CD4细胞⁺T细胞参与癌基因失活后持续肿瘤消退所需的微环境重塑

免疫系统不需要诱导增殖停止或细胞凋亡

之前，我们已经证明MYC公司TALL转基因模型失活后，肿瘤细胞发生增殖停滞和凋亡(费尔谢尔和毕晓普，1999年). 我们确定了免疫细胞参与肿瘤消退过程的机制是否是通过前后对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响MYC公司灭活(图2A、B). 4天后MYC公司失活后，来自野生型和免疫缺陷宿主的肿瘤表现出多形性特征的全面丧失，这表现在两组中细胞大小和核质比的显著降低。重要的是MYC公司灭活后，我们观察到每个场的细胞总数发生了显著变化，并在TUNEL和Ki67染色的定量中仔细控制了这些变化。

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图2

免疫系统不影响MYC公司灭活

2（A）：苏木精和伊红染色显微照片(左侧面板)、隧道(中间面板)和Ki67(右侧面板)未经治疗的肿瘤的免疫染色(MYC公司在）、两天和四天dox治疗的小鼠(MYC公司关闭）来自WT(顶部面板)RAG2系列^−/−(中间面板)和CD4^−/−(底部面板)主机。比例尺=100μm。2（B）：Ki67的定量表示(顶部面板)和TUNEL(底部面板)免疫染色如2（A）所示，持续0、2和4dMYC公司灭活。TUNEL和Ki67免疫染色的定量表示为肿瘤内TUNEL阳性细胞的平均百分比和Ki67阳性区域的面积。三种不同肿瘤的至少五个不同区域注射至少两种不同的肿瘤细胞系，以适应不同的情况。显示了统计显著性（通过未配对学生t检验评估的p值）。*p<0.01，**p<0.001，**p<0.0001。误差线表示为+/-SEM。

采用TUNEL染色检测细胞凋亡。细胞凋亡在MYC公司失活与宿主免疫状态无关(图2A)这表明，无论是否存在免疫系统，初始肿瘤退化都会发生类似的情况。TUNEL染色定量显示MYC公司WT宿主肿瘤的失活(图2B，重量MYC公司在与关闭，p=0.05）。此外，WT宿主退化肿瘤中的凋亡与RAG2中退化肿瘤的凋亡没有显著差异^−/−或CD4^−/−主机(图2B，重量与RAG2系列^−/−，CD4^−/− MYC公司关闭，p=0.3和0.3）。最后，细胞凋亡水平在MYC公司RAG2失活^−/−或CD4^−/−主机(图2B、RAG2^−/−，CD4^−/− MYC公司在与关闭，p=0.07和0.09）。因此，免疫系统的缺失可能会轻微增加，但肯定不会阻止肿瘤细胞在MYC公司灭活。

接下来，细胞增殖的变化MYC公司Ki67染色检测失活情况。MYC公司WT和免疫缺陷宿主肿瘤的失活导致Ki67染色显著降低(图2A、B、重量、RAG2^−/−，CD4^−/− MYC公司在与MYC相比关闭，p<0.01）。有趣的是，与WT主机RAG2相比^−/−但不是CD4^−/−宿主的Ki67染色在MYC公司失活（WT与RAG2系列^−/−或CD4^−/− MYC公司关闭，分别为p=0.02或p<0.05）。因此，宿主免疫系统的缺失要么没有影响，要么会适度增强MYC公司诱导增殖停滞的失活。

免疫系统需要诱导细胞衰老和血管生成的停止

我们已经报告了MYC公司失活肿瘤细胞发生细胞衰老(Wu等人，2007年)以及血管生成的停止(Giuriato等人，2006年). 我们研究了这两个过程的作用。WT宿主的肿瘤表达了20倍的衰老相关酸性β-gal（SA-β-gal）活性MYC公司失活后，衰老相关标记p16INK4a和p21分别增加26倍和6倍MYC公司灭活(图3A、B). 相反，MYC公司RAG2中肿瘤的失活^−/−和CD4^−/−小鼠没有导致SA-β-Gal增加或p16INK4a或p21的诱导(图3A、B，重量与RAG2系列^−/− MYC公司非SA-β-Gal，p=0.01，p16染色p=0.002，p21染色p=0.01；重量与CD4细胞^−/−,MYC公司非SA-β-Gal，p=0.009，p16染色，p=0.005，p21染色，p=0.004). 因此，在免疫缺陷小鼠中，MYC公司失活被阻止诱导肿瘤细胞衰老。值得注意的是，CD4⁺似乎需要T细胞。

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图3

诱导细胞衰老需要一个完整的免疫系统MYC公司灭活

3（A)衰老相关β-半乳糖苷酶（SAβ-gal，左侧面板)，第16页(中间面板)和第21页(右侧面板)未经治疗的肿瘤的免疫染色(MYC公司治疗2天和4天(MYC公司Off）指定基因型的小鼠。比例尺=100μm.3（B）：SA-β-gal的定量(顶部面板)，第16页(中间面板)和第21页(底部面板)3（A）中显示的染色时间分别为0、2和4天MYC公司灭活。量化表示为肿瘤内阳性染色区域的平均百分比。针对每种不同情况，对三种不同肿瘤的至少五个不同区域注射至少两种不同的肿瘤细胞系进行分析。显示了统计显著性（通过未配对学生t检验评估的p值）。*p<0.01，**p<0.001，**p<0.0001。误差线为+/-SEM。

我们确定是否需要完整的免疫系统MYC公司失活诱导与TSP-1（一种有效的抗血管生成蛋白）分泌相关的血管生成关闭(Giuriato等人，2006年;Kazerounian等人，2008年;劳勒，2000). 于MYC公司TSP-1在WT宿主肿瘤中的诱导作用是RAG2的3.5倍^−/−或CD4^−/−主机(图4A，重量与RAG2系列^−/−，CD4^−/− MYC公司关闭，p=0.001）。此外，虽然WT小鼠肿瘤的平均血管密度（MVD）经CD31染色测定变化很小MYC公司灭活(图4B)、RAG2^−/−和CD4^−/−小鼠的肿瘤MVD分别增加了5倍和12倍MYC公司灭活(图4A、B、RAG2^−/− MYC公司在与关闭，p<0.0001；CD4细胞^−/− MYC公司在与关闭，p=0.07）。因此，CD4的缺失⁺T细胞损害MYC公司失活诱导细胞衰老并阻断血管生成。

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图4

需要一个完整的免疫系统来抑制血管生成MYC公司灭活

4（A）：TSP-1的显微照片(左侧面板)和CD31(右侧面板)未经治疗肿瘤的免疫组织化学和免疫荧光染色(MYC公司On）和4天dox治疗(MYC公司Off）指定基因型的小鼠。比例尺=100μm。4（B）：TSP-1的量化(顶部面板)和CD31(底部面板)染色如4（A）所示。量化表示为肿瘤内阳性染色区域的平均百分比。针对每种不同情况，对两种不同肿瘤的至少五个不同区域进行分析。显示了统计显著性（通过未配对学生t检验评估的p值）。*p<0.01，**p<0.001，**p<0.0001。误差条为+/-SEM。另请参阅图S2

最后，TSP-1的表达需要宿主免疫细胞和特异性CD4⁺T细胞。事实上，我们发现免疫功能受损的脾脏中TSP-1蛋白表达显著降低与野生型宿主(图S2A). 此外，我们发现活化的CD4⁺T细胞表达TSP-1(图S2B).

CD4细胞⁺T细胞是肿瘤的家园，足以恢复持续的肿瘤消退

我们检查了CD4⁺癌基因失活后，T细胞回到肿瘤部位。在采用转移到RAG2时^−/−宿主，荧光素酶⁺CD4细胞⁺T细胞在MYC公司通过生物发光成像观察这些肿瘤前后的失活MYC公司失活(图5A). 该癌基因失活导致CD4⁺癌基因失活后4天，T细胞定位于肿瘤部位，12天达到峰值，3周后持续存在MYC公司灭活。因此，MYC公司失活与CD4的贩运有关⁺T细胞转移到肿瘤受累部位。值得注意的是，CD4⁺T细胞缺失荧光素酶⁺脾细胞也定位于肿瘤部位MYC公司失活，表明补充了额外的宿主免疫效应群(图S3A).

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图5

CD4细胞⁺T细胞是肿瘤的宿主，并且在MYC公司灭活

5（A）：荧光素酶的生物发光信号⁺CD4细胞⁺肿瘤微环境的宿主T细胞。RAG2系列^−/−用荧光素酶重组小鼠⁺CD4细胞⁺重建后8天皮下注射T细胞和未标记的肿瘤细胞系。MYC公司当肿瘤生长到1000毫米时被灭活^三数据表示为生物发光信号（平均辐射度）随时间变化MYC公司失活（n=3）。5（B）：生物发光成像测量肿瘤消退和复发动力学。RAG2系列^−/−用CD4重组小鼠⁺（RAG2^−/−重建。CD4细胞⁺T细胞，n=5）或CD8⁺（RAG2^−/−重建。CD8（CD8）⁺T细胞，n=6）WT小鼠的T细胞。重组后8天，荧光素酶⁺皮下注射肿瘤细胞株。MYC公司当所有宿主中的肿瘤达到可比较的生物发光信号时被灭活。数据以生物发光信号（平均辐射度）的形式表示MYC公司灭活。重量（n=3）和RAG2^−/−（n=3）只小鼠作为阳性和阴性对照。5（C）：量化最小残留疾病。根据基因型绘制肿瘤在最大回归状态下的生物发光信号。显示了统计显著性（通过未配对学生t检验评估的p值）。*p<0.01，**p<0.001，**p<0.0001。误差线为+/-SEM。5（D）：重组RAG2无瘤生存率的Kaplan-Meier曲线^−/−、RAG2^−/−和WT小鼠。采用对数秩和检验比较存活曲线。数据代表了3个实验。统计包括所有数据：n=14，用CD8重建RAG⁺T细胞：n=12。重建=用重新配制。另请参见图S3.

接下来，我们评估了是否可以恢复MYC公司通过过继性转移特异性淋巴细胞群至RAG2，灭活免疫功能以诱导免疫受损宿主的持续肿瘤消退^−/−老鼠。通过FACS分析，我们确认了效应细胞的重建(图S3B). 如预期，RAG2^−/−用脾淋巴细胞过继转移的小鼠表现出持续衰退(图6B). RAG2系列^−/−宿主在之后表现出大量MRDMYC公司与WT主机相比失活(图5B、C、RAG2^−/− 与重量，p=0.007）。用原始CD8重组免疫缺陷宿主⁺T细胞继续具有显著的MRD负担(图5C、RAG2^−/−CD8（CD8）⁺ 与WT，p=0.03），而RAG2的重建^−/−带有原始CD4的宿主⁺T细胞完全消除了MRD，与WT宿主相似MYC公司灭活(图5C、RAG2^−/−CD4细胞⁺ 与重量，p=0.09）。此外，RAG2^−/−用CD4过继转移的宿主⁺与RAG2相比，T细胞表现出显著的无瘤生存期延长，具有统计学意义^−/−或RAG2^−/−用CD8重建的主机⁺T细胞(图5B、D、RAG2^−/− 与RAG2系列^−/−CD4细胞⁺，第页=0.007，RAG2^−/−CD4细胞⁺ 与RAG2系列^−/−CD8（CD8）⁺，p=0.03）。因此，CD4的恢复⁺仅T细胞就足以MYC公司灭活以消除MRD并诱导肿瘤持续消退。

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图6

免疫系统产生的细胞因子有助于肿瘤持续消退MYC公司灭活

6（A）：显示细胞因子折叠变化的图形表示MYC公司WT和RAG2肿瘤的失活^−/−主机。WT和RAG2肿瘤^−/−在肿瘤发生时和4天后收集小鼠MYC公司灭活并在lumex平台上运行，以检查21种不同细胞因子的蛋白表达。各种细胞因子在MYC公司灭活记录₂转化并绘制各种促癌和抗肿瘤细胞因子*p<0.01，**p<0.001。*高于条形表示细胞因子在MYC公司在指定的宿主中失活。误差线为+/-SEM。6（B）：重组RAG2无瘤生存的Kaplan-Meier曲线^−/−、RAG2^−/−和WT小鼠。RAG2系列^−/−用WT（n=18）或TSP-1,2的脾细胞重建小鼠^−/−（n=16）小鼠静脉注射重组后8天，用淋巴瘤细胞皮下移植小鼠。MYC公司肿瘤长到1000毫米时被灭活^三.WT（n=8）和RAG2^−/−（n=11）。采用对数秩和检验分析指定基因型的存活率。数据是具有代表性的3个实验。6（C）：RAG2无瘤生存期的Kaplan-Meier曲线^−/−小鼠注射TSP-1转染的肿瘤细胞系（n=5）或载体转染的对照肿瘤细胞系。p53基因^−/−有条件的MYC公司采用淋巴瘤细胞系。另请参见图S4

需要宿主免疫系统来诱导趋化因子表达的变化

我们测量了生长在WT或RAG2肿瘤中细胞因子产生的相对变化^−/−之后的主机MYC公司灭活(图6A).MYC公司WT与RAG2的肿瘤失活比较^−/−宿主显示抗增殖和抗血管生成（“抗肿瘤”）细胞因子上调，提示其他免疫效应物可能参与。Eotaxin-1和IL-5(图6A，重量与RAG2系列^−/−折叠更改MYC公司失活p=0.02和p=0.003）是有效的T_H（H）2种细胞因子参与嗜酸性粒细胞介导的抗肿瘤炎症反应的募集(Simson等人，2007年). IFN-γ在MYC公司在缺乏宿主免疫系统（WT）的情况下，WT宿主的失活几乎没有变化与RAG2系列^−/−折叠更改MYC公司失活p=0.03），而RAG2中TNF-α显著下调^−/−主机（RAG2^−/− MYC公司在与关闭，p=0.02），其上调在WT宿主中接近统计显著性（WTMYC公司在与关闭，p=0.07）。许多人已经证明，这两种细胞因子是强效CD4的关键介质⁺抗肿瘤活性(秦和布兰肯斯坦，2000;托马斯和赫西，1998年). 有趣的是，MCP-1是炎性肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的一种有效化学吸引剂，特别是促进肿瘤的M2巨噬细胞(Allavena等人，2008年;胡等，2009)与WT（WT）相比，在免疫缺陷宿主的肿瘤中显著下调与RAG2系列^−/−折叠更改MYC公司失活p=0.008）。

此外，在WT和RAG2肿瘤中检测到“促肿瘤”细胞因子的下调^−/−主机。血管内皮生长因子（VEGF）在野生型宿主中下调了近4倍（WTMYC公司在与Off，p=0.01），而在免疫缺陷宿主的肿瘤中未检测到其表达的变化。IL-β显著下降，接近2倍（WT与RAG2系列^−/−折叠更改MYC公司失活，p=0.02）；这两种细胞因子的下调表明，在宿主免疫系统完好无损的情况下MYC公司灭活(Kowanetz和Ferrara，2006年;Shchors等人，2006年).

最后，RAG2^−/−用CD4重组的宿主⁺T细胞表现出与WT宿主相似的趋化因子表达变化MYC公司灭活(图S4B). 抗肿瘤细胞因子（eotaxin、IFN-γ和RANTES）增加，而癌前细胞因子VEGF蛋白表达减少(图S4B). 因此，宿主免疫状态负责调节细胞因子表达的变化。

TSP表达是肿瘤持续消退所必需的MYC公司停用

我们的研究结果表明，特定细胞因子可能对肿瘤的重塑和肿瘤微环境至关重要MYC公司灭活。我们使用了两种方法来研究TSP-1的作用。首先，我们重建了RAG2^−/−TSP-1,2脾细胞小鼠^+/+（WT）或TSP-1,2^−/−老鼠。TSP-1和2都参与抑制血管生成，并且具有相似的结构域(Kazerounian等人，2008年;劳勒，2000). 通过FACS分析，我们验证了等效免疫重建(图S4A). 的确，RAG2^−/−用TSP-1重组的小鼠，2^−/−脾细胞在肿瘤持续消退后完全无法保护MYC公司与RAG2相比失活^−/−用WT脾细胞重建小鼠(图6B，复发率WT与TSP-1、2^−/−，10%对100%，p=0.02）。我们得出结论，TSP在免疫效应器中的表达对于肿瘤持续消退非常重要MYC公司灭活。

接下来，我们探讨了通过人工将TSP-1引入肿瘤细胞中，是否可以绕过宿主免疫细胞对宿主TSP-1表达的要求。我们比较了MYC公司RAG2失活^−/−感染载体对照的肿瘤宿主与TSP-1表达载体感染的肿瘤。TSP-1过度表达的肿瘤表现出动力学延迟（平均潜伏期80与102天）和肿瘤复发频率降低（40%与100%）导致统计上显著的生存优势(图6C、RAG2^−/−TSP-1型⁺ 与RAG2系列^−/−，p=0.02）。因此，肿瘤细胞的TSP-1过度表达足以增加肿瘤持续消退的持续时间和频率MYC公司免疫受损宿主的失活。

环孢素A治疗原发性肿瘤延缓衰老并阻断血管生成

为了检测是否在原代转基因肿瘤中观察到类似结果，我们测定了环孢霉素A对宿主免疫系统的药物抑制作用(Shevach，1985年)关于……的后果MYC公司灭活。环孢素A对肿瘤细胞的增殖没有任何直接影响在体外(图S5). 经环孢霉素A处理的初级转基因小鼠表现出对MYC公司SAβ-半乳糖苷酶（70%）染色测定失活诱导两种细胞衰老与1%; p16（6%）与2%; p<0.05）和p21（0.5%与0.1%,p<0.01）以及通过CD31染色减少（0.2%）测量的血管生成抑制与0.4%，p=0.05）和TSP-1的诱导（6%与1%，p=0.0006）(图7A、B). 因此，环孢素A阻断了MYC公司失活诱导衰老并阻断血管生成。通过TUNEL染色检测，我们未观察到对凋亡的影响（数据未显示）。然而，环孢菌素A治疗可能抑制MYC公司灭活以诱导增殖停滞。有趣的是，环孢素A似乎在肿瘤进展过程中抑制增殖MYC公司仍处于激活状态。这表明，当MYC公司开启时，T细胞可能促进肿瘤形成，表明癌症免疫反应的双重性质(de Visser等人，2006年).

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图7

环孢素A治疗抑制原发性肿瘤的衰老诱导和血管生成MYC公司诱导T-ALL

7（A）：未经治疗和环孢素A治疗的原发性肿瘤荷瘤小鼠肿瘤的苏木精和伊红、Ki67、SA-β-gal、p16、p21、CD31和TSP-1免疫染色的显微照片（从上到下排序）(MYC公司dox治疗第1天和第4天MYC公司关闭）。比例尺=100μm。7（B）：上述7（A）所示的免疫染色定量。这些图从左到右依次表示Ki67、SA-β-gal、p16、p21、CD31和TSP-1表达的定量。量化是肿瘤内阳性染色区域的平均百分比。对两种不同肿瘤的至少五个不同区域进行了分析。显示了统计显著性（通过未配对学生t检验评估的p值）。*p<0.01，**p<0.001，**p<0.0001。误差条为+/-SEM。另请参阅图S5.

肿瘤监测和致瘤性分析

将患有肿瘤的垂死小鼠进行人道安乐死或在饮用水中（100μg/ml）使用强力霉素治疗，以跟踪肿瘤的消退和复发。卡普兰-迈耶曲线的统计比较基于对数秩检验。有关更多详细信息，请参阅补充方法.

RAG2的重组^−/−老鼠

RAG2系列^−/−小鼠静脉注射（i.v.）（i）20X10⁶来自WT或TSP-1,2的脾细胞^−/−小鼠或（ii）4X10⁶CD4细胞⁺或CD8⁺使用磁激活细胞分选（MACS）从WT小鼠脾脏和淋巴结分离出的T细胞。重建后8天，小鼠尾静脉和CD4出血⁺和CD8⁺使用FACS验证T细胞重建。

在体内生物发光成像

通过XGI-8五端口气体麻醉系统将吸入的异氟醚/氧气与肿瘤小鼠联合麻醉。在成像前10分钟，将底物d-荧光素（150 mg/kg）注入动物的腹腔。然后将动物放在一个不透光的房间里，用IVIS-200冷却CCD相机拍摄图像（加利福尼亚州阿拉米达市Xenogen）(Contag等人，1997年). Living Image用于收集、存档和分析光子通量，并使用Living Image软件（Xenogen）将其转换为伪彩色图像。每组至少5只小鼠注射表达荧光素酶的肿瘤。

这份手稿是为了纪念朱丽叶·杜。我们感谢罗恩·利维、关海克、丽莎·库森、彼得·崔和费尔舍实验室的其他成员提出的有益建议；Robert Negrin、Lisa Coussens和Ben Barres提供转基因小鼠；Pauline Chu用于生成组织学样本；Anet James协助显微镜检查；Yael Resenberg-Hasson协助进行luminex细胞因子分析。这项工作由Burroughs Welcome Fund Career Award、Damon Runyon Foundation Lilly临床研究者奖、NIH RO1拨款编号CA 089305、国家癌症研究所的Invo细胞和分子成像中心拨款编号CA 114747、综合癌症生物学计划拨款编号CA 112973、，NIH/NCI PO1授权号CA034233，白血病与淋巴瘤学会转化研究授权号R6223-07（D.W.F.），NIH R01授权号CA 118374（S.R.），斯坦福研究生奖学金（K.R.）淋巴瘤研究基金会和白血病与淋巴瘤协会（A.F.）。此外，P.B.和A.K.由霍华德·休斯医学院医学生研究训练奖学金和斯坦福医学学者研究奖学金资助。