZ-C32-R518K或LacZC32-R521H的细胞质荧光强度较弱。（B） ●●●●。将细胞核和细胞质荧光强度量化为N/C比率。C-末端32残基在提高N/C比方面非常有效。所有三种ALS突变均导致N/C比率显著下降，其中R521G的下降幅度最大。与无标记的LacZ相比，将RGG15基序标记为LacZ不会导致N/C比率发生显著变化。误差条代表SEM，并使用Student t检验计算p值。**，p<10-6所有比例尺均为10μm。

突变FUS的细胞质内含物与应激颗粒共定位

为了更好地理解WT和突变FUS的差异功能，我们使用基于质谱的蛋白质组学方法来识别FUS相互作用的伙伴。我们为GST标记的WT和R521G FUS构建了哺乳动物表达结构，并进行了GST下拉实验，如前所述(张等，2007). 多聚A结合蛋白1（PABP1）被鉴定为WT和R521G FUS的相互作用伴侣之一。串联MS/MS识别的序列在图5AMASCOT分数为398也支持高置信度识别。此外，通过GST下拉和PABP1 Western blot验证了PABP1和FUS之间的相互作用。如所示图5B内源性PABP1与WT和R521G FUS（通道1和2）共沉淀，但不与GST控制（通道3）共沉淀。

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家族性ALS突变体FUS与应激颗粒共定位

（A） ●●●●。通过LC-MS/MS鉴定GST-FUS下拉样品中的聚腺苷酸结合蛋白1（PABP-1）。通过串联质谱（MS/MS）鉴定的PABP-1中的胰蛋白酶肽显示为红色。MASCOT评分为398，表明该鉴定具有高置信度。（B） ●●●●。GST载体对照、GST-WT-FUS或GST-R521G-FUS转染HEK293细胞。GST下拉样品进行PABP-1 Western blot。PABP-1与GST-FUS共沉淀，但不与GST载体控制共沉淀。（C） ●●●●。从转染GFP载体控制、GFP-WT-FUS、GFP-R521G-FUS或GFP-FUS-Δ32的HEK293细胞获得GFP、PABP-1免疫荧光和DAPI的共聚焦图像。在转染GFP载体或WT FUS的细胞中，PABP-1在细胞质中呈弥散点状分布。在表达R521G或C32缺失突变FUS的细胞中，PABP-1形成类似应激颗粒的大细胞质病灶。应力颗粒与突变FUS内含物共定位。（D） ●●●●。从转染GFP载体控制、GFP-WT-FUS、GFP-R521G-FUS或GFP-FUS-Δ32的HEK293细胞获得GFP、GE-1免疫荧光和DAPI的共焦图像。加工体标记GE-1与突变体FUS的细胞质内含物相邻，但不与之共定位。

据报道，PABP1蛋白是应激颗粒的一种成分(Kedersha等人，2007年,Kedersha等人，1999年)，沉默的mRNA群体在翻译不活跃的48S核糖体复合体中保持的细胞质结构(安德森和凯德莎，2008年). PABP1也在mRNA代谢、翻译起始调节和翻译偶联mRNA转换的调节过程中发挥作用(Mangus等人，2003年). 我们假设含有错误定位突变FUS的细胞质内含物可能促进应激颗粒的形成和干扰翻译调控，这可能有助于ALS的发病机制。

为了验证这一假设，我们检测了转染GFP载体GFP-WT-FUS、GFP-R521G-FUS或GFP-FUS-Δ32的HEK293细胞和未转染对照细胞中PABP1的亚细胞定位。在未转染的细胞和转染GFP载体控制或GFP-WT-FUS的细胞中，抗PABP1免疫荧光显微镜显示在细胞质中有分散的点状模式，这是文献中描述的典型的PABP-1分布(Kedersha等人，1999年) (图5C). 相反，在表达GFP-R521G-FUS或GFP-FUS-Δ32的细胞中，PABP-1形成了大的细胞质病灶，与突变的FUS内含物共存。这些病灶表现为高度聚集的PABP-1阳性斑点，类似应激颗粒(Kedersha等人，2007年,Kedersha等人，1999年). 在表达WT-FUS的细胞中未观察到此类细胞质焦点/应激颗粒。

我们进一步检测了FUS和另一个应激颗粒标记物TIA-1的共同定位(Anderson和Kedersha，2008年,Kedersha等人，2002年). 同样，在转染GFP-WT-FUS的HEK293细胞中，TIA-1阳性点状物均匀分布在细胞质中，但可以清楚地观察到TIA-1的阳性颗粒，并与GFP-R521G-FUS内含物共定位(补充图S3).

为了消除突变FUS内含物偶然与应力颗粒共定位的可能性，进行了阴性对照实验，以测试突变FUS包含物是否与加工体标记GE-1共定位(安德森和凯德莎，2008年). 如所示图5D无论FUS（WT或突变体）是否过度表达，处理体在细胞中都很明显。当FUS-R521G点突变体和FUS-Δ32截断突变体形成细胞质内含物时，加工体与内含物相邻但不共存。结果表明，突变FUS内含物和胁迫颗粒标记的共定位不是非特异性的。综上所述，这些结果表明ALS突变体FUS的细胞质定位错误和内含物形成可能导致应激颗粒的形成，进而干扰RNA代谢和翻译调控。

讨论

自首次报告6型家族性ALS患者FUS/TLS突变以来(Kwiatkowski等人，2009年,Vance等人，2009年)在散发的ALS病例中也发现了FUS病理学(Belzil等人，2009年,Corrado等人，2009年)额颞叶变性(Neumann等人，2009年,Seelaar等人，2009年). 此外，在家族性ALS组织中发现突变FUS蛋白的细胞质定位错误和包涵体形成(Belzil等人，2009年,Corrado等人，2009年,Kwiatkowski等人，2009年,Vance等人，2009年). 我们首先证明了FUS突变体的分子病理学可以在细胞培养模型中重现。当突变体FUS在初级运动神经元和四种细胞系中表达时，在所有五种细胞培养物中都观察到突变体FU的细胞质定位增加，并且在四种细胞株中观察到不同程度的包涵体形成(图1和S1（第一阶段）). 与细胞系相比，外源性FUS的表达水平相对较低，可能导致初级运动神经元缺乏明显的细胞质内含物。使用细胞培养模型，我们在本研究中努力了解WT FUS如何定位于细胞核，ALS突变如何干扰这一过程，以及突变FUS内含物如何破坏其他细胞过程。

对多种生物FUS的C末端区域的序列分析表明，C末端17残基可能起NLS的作用(图2A). 17个残基的缺失导致截短蛋白显著重定位到细胞质并形成细胞质内含物(图2和S2系列). 将FUS的17个残基附加到GFP的C末端导致了GFP-C17的显著核积累(图3A和3B)但将17个残基附加到较大的蛋白质LacZ上只会导致LacZ-C17的最小核重定位(图3C和3D). 结果表明，尽管C末端17残基对FUS的核定位至关重要，但仅此片段不足以将LacZ等大蛋白靶向细胞核。C末端17残基可能是需要额外序列的NLS的一部分，因此其本身表现为非常弱的NLS。或者，该段可通过作为NRS发挥作用，促进FUS的核保留(Kim等人，2007年,Nakielny和Dreyfuss，1996年).

为了确定FUS的C末端较长序列是否可以作为有效的NLS发挥作用，我们选择测试最近在家族性ALS患者中发现的R495X突变中缺失的C末端32残基。中的结果图4强烈建议，无论是15残基RGG基序还是C末端17残基片段都不足以确保核定位。相反，整个32位C末端基序是一个高效的NLS。NLS中的突变（点突变或缺失）可以显著降低蛋白质的核定位。由于FUS中的NLS避开了由导入蛋白α或β介导的经典NLS的预测算法，它很可能通过非经典机制发挥作用，可能涉及称为核导入蛋白-β2的核导入蛋白(Bonifaci等人，1997年,Lee等人，2006年,Pollard等人，1996年).

我们的发现是FUS的C末端17残基促进了GFP的核积累，但LacZ的核积累不起作用，这让我们想起了早期关于FET家族成员EWS的NLS的报告(Zakaryan和Gehring，2006年). 研究表明，EWS 18个残基的C末端基序将YFP蛋白重定向到细胞核，但对更大的GST-YFP双标记蛋白的作用却不一致(Zakaryan和Gehring，2006年). FUS和EWS蛋白密切相关，我们的序列比对表明EWS在C末端18个残基之前还包含RGG重复基序(图2A). 我们预计，RGG基序与EWS中的C末端18残基一起也将作为一种持续有效的NLS发挥作用。FUS和EWS之间的序列相似性增强了这样一个概念，即包括RGG基序在内的整个C末端片段对于确保蛋白质的核定位至关重要。

有趣的是，据我们所知，在15-残基RGG基序中没有发现ALS突变，而C-末端17-残基片段中填充了ALS突变。我们假设，尽管15-残基RGG基序对FUS的核定位很重要，但它可能比C-末端17残基更能耐受错义突变，因为FUS序列中存在额外的RGG重复序列。

值得注意的是，R518K、R521G和R521H这三个点突变对LacZ-C32的核定位有不同程度的损害(图4). R521G突变引起LacZ-C32的N/C比的最剧烈的降低。由于Arg、Lys和His在生理pH下均带正电荷，因此与用Lys或His取代Arg相比，用Gly取代Arg明显更显著。这为R521G在三种突变中损害核定位最严重的观察提供了可能的理由。此外，17例携带R521G突变的家族性ALS患者的平均生存期为24.0至28.3个月。携带R521H突变的3名患者的平均生存期为54.1个月(Kwiatkowski等人，2009年). 这表明R521G可能产生更严重的表型。此外，据报道，缺乏NLS的FUS-Δ32截短突变体与严重的早发性临床表型有关（与Lawrence Hayward博士的个人交流）。这与FUS-Δ32突变体的细胞质微定位程度较高有关。鉴于突变型FUS介导的家族性ALS患者几乎没有可用的临床数据，上述相关性可能为时过早。需要更多的机制研究和临床数据，以更好地了解人类患者突变与其临床表现之间的关系。

据报道，FUS蛋白在热休克和氧化应激时会重新定位为应激颗粒(Andersson等人，2008年). 应激颗粒是在非活性48S核糖体复合体中含有翻译沉默mRNA的细胞质结构(安德森和凯德莎，2008年). 我们利用蛋白质组学方法独立鉴定了聚A结合蛋白1（PABP1），它是一种应激颗粒标记物，是FUS相互作用的伙伴(图5A)并对其进行了验证(图5B). 共聚焦显微镜分析表明，PABP1阳性应激颗粒与突变FUS的细胞质内含物共定位，而在表达WT FUS的细胞中，PABP-1分散在细胞质中(图5C). 当我们使用另一种应激颗粒标记物TIA-1时，也获得了类似的结果(图S3). 此外，突变FUS内含物与加工体相邻，但不与加工体共定位，这表明应力颗粒与突变FUS包含物共定位并非偶然。结果表明，在没有额外刺激的情况下，突变FUS单独可以诱导应激颗粒。应力颗粒和加工体通常彼此相邻且功能相关(安德森和凯德莎，2008年,Kedersha等人，2005年). 因此，对邻近加工体的观察表明，突变FUS诱导的应激颗粒可能与功能相关。

TDP-43和FUS突变体引起的病理学相似。虽然这两种蛋白质没有紧密联系，但它们共享相似的序列元素，如RRM结构域和富含甘氨酸的区域，这是RNA/DNA结合蛋白质的共同点(拉盖尔·图伦和克利夫兰，2009年). 与FUS类似，据报道TDP-43在RNA转录、剪接和转运中发挥作用(Buratti和Baralle，2008年,Volkening等人，2009年). 这两种蛋白通常在神经元中大多为核蛋白，在ALS中的分子特征包括它们在细胞质中的定位错误和蛋白内含物的形成(Arai等人，2006年,Kwiatkowski等人，2009年,Kwong等人，2007年,Neumann等人，2006年,Sreedharan等人，2008年,Vance等人，2009年). 最近有报道称TDP-43定位于称为应激颗粒的细胞质病灶(Andersson等人，2008年,科伦布里塔等人，2009年,Moisse等人，2009年,Volkening等人，2009年)，类似于本研究中的突变FUS(图5). 应激颗粒代表了一种潜在的保护机制，以应对各种侮辱。当应激颗粒形成时，除某些必需转录物外，大多数mRNA在翻译失活的48S核糖体复合体中保持沉默(安德森和凯德莎，2008年). 我们的结果表明，在没有热休克或氧化应激诱导的情况下，仅突变FUS就可以诱导应激颗粒(图5和第3章). 上述证据支持了一种新的假说，即RNA代谢和加工的改变可能在许多家族性、可能是散发性ALS中起着中心作用(拉盖尔·图伦和克利夫兰，2009年,2010年强大). 未来的研究将确定应激颗粒形成和翻译控制受损在ALS发病机制中可能发挥的作用。

本研究将FUS的C末端确定为功能性NLS，这表明大多数报道的家族性ALS FUS突变体细胞质定位错误的主要原因是NLS受损或缺失。突变体FUS也能诱导应激颗粒。然而，还需要更多的研究来确定FUS的ALS突变体是否由于功能丧失或毒性获得机制而导致疾病。目前看来，这两种假设都是可能的。虽然R521G突变体保留了与含有GGUG基序的RNA结合的能力(Kwiatkowski等人，2009年,Lerga等人，2001年)，减少核定位可能会损害FUS通常在核内参与的基本过程，从而提供可能的“功能丧失”机制。同时，突变FUS的细胞质积累导致TIA-1和PABP1阳性颗粒异常聚集。应激颗粒的改变可能导致RNA加工异常，干扰或可能抑制RNA翻译，从而提供可能的“功能丧失”机制。最近对TDP-43的研究表明，在细胞培养和斑马鱼模型中，功能的获得和丧失都可能导致ALS相关TDP-43突变体的毒性(卡巴希等人，2010年). 最近报道了几种TDP-43动物模型(Hanson等人，2010年,卡巴希等人，2010年,李等，2010,Wegorzewska等人，2009年,Wils等人，2010年)而FUS动物模型尚待开发。需要更多的研究来描述FUS突变体的功能丧失或获得，并确定FUS突变如何导致家族性ALS。

补充材料

01

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鸣谢

我们非常感谢劳伦斯·海沃德博士提供的野生型FUS质粒。我们感谢Edward Kasarskis博士和王庆军博士的有益讨论和阅读手稿。这项工作得到了美国国立卫生研究院对HZ的R01NS049126和R21AG032567拨款的部分支持。感谢国家研究资源中心资助的人类疾病分子基础生物医学卓越研究中心（COBRE，P20RR020171）的支持。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

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