简介
成熟胰腺由高度分支的管状上皮树状网络组成，构成胰腺的大部分，主要是外分泌功能。导管分支的顶端由腺泡细胞簇覆盖，并与一个树干状的中央导管相连，中央导管将消化酶穿梭到十二指肠中(Pictet和Rutter，1972年). 胰腺分支分叉，因为它们起源于腺泡内，形成由中心腺泡细胞排列的小导管，随后是插管、小叶内导管，最后是小叶间导管，所有导管的口径都在增加(Bonal和Herrera，2008年). 近几十年来，人们对胰腺树的个体发育的理解有了巨大的增长，这在很大程度上是由内分泌分化的研究推动的，它是细胞替代疗法治疗糖尿病的基础(莫尔陶和梅尔顿，2003年;Oliver-Krasinski和Stoffers，2008年;Slack，1995年).
整个胰腺树起源于内皮衍生的原分化上皮(克莱弗和麦克唐纳，2009年). 位于分支尖端的多潜能祖细胞（MPCs）产生绝大多数胰腺细胞，包括腺泡、内分泌和导管谱系(Gu等人，2003年;Zhou等人，2007年). 随着胰腺上皮在妊娠晚期分化，腺泡细胞在分支尖端成熟，而导管和内分泌祖细胞则出现在分支柄中。内分泌细胞通过分层从其上皮邻居处逃逸，并结合成胰岛。剩下的管状上皮细胞形成构成胰腺树的导管分支。因此，外分泌（腺泡/导管）和内分泌室在胰腺前上皮内共享其起源，并协调生长，尽管其机制截然不同，共同形成一个双功能综合器官。
尽管许多研究提供了胰腺早期发育的良好解剖模型(Jorgensen等人，2007年;Pictet和Rutter，1972年)对其早期细胞组织和后期分支模式的研究尚不深入。在外泌后不久，胰腺芽表现为致密、卷曲的上皮结构。分支形成的开始被假设为内胚层上皮随机屈曲的结果(Gittes，2009年;Slack，1995年). 然而，发育中的胰腺分支的个体发生机制尚不清楚。
一些报告表明，胰腺分支和管腔的形成是通过祖细胞上皮内的“微管腔融合”实现的(霍根，1999年;延森，2004). 最近，一项优雅的研究报道了这种不寻常的过程，并证明它需要适当的上皮细胞极性(Kesavan等人，2009年). 然而，胰腺上皮转化为高度分支器官的机制仍有待确定。由于缺乏宏观和细胞水平的描述性特征，对发育中胰腺上皮形态发生和分支的理解受到了限制。因此，没有发现影响这些过程的遗传模型，部分原因是缺乏既定的比较基准。
在这里，我们基于对数百种发育中间产物的分析，提供了胰腺分支的解剖学模型。该模型将为未来突变株的比较和分析提供参考，从而识别调节胰腺上皮形态发生和分支的分子。我们证明，发育中的胰腺在整体形状和特定分支的形成方面显示出可预测的趋势。此外，我们提出了一种新的胰腺分支模型，其中多腔上皮网络重构为单腔分支。这一过程涉及许多细胞事件，包括短暂的上皮分层、动态的细胞极性转移、不同步的顶端细胞收缩和玫瑰花结组织，以及微腔形成和融合。这种分支形成机制是新颖的，与经典描述的分支模型形成鲜明对比(Andrew和Ewald，2009年). 值得注意的是，我们确定了一个影响这些过程的遗传模型。我们证明，EphB信号是胰腺正常发育所必需的，因为在缺乏EphB受体功能的情况下，胰腺上皮和预测的分支模式被破坏。
结果
胚胎胰腺的解剖学
为了了解胰腺分支的个体发育，我们对20-50名胚胎进行了检查和比较Pdx1-lacZ公司胰腺(Offield等人，1996年)在胚胎发育的每个阶段(; 补充材料图S1中每阶段显示10）。我们确定了胚胎背胰腺的共同特征，确定了以前未发现的保守标志，并创建了一个具有代表性的解剖模型，总结了胰腺上皮形态发生的独特和可复制的趋势().
背胰腺发育过程中的形态学标志。(A-H公司)β-半乳糖苷酶染色Pdx1-lacZ公司胰腺背侧在几个发育阶段（E9.5-E18.5，侧视图）。（A，B）前部向左，背部向上；（C-H）远端向上，近端向下。(我)图表显示背部胰腺生长。数据为平均值±标准误差(J)显示主要形态特征的解剖模型。(K（K）)E18.5的β-Gal染色Pdx1-lacZ公司胰腺。(L（左）)P14胰腺显示关键特征持续到出生后阶段。山脊用虚线表示；右分支用灰色虚线表示。(M（M）)铁砧形尾部俯视图Pdx1-lacZ公司胰腺。上皮为蓝色；间充质为白色。尾巴是三角形的；脊是顶点（红色箭头）。(北-北)E14.0背胰腺原位杂交显示间质的异质性。（N）条形图1集中在胰腺的“左侧”；（O）霍克斯11局限于“足跟”，而（P）肾上腺素B1在“右侧”富集。C、J（左）中的红色箭头表示“脊原基”；D-H、J（中间和右侧）、L、M中的红色箭头表示山脊。E-H、J、L中的括号表示左侧分支；C-H和J中的虚线勾勒出铁砧形尾巴的轮廓。（D-H，J）蓝色箭头表示胃叶。（E-H，J）支架勾勒出左侧分支。（E，F，J）三个黑色箭头，右侧分支。dp，胰腺背芽；llb，左侧分支；rlb，右侧分支；s、 脾脏；st，胃；v、 腹侧胰腺芽。比例尺：A-E、m-P中的100μm；F-H中为200μm；K，L中为400μm。
胰腺背侧的脾和胃叶（E12.5出生）
如前所述(Bock等人，1997年)，小鼠背胰腺由一个大的脾叶和一个小的胃叶组成(). 脾叶沿胃从十二指肠（近端）延伸至脾脏（远端），构成背部胰腺的大部分。胃叶沿后胃延伸().
铁砧形尾巴（E12.5胎）
这包括脾胰腺的远端和最大区域(). 术语“尾巴”，类似于人类胰腺的远端区域(Cleaver和Melton，2004年)，E14.5呈现出典型的“铁砧状”形状。尾巴大致呈金字塔形，由复合树枝组成。
山脊（E11.5出生）
该区域形成金字塔形尾部的顶点，并沿着胰腺的近轴延伸(). 当从侧面观察背胰腺时（胃在后面），它将脾叶任意指定的“左”和“右”侧分开(). 山脊最初可在E11.5附近识别()，在E14.5中突出显示()进入产后阶段().
鞋跟（E13.5-15.5）
脚后跟是位于“砧形”尾巴“右侧”的一个瞬态特征。它是一个厚厚的圆形间质帽，覆盖在尾部分支上皮上，位于脾脏附近().
“脊”和“跟”结构的识别基于形态学特征和间充质基因的局部表达(). mRNA的原位杂交霍克斯11(Tlx1型–小鼠基因组信息学），条形图1和肾上腺素B1(Efnb1号机组–小鼠基因组信息学）在E14.0中揭示了胰尾内的中胚层亚结构域。条形图1标记胰腺的“左侧”(),霍克斯11只标记“鞋跟”()ephrin B1标记胰腺的“右侧”().
侧支（E13.5-新生儿）
胰腺显示“侧”型分支(Metzger等人，2008年;Puri和Hebrok，2007年). 脾叶沿其近轴在脾脊两侧显示出许多平行的外侧分支。长的外侧支在“左侧”向胃后部延伸()而较短的位于“右侧”，延伸至胃底().
腹侧胰腺形态也显示出发育过程中可识别的生长趋势，包括相似的模式和分支的开始（参见补充材料中的图S2）。然而，这项研究侧重于背胰腺。
胰腺分支模式的趋势
为了识别分支模式和趋势，根据最容易区分的特征，如尾部形态和左侧分支，对胰腺进行分类。计算了每个类别的相对频率，并组装了代表性示例（参见补充材料中的图S3）。
我们在胰腺发育的早期就开始了分析。如其他人所述(Jorgensen等人，2007年;Offield等人，1996年;Slack，1995年)E9.5芽在肠道管的背侧和腹侧均以“鳍状”上皮外翻的形式出现在整座山上（参见补充材料中的图S3A），到E10.5时，背芽出现“拳状”（参见补充资料中的图53B）。在这些早期阶段，所有胰腺显示出几乎相同的大体形态（参见补充材料中的图S1A、B）。
到E11.5时，背芽被拉长成泪滴状结构（参见补充材料中的图S3C），远端尾巴的两种形式变得可区分：钝尾或分叉尾。在这个阶段，由于芽表面相对光滑，枝条无法区分。然而，到E12.5时，芽表面完全被短粗的、含有MPC的“尖端”覆盖(). 在本报告中，为了简单起见，我们将这些结构称为“提示”。
胰腺发育过程中的外支形态和生长。单个分支的形态。远端向上，近端向下。(A-D公司)E12.5-E15.5的β-半乳糖苷酶染色Pdx1-lacZ公司背胰腺。(A类′-D类'）覆盖芽表面（盒子）的含有MPC的上皮“尖端”的高倍放大详图`叶尖在发育过程中保持相对均匀的大小（红色括号），但数量增加，而分支缩小。(E类,F类)“尖端”对分支生长的贡献模型：（E）模型I，上皮“尖端”经历垂直管状生长，延长为单个分支；（F） 模型II，上皮“尖端”通过反复分裂进行纵向生长，生成新的“尖端”，并形成下伏分支上皮的整体延伸。蓝色箭头表示矢量增长。比例尺：A-D中100μm；A′-D′中为50μm。
在E12.5-13.5之间，真诚地可以观察到分支形成的起始。到E13.5，胰腺“分支”出现了宽突起，布满“尖端”。值得注意的是，与所有其他阶段相比，在这个阶段，新生枝条的模式呈现出最高水平的变化(参见补充材料中的图S3）。我们推测，这种高水平的观察到的变异是由已知的在胰腺快速变化的二次转变期间发生的增殖爆发引起的。
从E13.5到E17.5，单个胰腺的整体形态在外观上逐渐趋同。尽管变异性仍停留在单支水平，但胰腺很容易根据其左侧分支进行分类：I型，无/短的左侧分支；II型，沿胰轴中间有一或两个分支；III型，许多或长的侧枝（参见补充材料中的图S3E-I′）；E13.5和E14.5的一些胰腺显示出不可分类的胰腺形态（～0-10%，数据未显示）。到E18.5，胰腺形态分为两大类：“短”左支（补充材料中的图S3J’）和“长”左支。围产期胰腺的形态学特征（如上所述）可清楚识别(). 因此，尽管胰腺分支被认为是随机的，但我们表明，至少大体上，分支的模式是可以预测的。
分支形成：上皮/导管丛重塑
为了理解分支形成的起始，我们研究了E12.5左右的第一个外部明显的“尖端”(). 鉴于“小费”由MPC组成(Zhou等人，2007年)，假设它们产生延伸的管状分支。因此，我们预计分支的形成是由单个上皮“尖端”的垂直伸长引起的（模型I，). 然而，令人惊讶的是，我们没有观察到中等长度和可变长度的“尖端”，这表明“尖端”没有逐渐“管状”延伸。这些短上皮结构在整个胰腺生成过程中保持固定和大小一致，但随着时间的推移数量增加(; 数据未显示）。
事实上，在E13.5，左侧分支似乎是由广泛的上皮外侧突起形成的，这些突起随着时间的推移而变窄(). 这种形态表明，分支是通过上皮细胞的生长和重塑形成的，而不是通过“尖端”的生长形成的。因此，我们的观察结果支持另一种分支生长模型，其中“尖端”MPC对分支生长的贡献是通过纵向生长，其中“末端”重复分裂以生成新的“尖端”，以及中间上皮，从而导致下伏分支上皮的全面延伸（模型II，).
由于胰腺分支生长的动力学出乎意料，我们从不同的角度研究了分支的出现：用粘蛋白1（Muc-1）染色检查分支管腔(Pierreux等人，2006年) (). 令人惊讶的是，我们发现在明显的分支出现之前，胰腺上皮已经建立了复杂的内腔网络，即管腔“丛”(). 然后，这个神经丛重构为一个层次化的管状系统(). 有趣的是，分支前上皮突起含有多管腔丛。随着这些突起细化为分支，它们的多腔网络逐渐重塑为单腔(). 因此，胰腺分支管腔在任何分支的外部证据之前就已经形成，多腔管状神经丛协调地延伸和重塑为分支单腔树(). 据我们所知，这是这种上皮管和分支形成的第一个证据。
胰腺发育过程中的内脏形态。(A-C公司)（A）E12.5、（B）E14.0和（C）E14.75胰腺的整体Muc1免疫荧光染色，显示导管系统。远端位于顶部，近端位于底部。(D类)胰腺分支的高倍视图和卡通显示神经丛重塑。(电子-G)胰腺近端区域导管丛的高倍放大显示，最初管腔较小（E），管腔变宽（F），管状重塑开始（G）。短而明亮的树枝是腺泡前“尖端”内的小导管。箭头表示神经丛；箭头表示重塑的分支。比例尺：50μm。
胰腺上皮：暂时分层和脱层
为了研究这种异常分支形态发生的细胞基础，我们评估了发育过程中胰腺上皮组织的动态(). 利用E-cadherin免疫荧光技术，我们确定胰腺由单层上皮细胞产生，单层上皮细胞经历了快速但短暂的分层，随后随着导管和分支的产生，胰腺又分解为单层状态。
从E7.5到E15.5胰腺萌芽期间的胰腺上皮分层和分解。(A-H公司)整个发育过程中胰腺背芽（A-C）横切面和（D-H）矢状切面上E-cadherin的免疫染色。A-E切片显示胰腺分层，而F-H切片显示胰腺上皮脱层。白色箭头表示单个立方上皮层。粉红色箭头表示新形成的腺泡。粉红色斑点线描绘了柱状上皮的胰腺“平台”。白色斑点线描绘了背芽的上皮。绿色虚线勾勒出内分泌簇。黄色星号表示PCL。(我)B中的高倍图像和细节动画，显示了大部分单层上皮。(J)高倍图像和D细节动画，显示上皮分层。(K（K）)显示发育过程中上皮层平均数增加（分层）然后减少（分辨率）的图表。g、 肠管，神经纤维，神经折叠。比例尺：25μm。
在出芽之前，在E7.5-8.25之间，胰腺前内皮层由单层立方上皮细胞组成(). 在这些阶段，胰腺前上皮没有器官发生的形态学迹象。然而，随着胚胎的旋转，我们发现背芽上皮细胞从立方形转变为柱状，形成“斑块”或上皮增厚(). 虽然这个板最初是一个单细胞层厚，但在接下来的2天里它分层了，在十二指肠腔和外基底膜之间产生了多层细胞(). 随着发育经历“原分化”阶段（E8.75-11.5），细胞层的数量增加到大约六到八层()，围绕初级中央管腔（PCL）（参见补充材料中的图S4）。
值得注意的是，我们认为多层芽内的所有细胞本质上都是“上皮细胞”，因为它们表达E-cadherin，不表达间充质标记物，如波形蛋白（数据未显示）。高分辨率3D重建和z（z）-叠片显示，在E10.5芽的最高度分层区域内，内部细胞既没有直接接触PCL，也没有通过薄延伸物接触周围基底膜(和数据未显示）。
随着胰腺经历二次转变，多层胰腺上皮开始溶解，随着分支的形成，厚度逐渐减少（脱层）(). 这种分辨率是两种主要细胞变化的结果：（1）上皮细胞重排形成单细胞层上皮管；（2）导管网络从多维神经丛重塑为层次分支树。有趣的是，这些变化伴随着原分化细胞分化为不同的胰腺细胞谱系：内分泌细胞、腺泡和导管。
胰腺上皮极性动力学
为了进一步了解胰腺上皮是如何产生有组织的管的，我们检查了整个分层和去分层过程中细胞极性的动力学(). 尽管胰腺芽起源于典型的极化上皮（数据未显示），但在分层过程中，一些上皮细胞部分或完全失去了极性。这是一个暂时现象，因为当上皮细胞分解成单层并形成分支时，这些细胞恢复了典型的极性。
在分支形成期间分层和分解期间细胞极性丢失。E10.5（顶部面板）和E13.5（中间面板）的胰腺矢状截面上的免疫荧光染色如图所示。(A-E公司)箭头表示流明；括号表示体细胞。(A类′-E类'）箭头表示上皮细胞显示清晰的根尖极性，星号表示未极化的体细胞。(F类)E11.75胰腺芽DAPI染色。帽细胞中的箭头表示细胞核的基本位置。(F类'）切片与F相同，染色为ZO-1和β-catenin。箭头表示ZO-1的极化定位。a、 柱状帽细胞；b、 圆形体细胞。(克)层粘连蛋白和GM130显示帽细胞的极化。插图显示了放大倍数较低的视图。断裂线，胰腺上皮，除了A、A′、B、B′中由层粘连蛋白或IV型胶原勾勒的部分(H（H）)复层胰腺上皮（E10.0-E12.5）和分化芽（E12.0-E15.5）内的细胞域示意图。比例尺：A-E、A′-E′中为25μm；F、F′、G中为10μm。
一旦完全分层，在E10.5，胰腺上皮细胞的组织方式与乳腺相似(Lu和Werb，2008年;Mailleux等人，2008年;斯特恩利赫特，2006)，至少有三个可识别的区域：外层的“帽”细胞、中间的“体”细胞和最内层的“内腔”细胞(). `Cap’细胞保持其基底极性，因为它们直接接触基底膜（基底表面的层粘连蛋白和胶原，基底核定位）()，但没有显示心尖极性，因为他们失去了心尖PAR复合体的表达（APKC，Par3）()或埃兹林(). `身体细胞也没有表现出顶端膜结构域，这是通过缺乏aPKC来评估的；然而，根据层粘连蛋白或IV型胶原沉积评估，它们显示出很少的基底极性(; 数据未显示）。与帽细胞相比，腔线细胞仅表现出顶端极化，因为它们与腔隙直接接触，并且所有顶端标记物（包括aPKC、Par3、ezrin和ZO-1）都有显著积累(，和未显示的数据），但没有基础极化。
复层胰腺上皮的极性丢失是暂时的，呈阶梯状。帽细胞和体细胞中重新获得极性的第一个迹象是ZO-1的顶端定位，早在E10.5(; 补充材料中的图S5）。然而，此时在体细胞中未检测到其他根尖标记物。值得注意的是，我们经常观察到多侧含有ZO-1的单体细胞（参见补充材料中的图S5B，F）。此外，随着时间的推移，帽细胞变长，表现出基底核定位()高尔基体的顶端定位（GM130）().
完全根尖极性和基底极性的逐渐重新融合在时间上与二次转变有关。极化的单层上皮细胞在此期间再次出现()而分层体细胞逐渐减少(). 在E15.5左右，分支上皮内的几乎所有细胞都显示出完全的顶基极性，并整合成单层分支上皮（数据未显示）。
微腔形成和小管形成
为了表征管腔网络的形成，我们检测了胰腺芽的Muc1染色(). PCL，芽内最初突出的中央腔()随着芽的伸长和新生管腔的出现，迅速变薄。因此，E10.75晚期芽主要由形成的丛组成(). 在此阶段，可见多个孤立的小管腔以及融合管腔网络(). 序列号z（z）-堆栈重建显示，随着时间的推移，孤立的管腔整合到管状网络中。微管腔之间的连接似乎是通过“极化管”发生的，即预示着未来管腔的极化上皮细胞束().
当上皮细胞重新极化并经历顶端收缩时，内腔形成。(A类)E10.75胰腺芽全贴Muc1染色。(B类)A的高倍镜显示孤立的微腔（蓝色箭头）和连接的极化管（粉红色箭头）。(C类,D类)ZO-1和E-cadherin E12.5胰腺上皮的免疫荧光染色。（C）融合z（z）-30μm E12.5胰腺切片的叠加图像。箭头表示管腔前极化管。（D） E12.5部分的高倍视图显示ZO-1环（黄色箭头）和瓶形电池（星号）。(E类)具有顶端收缩和ZO-1环的瓶状细胞的卡通。(F-I公司)E12.0背胰芽连续切片ZO-1和β-catenin蛋白染色。（F） 未极化的上皮细胞表现出紧密连接的分散定位。（G） 相邻细胞的ZO-1在顶部聚集并在细胞之间形成中心聚集。（H） 上皮细胞以玫瑰花结的方式围绕ZO-1聚集体组织。（一） 微腔开放，ZO-1标记顶端细胞表面。箭头表示ZO-1骨料。玫瑰花瓣轮廓为白色。(J)不同阶段管腔形成的卡通示意图。(K（K）)内腔网络形成和重塑为树状导管系统的卡通模型。D、 远端；P、 近距离。比例尺：50μm in A；B中为10μm；C-I中为5μm。
对相邻连续切片的分析表明，在管腔形成过程中，体细胞经历了显著的细胞形状变化和重排。E10.5处的大多数体细胞最初缺乏明显的极性。然而，到了E10.75，他们很快重新获得了极性，通过ZO-1免疫反应性的重新融合进行评估（参见补充材料中的图S5）。在这个阶段，单体细胞通常显示ZO-1表达的多个病灶或聚集().
在一些单个细胞中，ZO-1的表达以O型环模式区分，形成顶端“衣领”(). 在连续切片追踪单个细胞时，我们确定O型环代表了瓶状体细胞在复层上皮内的收缩顶端（参见补充材料中的图S6）。这些细胞似乎在多层上皮内经历了不同步的顶端收缩，因为它们没有特定的顺序和随机的位置。
随着发育的进展，我们注意到瓶状体细胞越来越倾向于与其他形状相似的体细胞形成独特的“玫瑰花结”(). 这些新极化瓶状细胞的玫瑰花结将表达ZO-1的顶端定位在中心。玫瑰花瓣似乎“打开”了它们之间的孤立微管腔(). 这种孤立的上皮“囊”在3D重建中很容易被检测到，并且在发育过程中似乎逐渐相互连接，形成连续的管腔网络().
综上所述，这些数据表明，在分支形成之前，先有上皮分层、细胞形状改变和极性转移、微腔形成和融合，然后是管状丛重塑为胰腺分支的树状系统。
正确的胰腺分支和发育需要EphB信号
EphB2和EphB3受体在胰腺上皮中表达（参见补充材料中的图S7）(van Eyll等人，2006年)和复合EphB受体突变小鼠EphB2型lacZ公司/lacZ公司/EphB3型–/–显示胸腺和肠上皮组织的缺陷(Batlle等人，2002年;Garcia-Ceca等人，2009年;苗和王，2009;Munoz等人，2009年). 然而，到目前为止，尚未对这些突变体的胰腺结构进行评估。使用我们的胰腺正常发育标准，我们评估了胰腺上皮发育和分支是否需要EphB信号。
可视化胰腺上皮和大体形态EphB2型lacZ公司/lacZ公司/EphB3型–/–我们检测了小鼠Ngn3号机组和Sox9指数表达式(Villasenor等人，2008年). 突变胰腺显示出整体形态和分支的缺陷，包括脾叶和胃叶的大小和厚度减少，以及特征性的“砧形”尾部缺失(). 突变株胰腺背侧远端的许多左侧分支的长度严重缩短，“脊”极为扁平(). 除了分支消去外，间充质基因的区域化也丢失了（参见补充材料中的图S8），这表明间充质和上皮之间的串扰可能是胰腺正常发育所必需的。突变体表型的外显率和严重程度是可变的，占总数的54%EphB2型lacZ公司/lacZ公司/EphB3型–/–表现出破坏的形态，30%表现出严重的表型（类似于).
当EphB信号受损时观察到分支缺陷。(A-D公司)原位杂交Sox9指数E14.5背胰腺。（A，B）Eph突变体中的异常胰腺形态。（C，D）胰腺尾部俯视图显示Eph突变体的脊高度降低。(E类)野生型和(F类)EphB突变体E16.5胰腺在突变体中显示出取消的远端尾部形态。比较尾部宽度（红色括号）。折线勾勒出胰腺上皮。(克)E14.5野生型和EphB突变体尾部面积和尾部脊高度差异的测量图。结果为平均值±标准误差(H-J公司)全贴Muc1染色和追踪显示E14.5处Eph突变体中的导管丛更原始。(K（K）)β-catenin水平的量化。E12.0胰腺背侧的免疫染色(L（左）,M（M）)ZO-1和β-catenin，突变体中的上皮细胞紊乱。箭头表示β-catenin水平较低。(N个,O（运行）)野生型和EphB突变上皮中β-catenin蛋白的高倍放大。(P（P）,问)更高倍的E-cadherin免疫染色显示，E12.0时EphB突变体的膜上水平较低。(R（右）,S公司)上皮（ZO-1和β-catenin）的高倍放大图显示EphB突变体中玫瑰花结减少（白色轮廓）和ZO-1表达的顶端增加。箭头表示微流明。(T型,U型)E12.0野生型与EphB突变型微腔的高倍放大。ZO-1，绿色；β-catenin，红色(V（V）,W公司)胰腺芽免疫染色显示EphB突变体中Ptf1a表达上皮减少。野生型；麻省理工学院，EphB2型lacZ公司/lacZ公司/EphB3型–/–.比例尺：A-D中50μm；E、F中为100μm；H、I、R、S中为10μm；L、m、V、W中为25μm；N-Q、T、U中为5μm。
突变体后期出现分支形态中断，并伴有外分泌量减少（数据未显示）。E16.5、P14和成年突变胰腺较小，显示出较短的分支和减少的尾部(; 数据未显示）。此外，尽管成年人可以存活和生育，但他们的体重较低，胰腺分支较少，并且葡萄糖稳态存在缺陷（数据未显示）。
为了辨别观察到的表型是否是由单个EphB受体引起的，我们检测了EphB单突变体。这个EphB2型lacZ公司/lacZ公司/EphB3型–/–小鼠EphB3受体为空，EphB2受体为显性阴性。EphB2的细胞质域被β-半乳糖苷酶取代，从而阻断正向信号传递，但允许通过Eph配体反向信号传递。为了确定正确分支所需的受体，复合突变体EphB2型lacZ公司/lacZ公司/EphB3型–/–与单个突变体进行比较EphB3型–/–和EphB2型lacZ公司/lacZ公司单个突变体均未显示胰腺大体形态或分支缺陷（参见补充材料中的图S9），这表明EphB2和EphB3受体都是胰腺发育所需的协调受体。
EphB2型lacZ公司/lacZ公司/EphB3型–/–突变体显示上皮组织和管腔形成被破坏
显示野生型与EphB2型lacZ公司/lacZ公司/EphB3型–/–在不同阶段（E12.5、E14.5、P1）检测Muc1免疫染色胰腺的突变体、3D重建。在E12.5，与野生型相比，突变型管腔最初较窄（塌陷）（参见补充材料中的图S10A-D）。到E14.5，狭窄的管腔开放，但导管系统未能完全重塑为正常的层次结构(; 参见补充材料中的图S10E-H）。通过P1，EphB突变体大导管中Muc1的表达减少，无法对重塑的全部程度进行分析（参见补充材料中的图S10I，J）。总之，数据表明EphB突变体的管腔系统在其小管生成和重塑的进展中延迟。
与野生型相比，也发现突变上皮的组织结构紊乱(). 突变的胰腺上皮细胞膜相关β-连环蛋白显著减少，尤其是外帽细胞(; 参见补充材料中的图S11）。然而，我们注意到，在体细胞内，β-catenin通常在不规则聚集物中处于较高水平（参见补充材料中的图S11）。这些数据表明，β-catenin的适当水平和细胞定位都需要Eph信号。此外，β-catenin是粘附连接的组成部分(Gottardi和Gumbiner，2001年)，我们检测了EphB2型lacZ公司/lacZ公司/EphB3型–/–突变体。接合E-钙粘蛋白也明显减少()这表明突变上皮的结构凝聚力发生了根本性变化。因此，剖面图显示出杂乱无章的玫瑰花结()并证实早期管腔“塌陷”().
Asβ-catenin影响胰腺生长(Dessimoz等人，2005年;Murtaugh等人，2005年;Wells等人，2007年)，我们检测了MPC或祖细胞上皮细胞是否可能在EphB突变体中显示早期减少。尽管注册会计师人数+E11.5的细胞相对没有变化，表达Ptf1a的尖端细胞的数量(Masui等人，2008年)显著减少(; 参见补充材料中的图S12）As Ptf1a+上皮细胞产生所有胰腺谱系(Kawaguchi等人，2002年)，我们检查了内分泌数量。的确，EphB2型lacZ公司/lacZ公司/EphB3型–/–胰腺在整个发育过程中和成年期发育出的内分泌细胞明显较少（数据未显示）。有趣的是，这种减少在大多数分支缺陷被发现的尾部远端区域更为显著。总之，这些结果通过适当的β-catenin水平和细胞定位证明了EphB信号在胰腺上皮发育和分支中的作用，这一作用以前未被报道。
讨论
在这项研究中，我们对胰腺分支进行了深入分析，包括对整个分支形态的“外部”分析和对胰腺上皮及其发育中的管状网络的“内部”分析。长期以来，人们认为胰腺呈现随机分支模式(Slack，1995年); 然而，我们的观察结果显示了可预测的分支趋势。此外，我们的分析阐明了胰腺分支的新细胞动力学。我们观察到芽上皮戏剧性的瞬间分层，其中由于细胞形状的改变而形成微腔，并相互融合形成管腔丛。然后，这个复杂的管道网络发生重构，随后生成胰腺分支。我们还证明了分支程序的遗传调控，因为复合EphB受体信号突变小鼠显示出上皮组织缺陷、胰腺祖细胞上皮减少、正常肾小管重塑延迟以及随之而来的胰腺分支减少。总之，这项研究为今后鉴定胰腺调节基因建立了基线参考，并揭示了上皮器官发生的新方面。
胰腺上皮的分层和极性
在背芽和腹芽中，胰腺分支及其管腔的形成之前是上皮分层和细胞极性的变化。有趣的是，分层过程与胰腺中的“原分化状态”一致，此时多能干祖细胞库正在扩大(克莱弗和麦克唐纳，2009年). 随着祖细胞池缩小，细胞分化为内分泌、外分泌和导管谱系，上皮细胞随之分解。短暂分层可能是形成成熟胰腺所需的适当祖细胞池的必要组成部分。
一旦聚集了大量未极化的体细胞，这些细胞几乎立即开始重新获得极性并重新排列形成微腔。复层上皮内极性重建的第一个证据是顶端紧密连接成分ZO-1和顶端/管腔标记物Muc1的出现。这两种分子和其他顶端蛋白在胰腺复层上皮中的适当局部积聚已被证明依赖于Cdc42的功能(Kesavan等人，2009年). 只有在管腔形成的后期，标准极性分子（如aPKC）才会积累，其次是ezrin、Par3/6和层粘连蛋白（laminin）。
在体细胞重新获得极性的过程中（E10.0-10.75），单个细胞经历了不同步的顶端收缩，每个细胞都形成了ZO-1的紧密环。在单个细胞中定位ZO-1后，相邻细胞中的细胞形状发生变化，导致细胞形成玫瑰花结，顶端聚集在一起。有趣的是，ZO-1在体细胞中的聚集和玫瑰花结的形成与斑马鱼肠腔的发育非常相似(Horne-Badovinac等人，2001年). 在这两种情况下，上皮细胞之间最初分散的连接处发生重组，在细胞-细胞界面形成小病灶。这些病灶相互融合，直到在每个玫瑰花结的中心有一个单独的簇，使管腔出现在这些高度偏振的簇的中心。我们推测斑马鱼肠腔中出现了胰腺腔，包括细胞连接的重排和顶端膜域的扩张。
虽然胰腺分层的细胞机制尚不清楚，但可以想象，最初的帽细胞以类似于皮肤分层的方式进行不对称的细胞分裂(Lechler和Fuchs，2005年). 阐明胰腺上皮分层的细胞过程，确定体细胞生成和极性转变的起源和机制，以及确定分裂平面是否对细胞命运有影响，都将是一件有趣的事情。
有趣的是，分层的胰腺芽与早期乳腺和唾液腺的芽相似(Mailleux等人，2008年;斯特恩利赫特，2006;塔克，2007年;Walker等人，2008年). 这三种细胞都会产生暂时的复层上皮，并重新形成管腔。然而，小管生成和分支形成的潜在机制可能不同。乳腺和唾液腺腔都是由体细胞的凋亡清除形成的(Mailleux等人，2008年;塔克，2007年). 相比之下，胰腺腔的形成与凋亡无关（数据未显示）。此外，在乳腺和唾液腺中，在器官已经分支后会形成新的管腔，而在胰腺中则相反：在分支前会出现导管丛(Hogg等人，1983年;Mailleux等人，2008年;斯特恩利赫特，2006;塔克，2007年).
胰腺分支源于导管丛重塑
因此，我们的工作证明了一种新的分支形成机制，这种机制从内到外以极不寻常的方式发生，在厚的多层上皮内形成管腔的时间明显早于分支出现的时间。在管腔丛的复杂重塑而不是上皮芽的简单延伸之后，外部可识别的胰腺分支出现较晚。尽管这种转化的几何过程尚不清楚，但可能存在诸如上皮收敛延伸或退化等细胞机制。
胰腺导管重塑使人想起血管形成过程中观察到的细胞变化(里索和弗拉梅，1995年). 胚胎血管最初形成一个均匀的管丛，随后“重塑”成大小动脉和静脉的层次排列。在很大程度上，这些事件是由原始血管内的血流动力学驱动的(Jones等人，2006年). 胚胎导管前小管外分泌液的流动是否足以在胰腺导管丛重塑中发挥任何作用，这仍是一个尚未解决的问题。
虽然我们的观察支持侧支作为胰腺分支的主要机制，但通过移植胰腺芽的实时成像观察到(Puri和Hebrok，2007年)，我们在这里完善了这个概念，表明它不仅通过上皮延伸发生，而且与上皮重塑相协调。我们还注意到，分支“尖端”，根据其名称的性质，假定其代表通过管状延伸生长的结构，实际上并不产生单独的分支。我们的观察结果支持一种不同的机制，即含有MPC的“尖端”结构反而分裂和增殖，通过纵向作用促进重塑上皮的生长。
分支模式的可预测趋势
我们的数据还表明，发育中的胰腺分支在形态学上表现出可预测的趋势。通过对数百个个体胰腺的比较，构建了总支模式的基线模型。虽然我们的分析集中在背侧胰腺芽，但腹侧胰腺也经历了类似的分支过程，在E12.5左右发生二次转变之前即开始（如背侧胰腺）。我们注意到，由于内部管腔形成先于外部分支形成的不寻常的顺序性，分支的模式只能从E13.5开始评估。在导管丛形成过程中，早期“分支”模式（E10.5-11.5）的分析本来就被排除在外，因为外盖上皮最初是光滑的。
由此产生的一个有趣的问题是胰腺分支如何获取其模式信息。我们推测间充质可能是一个候选的信号组织，因为我们观察到间充质的明显区域化和各种因子的局部表达。事实上，EphB突变体中的间充质结构域发生了改变（参见补充材料中的图S8），表明间充质和上皮之间存在相互信号传递。需要进一步分析这些间充质因子实验性破坏后的分支模式，以进一步了解胰腺分支模式。
胰腺上皮形态发生需要EphB信号
由于EphB2/B3受体在导管前上皮中表达（参见补充材料中的图S8）(van Eyll等人，2006年)Eph/ephrin信号传导影响上皮细胞行为(Holmberg等人，2006年)，我们分析了缺乏EphB信号的胰腺分支。事实上，在缺乏EphB信号的情况下，发育中胰腺的主要形态学特征是有缺陷的。我们发现早期上皮玫瑰花结和微腔破裂，导管重塑延迟，Ptf1a（祖细胞上皮）减少，导致胰腺分支消失，内分泌/外分泌肿块减少，这些数据表明，分支缺陷可能是上皮形态发生缺陷的结果，并表明胰腺细胞系的分化取决于初始上皮的适当结构、重塑和向分支器官的延伸。
EphB突变上皮缺陷的分子基础似乎与细胞极性调节不同。在EphB突变体中，尽管ZO-1在体细胞中增加且无组织，但它仍如预期的那样位于顶部。此外，观察到的形态缺陷与最近描述的Cdc42胰腺缺失的形态缺陷不同(Kesavan等人，2009年). 虽然上皮细胞中缺乏Cdc42功能会导致上皮完整性和微腔融合失败，但EphB信号的缺失反而会导致上皮细胞紊乱，影响随后的管腔和分支发育。
这些缺陷可能是由于EphB突变体中上皮粘附发生改变所致。EphB突变体中上皮细胞之间连接的β-连环蛋白的减少可能伴随着细胞质β-连环蛋白的增加，并可能伴随着β-连环蛋白信号的增加。在胰腺上皮中表达组成活性形式β-catenin的小鼠，PdxCre早期的β-猫积极的显示上皮形态异常，E-cadherin表达降低，外分泌支伴随缺陷(Heiser等人，2006年). 同样，EphB2型lacZ公司/lacZ公司/EphB3型–/–突变体表现出结合E-钙粘蛋白水平降低，胰腺发育不全和分支减少。然而，EphB2型lacZ公司/lacZ公司/EphB3型–/–突变胰腺没有出现PdxCre中所见的囊肿形成早期的β-猫积极的小鼠（数据未显示），反映出较轻的胰腺表型。总之，这些数据表明，EphB信号可能通过调节上皮细胞粘附和β-连环蛋白的可用性来调节胰腺上皮形态发生，包括微管腔的形成和腺泡的发育。
胰腺腔发育和分支的细胞模型
我们的研究报告了胰腺形态发生背后不寻常的上皮动力学。它还首次分析了小鼠胚胎发育期间的胰腺分支和整体形态，因此为将来评估小鼠突变体的胰腺结构和鉴定调控基因奠定了基础。鉴于胰岛内分泌细胞和整个外分泌腺树都起源于原始分化的胰腺上皮，阐明其个体发生和结构变化将有助于我们理解对其细胞谱系（外分泌和内分泌细胞）及其祖细胞重要的发育步骤。
