组蛋白脱甲基酶PHF8与转录因子ZNF711在X连锁精神发育迟滞中的功能联系

PHF8 PHD手指绑定到H3K4me3/me2

PHF家族的一个共同特征是存在氨基末端定位的PHD手指。最近的研究表明，PHD手指的一个子集与组蛋白尾部结合，并且亲和力受组蛋白尾部翻译后修饰的调节(香槟和库塔特拉泽，2009年；Chan等人。，2009; Wysocka等人。，2006)。这些相互作用对调节转录具有重要的功能。为了检测PHF8的PHD指是否与组蛋白尾部结合，我们纯化了作为GST融合蛋白的PHF8 PHD结构域。对GST-PHD融合进行分析，以结合到一个肽阵列，该肽阵列覆盖了大部分经甲基化、乙酰化和磷酸化不同程度和组合修饰的H2A、H2B、H3、H2AX和H4(图2E） ●●●●。分析表明PHD结构域直接与H3K4me3结合，在较小程度上与H3K 4me2结合。有趣的是，除了H3K4me3外，当肽通过H3K9/K14位置的乙酰化修饰时，也观察到了这种相互作用，这种修饰通常与转录活性基因相关。虽然我们还没有进行进一步的实验来验证这一发现，但我们注意到PHF8的PHD结构域也能够与含有氨基酸44-64的H3肽结合。

为了进一步检查PHD和JmjC结构域的结合特异性，将一个包含PHD和JmjC域的GST融合蛋白与生物素化组蛋白H3肽三或二甲基化在K4或K9位置孵育(图2F） ●●●●。虽然未检测到与K9位置甲基化的肽的结合，但观察到与H3K4me3的强结合，支持肽阵列映射数据。最后，HeLa中表达的内源性PHF8与H3K4me3结合，而未修饰或含有H3K9me3/me2的肽未检测到结合(图2G和第2页D） ●●●●。总之，这些数据表明PHF8的PHD指可以直接与H3K4me3修饰的组蛋白尾部结合，并且JmjC结构域，至少在结合条件下，不会干扰H3K4me3或介导与底物H3K9me2的稳定结合。

PHF8和H3K4me3在靶基因上进行克隆化

H3K4me3的全基因组分析表明，这种染色质修饰优先与转录起始位点（TSS）相关(Barski等人。，2007)。PHF8对H3K4me3的亲和力表明，PHF8将与H3K4me3阳性TSS周围的靶基因结合。为了确定PHF8的全基因组结合位点，我们使用PHF8特异性抗体，通过高分辨率ChIP-seq（染色质免疫沉淀和DNA测序）分析，对人类神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中的PHF8进行全基因组定位分析，并将其与RNA聚合酶II（RNA pol II）的结合模式相关联和H3K4me3。IgG归一化后，基于980万序列读取和910万H3K4me3读取，检测到的PHF8峰值总数分别为17075和19534。使用hg18基因组数据库对基因峰值进行注释表明，10039个基因对H3K4me3呈阳性，7682个基因在TSS的±1000 bp范围内与PHF8结合。中的维恩图图3A说明了PHF8和H3K4me4阳性基因的数量，并显示了PHF8-和H3K4me3-阳性基因的主要重叠（～82%），而H3K4me3-阳性基因中有35%为PHF8阴性。一般来说，PHF8与H3K4me3阳性区域共定位或部分重叠，并覆盖目标基因的假定TSS。对PHF8和H3K4me3检测到的峰值与转录起始位点之间的距离相关性的分析表明，这两个峰值主要与TSS重叠，TSS在+200左右有一个共同的峰值最大值(图3B） ●●●●。此外，由H3K4me3结合的82%的核苷酸也由PHF8结合(图3C） ●●●●。然而，PHF8结合和H3K4me3水平之间没有严格的相关性（例如，比较CXXC1和MBD1；图S3A） ●●●●。令人感兴趣的是，~35%的H3K4me3阳性基因对PHF8呈阴性，这表明除了PHF8的PHD结构域之外，其他因素可能决定基因靶向。PHF8结合基因的主要部分（～69%）也是RNA pol II阳性，这表明它们要么“准备好”转录，要么具有转录活性。因为我们观察到PHF8（一种含有K9Ac和K14Ac的H3K4me3肽）的PHD结构域的结合比仅H3K4me3的结合稍有减少(图2E） 我们推测组蛋白过乙酰化可能影响PHF8向靶基因启动子的募集。然而，使用H3K9ac、H3K14ac和H3K4me3特异性抗体的ChIP实验表明，PHF8与所有三种组蛋白标记阳性的基因相关(图S3B） ●●●●。这一结果表明组蛋白的超乙酰化并不影响PHF8与靶基因的结合，进一步支持了PHF8靶基因具有转录活性的观点。

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图3

PHF8结合TSS周围H3K4me3-阳性区域的靶基因

（A） 维恩图显示了人类神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中PHF8、H3K4me3和RNA pol II阳性基因的重叠和数量。

（B） PHF8（浅蓝色）和H3K4me2（深蓝色）峰与转录起始位点（TSS）之间的距离分布。

（C） 也被H3K4me3结合的PHF8核苷酸。

（D） XLMR基因的结合谱JARID1C公司，ZNF41型、和锌f81用于从ChIP-seq分析中获得的PHF8、H3K4me3和RNA pol II；根据hg18，染色体位置显示在面板顶部。Y轴表示顺序读取的数量。

（E） XMLR基因的qChIP分析JARID1C公司，ZNF41型、和ZNF81型在SH-SY5Y细胞中使用抗PHF8、H3K4me3、H3K9me2抗体和IgG对照。ChIP分析的富集度显示为输入的百分比。突触素基因编码的qChIP分析(SYP公司)使用PHF8、H3K4me3、H3K9me2和IgG（对照）抗体作为H3K9me2的阳性对照。误差条代表SD；n=3。

因为菲律宾法郎PHF8可能参与其他XLMR基因的调控。在SH-SY5Y细胞中，PHF8结合了许多已报道的XLMR基因。检测选定的XMLR基因JARID1C公司，ZNF41型、和ZNF81型支持在TSS站点周围的H3K4me3阳性区域定位PHF8(图3D） ●●●●。这些靶点通过qChIP（ChIP随后进行实时定量PCR）验证，显示PHF8和H3K4me3的结合(图3E） ●●●●。这些基因对RNA pol II也呈阳性，表明转录活跃(图3D） ●●●●。尽管这些基因在失活时的染色质甲基化状态未知，但所有基因都对H3K9me2呈阴性，这表明PHF8在消除这种抑制性染色质标记中可能发挥作用。PHF8和H3K4me3的共定位表明，PHF8通过在TSS处局部降低H3K9me2，发挥转录阳性调节器的作用。不幸的是，目前可获得的针对H3K9me2的抗体在ChIP分析中不是很有效，因此，它们在全基因组定位研究中不能可靠地工作（未发表的观察结果；Barski等人。，2007)。为了测试H3K9me2抗体在ChIP中的作用，我们发现H3K9 me2在突触素基因中富集(SYP公司)早前曾报道在SH-SY5Y细胞中H3K9me2阳性(Ekici等人。，2008)，而且重要的是，它不受PHF8的约束。这一结果表明，PHF8靶基因缺乏H3K9me2是由于缺乏标记。

PHF8与XLMR基因产物ZNF711结合

PHF8与所有H3K4me3阳性基因的结合缺失以及与H3K4me3阳性结合的差异性结合表明其他因素影响PHF8的募集。为了鉴定此类招募者/辅因子，我们通过串联亲和色谱纯化了PHF8相互作用蛋白。Flag-HA标记的PHF8在人TREX 293细胞中稳定表达，并通过Flag-和HA-亲和层析从核提取物中纯化相互作用蛋白(图4A） ●●●●。随后，通过质谱法鉴定了相互作用的蛋白质。在PHF8相关蛋白的亲和纯化中，一个单一蛋白ZNF711被特异性地高度富集。这个ZNF711型该基因位于Xq21.1-q21.2，编码一个功能未知的锌指蛋白。它包含一个氨基末端电位结构域，随后是12个连续的Zn-C2H2结构域，分别可能参与转录激活和序列特异性DNA结合(图4B） ●●●●。该基因主要在小鼠的部分大脑和视网膜中表达(图S4B） ●●●●。在人类中，该基因在神经组织中表达，在293细胞和神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中高度表达(图S4A） ●●●●。这些细胞株也表达高水平的PHF8(图S4C和S4D）。最近，ZNF711锌指区的突变被证明与PHF8突变的MR表型相似的患者的轻度精神发育迟滞有关(Tarpey等人。，2009)。然而，在这些患者中没有观察到与PHF8突变相关的唇腭裂表型。

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图4

PHF8与ZNF711相互作用

（A） PHF8复合物的Flag-HA串联纯化。293个细胞的Flag-和Flag-HA纯化复合物的银染SDS-PAGE分析。M、 分子量标记；F、 标记值；H、 通过HA-亲和层析进一步纯化标记物。用质谱法对洗脱后的物质进行整体分析。显示了用于单步Flag纯化或双Flag-HA纯化的PHF8和ZNF11肽的数量。

（B） ZNF711的示意图。显示了假定的激活域和ZNF，Cys-His锌指域。

（C） PHF8和ZNF711的免疫共沉淀。用表达载体pCMV-HA-PF8和pCMV-Myc-ZNF711转染或共转染Phoenix细胞，并使用针对HA标签或Myc标签的抗体进行免疫沉淀。沉淀物通过SDS-PAGE进行分析，然后使用针对Myc-tag或HA-tag的抗体进行免疫印迹。

（D） 内源性PHF8和ZNF711的免疫共沉淀。用所示的抗ZNF711和PHF8抗体对HEK293细胞进行裂解和免疫沉淀。沉淀物通过SDS-PAGE进行分析，然后使用抗ZNF711和PHF8抗体进行免疫印迹。

（E） 哺乳动物双杂交试验中PHF8和ZNF711的相互作用。将含有荧光素酶基因的pGAL-Luc报告质粒转染U2OS细胞，该基因由融合到五个上游GAL4结合位点的腺病毒E1B最小启动子（TATA）驱动，或与面板底部显示的表达结构共同转染。为了校正转染效率，所有检测都包括pCMV-lacZ，荧光素酶活性归一化为β-半乳糖苷酶活性。所有实验均一式三份，并至少重复三次。误差条表示SD；n=3。

（F） 用1.5、4.5和12.5μg重组PHF8单独培养和/或在1、3和9 ug重组ZNF711存在下培养组蛋白的脱甲基分析；底部面板显示分析中存在的组蛋白的Ponceau染色。中间的面板显示了用指示的抗体探测并通过免疫印迹进行测定的反应。

为了验证PHF8-ZNF711的相互作用，我们共表达了HA和Myc标记的PHF8和ZNF712，并通过共免疫沉淀分析了复合物的形成。如所示图4C、 HA-PHF8或Myc-ZNF711的免疫沉淀高度富集了其他因子，证实了相互作用。与这一发现一致，内源性ZNF711也通过抗PHF8从HEK293细胞中免疫沉淀，内源性PHF8通过抗ZNF712抗体免疫沉淀(图4D） ●●●●。这些结果表明ZNF711在体内与PHF8结合。此外，在哺乳动物双杂交试验中观察到这两种蛋白质之间的功能相互作用(图4E） ●●●●。这些分析中的强相互作用表明PHF8和ZNF711直接相互结合，ZNF712可能是PHF8招募者/辅因子。为了研究ZNF711对PHF8体外酶活性的影响，我们纯化了重组ZNF712(图S4E） 并将等摩尔量的PHF8滴定到组蛋白去甲基化分析中。与单独的PHF8相比，在分析中加入ZNF711导致去甲基化活性略有增加(图4F） ●●●●。虽然该分析的解释很复杂，部分原因是纯化PHF8的不稳定性和ZNF711的细微作用，但结果表明ZNF711-PHF8复合物在体内是活跃的。由于PHF8对核小体缺乏活性，PHF8与ZNF711在体外不催化核小体去甲基化(图S4F） ●●●●。

ZNF711与PHF8在一组PHF8靶基因上进行克隆

为了研究PHF8和ZNF711之间的相互作用在基因调控中的作用，我们生成了一种针对ZNF71l的特异性抗体，并基于960万序列读取，通过ChIP-seq分析获得了SH-SY5Y细胞中ZNF711DNA结合位点的全基因组图。检测到1875个结合峰，并使用hg18基因组数据库对TSS 1 kb内的基因进行注释，结果显示1204个峰对应1103个ZNF711阳性基因。ZNF711-和PHF8-结合基因之间的重叠为～80%，大多数（～97%）为H3K4me3阳性，如图5与PHF8类似，ZNF711将其靶基因绑定在TSS附近。此外，与ZNF711强结合的基因也与高水平的PHF8结合，并且这些蛋白显示重叠或紧密并列的结合区域(图5B） ●●●●。这些结果进一步支持了这两种蛋白质相互作用的发现。与PHF8相比，ZNF711仅与SH-SY5Y细胞中的许多XLMR基因结合JARID1C公司为了验证ZNF711的ChIP-seq图谱并确定染色质修饰，我们分析了ZNF711、PHF8的结合以及H3K4me3和H3K9me2的染色质状态JARID1C公司和两个得分很高的ZNF711目标C2或34和PCBP2型通过qChIP使用覆盖ZNF711结合区域的引物集(图5C） ●●●●。这些基因对ZNF711、PHF8和H3K4me3表现出高度富集，而未检测到H3K9me2甲基化，这表明PHF8在TSS去除该标记中发挥了作用。

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图5

PHF8与ZNF711在靶基因上的配体

（A） 文氏图显示了人类神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中ZNF711、PHF8和H3K4me3阳性基因的重叠和数量。

（B） ZNF711靶基因的结合谱贾里德1c，C2ORF34型、和PCBP2型通过ChIP-seq分析获得的ZNF711和PHF8；根据hg18，染色体位置显示在面板顶部。Y轴表示顺序读取的数量。

（C） ZNF711靶基因的qChIP分析JARID1C公司，C2ORF34型、和PCBP2型使用针对ZNF711、PHF8、H3K4me3、H3K9me2和IgG对照的抗体在SH-SY5Y细胞中进行检测。ChIP分析的富集显示为输入的百分比界限。

（D） ZNF711靶基因的qChIP分析JARID1C公司和C2ORF34型在使用抗ZNF711、PHF8、H3K4me3和IgG对照抗体的shRNA-介导ZNF71l敲除后，在HEK293细胞中进行检测。

（E） 实时RT-qPCR分析shRNA-介导的ZNF711和PHF8基因敲除后ZNF711-PHF8靶基因在HEK293细胞中的表达。

误差条代表SD；n=3。

为了了解ZNF711是否参与PHF8向靶基因的募集，我们使用shRNA下调了293细胞中ZNF71l的表达，并分析了ZNF711+PHF8与靶基因的结合JARID1C公司和C2或34如预期，ZNF711和PHF8的结合都减少了。此外，H3K4me3的水平降低，进一步支持复合体在活性转录中的作用。未观察到PHF8与分析基因位点结合减少后H3K9me2水平增加。此外，H3K9me2水平与JARID1C公司和C2ORF34型转录起始位点下游500 bp和上游1000 kb在击倒PHF8后H3K9me2水平没有显著增加(图S5A） ●●●●。如下所示，PHF8同系物秀丽线虫F29B9.2去甲基化H3K9me2和H3K27me2，因此，我们测试了PHF8的敲除是否会影响目标基因的H3K17me2水平，即使PHF8在体外和体内实验中没有表现出对该标记的活性。H3K27me2 ChIP实验没有导致H3K17me2在转录起始位点的水平有任何可检测的增加贾里德1c和C2ORF34型击倒PHF8时(图S5B） ●●●●。为了测试与其他两个相关的PHF8同源物PHF2和KIAA1718的冗余是否可以解释靶基因启动子处H3K9me2水平缺乏变化，对所有三个基因进行了RNAi实验。在PHF8靶基因上PHF8、PHF2和KIAA1718表达水平的单一或联合下调后，我们没有观察到对H3K9me2水平的任何影响JARID1C公司和C2ORF34型(图S5C和S5D）。

为了测试ZNF711和PHF8的下调是否会导致靶基因转录的改变，我们在shRNA介导的ZNF711-PHF8表达下调后，通过qPCR检测了9个不同ZNF711/PHF8靶基因的表达。如所示图5E、 在293个向ZNF711或PHF8表达shRNAs的细胞中，所有测试的靶基因的表达都显著降低(图5E） ●●●●。在siRNA介导的PHF8表达抑制后，SH-SY5Y细胞中也观察到ZNF711-PHF8靶基因表达水平的类似下降(图S5F） ●●●●。相反，我们没有观察到抑制PHF2和KIAA1718表达对PHF8靶基因的任何影响(图S5E） ●●●●。

PHF8和ZNF711抗体的制备

用亲和纯化昆虫细胞产生的GST-PHF8（氨基酸1-548）或细菌表达的GST-ZNF711（氨基酸1-358）免疫兔子，产生多克隆抗体。抗体被GST-偶联氰溴化物活化的Sepharose（GE Healthcare）吸附，随后使用Sepharose-（GE Hearthcare，GE Health）偶联GST-PHF8或GST-ZNF711进行亲和纯化。抗体特异性通过免疫印迹和免疫沉淀进行检测和确认。

脱甲基分析

有关重组蛋白的生成，请参阅补充实验程序小牛胸腺组蛋白（Sigma-Aldrich）或合成组蛋白H3肽（ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPATGVKKPHR-YC-Ttds-K-生物素；德国JPT）在K9或K27位置单、二或三甲基化，与纯化的Flag-His-PHF8、GST-PHF8（氨基酸1-548）孵育或Flag-His-cePHF8在37°C的脱甲基缓冲液（50 mM HEPES-KOH[PH7.7]，250 mM NaCl，1 mM MgCl）中放置60分钟₂，1 mMα-酮戊二酸，40μM硫酸亚铁₄和2mM抗坏血酸）。反应混合物通过使用特定抗体（如补充实验程序)或质谱。为了进行质谱分析，将4微克重组GST-PHF8与2.5μg H3K9me3、H3K9-me2、H3K9me1或H3K27me3肽在去甲基缓冲液中以90μl的最终体积在37°C下孵育30分钟。如前所述，对反应混合物进行分析(Christensen等人。，2007).

我们感谢乌拉·托夫特加德（Ulla Toftegaard）提供的专家技术援助，以及迈克尔·李（Michael Lees）对免疫荧光数据定量分析的帮助。我们感谢Thomas Jenuwein慷慨赠送H3K9me2抗体。我们还感谢国家生物资源项目秀丽线虫（日本）生产电话：3713突变株和Massimo Hilliard用于帮助转基因动物。我们感谢Helin实验室成员的技术建议和支持。I.A.得到了EMBO长期奖学金的支持。J.R.是Wellcome信托基金会的高级研究员。威廉·约翰森中心由丹麦国家研究基金会和伦德贝克基金会支持。O.G.由NIH R01 GM079641支持。A.E.S.和K.H.得到哥本哈根大学卓越计划的支持，Helin实验室的工作得到了丹麦癌症协会、伦德贝克基金会、诺和诺德基金会、丹麦医学研究委员会和丹麦国家研究基金会的资助。K.H和J.C.是EpiTherapeutics Aps的联合创始人，K.H也是其董事会和科学咨询委员会的成员。