细胞内转运涉及不同囊泡内货物的通过和分类，囊泡由细胞器特异性Rab GTPase蛋白标记(1). 在内吞途径中，早期内体以小GTPase Rab5、早期内体抗原EEA1和PI3KC3为特征(2——4). Rab5调节早期内体的同型融合。这些早期的内吞体随后成熟为晚期内吞体，以进行溶酶体降解或加工(5). 了解内体成熟的分子机制具有临床意义，因为许多细菌（例如。，结核分枝杆菌)和病毒（如HIV）干扰吞噬溶酶体或内溶酶体的成熟，以避免在溶酶体中被清除(6).
早期到晚期的内体转变始于Rab7的激活和募集到携带Rab5的早期内体的亚结构域，随后Rab5从同一囊泡移位(5,7)或内体裂变，形成晚期内体靶向运输囊泡(8). Rab7的激活是内体成熟所必需的。然而，关于Rab7激活是如何控制的，我们知之甚少。
作为一种小GTPase，Rab7通过在非活性构象（即GDP结合构象）和活性构象之间循环来调节膜转运。C-VPS/HOPS类（同型融合和空泡蛋白分选）复合物是Rab7的鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）(9). 全球环境基金促进GDP-GTP过渡，导致Rab7激活。活性GTP结合的Rab7与Rab7效应器结合，并在囊泡栓系、对接和融合中执行其功能(10,11). GTPase激活蛋白（GAP）使Rab7失活，刺激从GTP结合形式转换为GDP结合形式(12,13). C-VPS/HOPS复合物也是活性GTP-结合Rab7的主要下游效应物(14). 最近的证据表明，该复合物受到PI3KC3成分UVRAG的正调控(15)这在PI3KC3和Rabs之间提供了一个有趣的联系，两者对内体成熟都至关重要。
我们和其他人最近纯化了一种PI3KC3全复合物，包括hVPS34、p150、Beclin 1、UVRAG和Barkor/Atg14（L）(16——20). PI3KC3形成两个相互排斥的蛋白质亚复合物，定位于自噬体或内体并执行不同的功能。自噬复合体由PI3KC3核心复合体（hVPS34、p150和Beclin 1）和Barkor/Atg14（L）组成。Barkor/Atg14（L）是新生自噬体亚复合物的靶向因子(16——20). 内体复合体由PI3KC3核心复合体和UVRAG组成。UVRAG-正向调节PI3KC活性，可能通过其与C-VPS/HOPS的直接相互作用而为自噬体和内体成熟所必需(15,21). 内胚体复合体还含有Rubicon（Run域蛋白作为Beclin 1相互作用和富含半胱氨酸），它是自噬体成熟的负调控因子(18,19). 尽管有人认为Rubicon在内体成熟中起着负面作用，但这一功能仍存在争议。
在这里，我们报告了潞碧垦是内体成熟过程中的一个关键负调控因子，活性Rab7可对抗这种抑制。Rubicon在Rab5阳性早期内体和来自C-VPS/HOPS的隔离物UVRAG上高度富集。活性GTP结合的Rab7竞争Rubicon结合并释放UVRAG。该释放促进UVRAG-C-VPS/HOPS之间的复合物形成，以进一步激活Rab7。这些事件触发并放大了早到晚的内体成熟。
结果
潞碧垦通过其C终端与Rab7互动。
我们最近在人类骨肉瘤U中使用Beclin 1作为诱饵鉴定了Beclin 1/PI3KC3复合物2OS细胞(16). 该复合物由PI3K催化亚基hVps34、p150调节亚基、UVRAG和Barkor/Atg14（L）组成。在同一个复合体中，也发现了潞碧垦（也称为p120或Baron）(16,18——20). Rubicon含有972个氨基酸，具有一个可识别的RUN结构域（以RPIP8/UNC-14/NESCA命名），由一组与小GTP酶相互作用的蛋白质共享(22——24).
鉴于Rubicon的RUN结构域以及Rab5和Rab7在内体成熟中的重要性，我们测试了Rubicons是否与Rab家族相互作用。Rab7，但不是Rab5，与Rubicon共沉淀(). 众所周知，潞碧垦与PI3KC3复合体中的UVRAG相关(18,19)，我们研究了Rab7是否与UVRAG在同一蛋白复合体中共存。UVRAG与Myc-tagged hVps34、Beclin 1、Vps16（C-VPS/HOPS复合物的一种成分）、Rab7和Rubicon共免疫沉淀。UVRAG始终与PI3KC3组件相互作用，包括Vps34、Beclin 1和Rubicon(). UVRAG也与Vps16相关(). 然而，在该共免疫沉淀试验中未检测到Rab7-UVRAG相互作用。因此，Rab7和UVRAG与潞碧垦形成不同的复合物。
潞碧垦通过其C末端与Rab7相互作用。(A类)潞碧垦与Rab7互动，但与Rab5没有互动。Rubicon-Flag载体与Rab5-Myc（1–3道）或Rab7-Myc载体（4–6道）共转染。将整个293T细胞裂解物（第1和第4道）用抗Flag抗体（第3和第6道）或对照IgG（第2和第5道）免疫沉淀，然后用Rubicon的抗Flag抗体和Rabs的抗Myc抗体免疫印迹。(B类)潞碧垦在不同的复合物中与UVRAG和Rab7相互作用。Myc标记的Vps34、Beclin 1、Vps16、Rab7和Rubicon在HEK293T细胞中表达，并用抗Myc抗体进行免疫沉淀（IP）。通过免疫印迹（IB）检测结合组分（B）和输入组分中的蛋白。(C类)Rubicon的CT域是Rab7绑定所必需的。将表达HA标记Rab7的载体与EGFP-Rubicon-Flag（WT）载体或表达不同突变体的载体共转染，然后用抗HA抗体（Rab7）进行免疫沉淀，并用所示抗体进行免疫印迹。
我们进一步细化了Rubicon和Rab7之间的相互作用域。产生了一系列的潞碧垦缺失突变体，包括缺乏全长潞碧垦RUN、FYVE-like或线圈域（CCD）的突变体。我们还创造了三个含有RUN、CCD或FYVE样结构域的大多肽片段(). 通过Rab7免疫沉淀分析评估这些突变体与Rab7的相互作用。全长Rubicon，而不是单独的载体，与Rab7相互作用(，车道1–2）。RUN和CCD域对于Rab7相互作用是不必要的(，车道3–4和6–7），而需要C端（CT）区域（aa 880–972）(，车道5）。含有CT结构域的Rubicon（aa 600–972）的较大C末端区域足以使Rubicons与Rab7相互作用(，泳道8）。
潞碧垦优先绑定到GTP-Bound Rab7。
Rab7通过在非活性构象（即GDP-结合构象）和活性构象之间循环调节膜转运(25,26). 然后我们测试了Rab7的鸟嘌呤核苷酸循环是否对其与潞碧垦的相互作用至关重要。293T细胞的免疫共沉淀实验显示，Rubicon与WT Rab7结合。Rab7与组成活性GTP结合的Rab7 Q67L突变体蛋白的结合相对较强，与GDP结合的Rab7 T22N突变体蛋白结合较弱(). 为了进一步证实GTP-负载的Rab7与潞碧垦结合，我们在存在过量非水解GTP（GTP-γ-S）或GDP（GDP-β-S）的情况下进行了联合免疫沉淀实验。GDP（GDP-β-S）而非GTP（GTP-γ-S）的负荷降低了Rab7-Rubicon相互作用(图S1). 这些结果表明，Rubicon能够优先以GTP结合形式而不是GDP结合形式与Rab7结合。
潞碧垦优先与GTP结合的Rab7结合。(A类)潞碧垦在体内与GTP结合的Rab7结合。将Rubicon-Flag载体与表达Rab7-WT、GTP-bounded Rab7 Q67L突变或GDP-bound Rab7 T22N突变的Rab7-Myc载体共转染HEK293T细胞，然后用抗Myc抗体（Rab7）进行免疫沉淀并用所示抗体进行免疫印迹。(B类)Rab7与Rubicon和p150发生差异性相互作用。纯化的重组HA标记的Rab7（0.1μM）与重组标记的p150、Vps34、Beclin 1、UVRAG、Barkor/Atg14（L）或Rubicon（0.1μM）在使用HA亲和珠的体外下拉试验中孵育。结合蛋白和输入蛋白用抗Flag或HA抗体检测。(C类)潞碧垦直接结合GTP结合的Rab7。用HA亲和珠与重组HA标记的Rab7 WT、T22N或Q67L突变蛋白（0.1μM）预结合的HA亲和小球培养重组全长标记的p150、Vps34或Rubicon（0.1μM）。结合蛋白用7.5%SDS/PAGE进行解析，并用抗Flag抗体进行Western blot分析。
为了以核苷酸依赖的方式测试Rab7和潞碧垦之间的直接相互作用，我们表达并纯化了重组HA-标记的Rab7 WT、Q67L和T22N突变体，这些突变体来自大肠杆菌(图S2A类). 我们还从杆状病毒感染的昆虫细胞或哺乳动物细胞中表达并纯化了重组全长标记Vps34、UVRAG、Beclin 1、Barkor/Atg14（L）和Rubicon(图S2B类)，并评估其与Rab7的结合。然后，我们对所有纯化成分进行了下拉分析，观察到p150和潞碧垦，而不是其他PI3KC3成分，直接与Rab7结合(). 我们进一步测试了不同形式的Rab7蛋白与p150和Rubicon的结合。p150与WT Rab7的结合被清楚地检测到(). p150与GDP结合的Rab7 T22N结合较弱；基本上没有观察到p150与GTP-结合的Rab7 Q67L突变体结合(). 该结果与已发表的p150优先与无核苷酸Rab7相互作用的观察结果一致(27). 与p150相比，潞碧垦优先与GTP结合的Rab7相互作用()这表明它可能通过直接相互作用发挥Rab7效应器的作用。
Rab7与UVRAG竞争Rubicon绑定。
潞碧垦在不同的蛋白质复合物中与UVRAG和Rab7相互作用(). 我们推测Rab7，尤其是GTP结合形式，可能会与UVRAG竞争Rubicon结合。因此，我们过度表达UVRAG，以测试其对Rubicon–Rab7相互作用的影响。UVRAG过度表达显著降低了用Rubicon拉下的Rab7或Rab7免疫沉淀的Rubicon-共沉淀量(). 相反，Rab7过度表达也损害了免疫沉淀分析中UVRAG–Rubicon的相互作用(). 这些结果表明，Rab7和UVRAG在体内与潞碧垦竞争相互作用。为了测试Rab7是否以核苷酸依赖的方式与UVRAG竞争Rubicon结合，表达了Rab7 WT、GDP-结合T22N突变体或GTP-结合Q67L突变体蛋白，并测试了它们对Rubicon-UVRAG相互作用的影响。GTP结合的Rab7 Q67L突变体与UVRAG竞争Rubicon结合，比GDP结合的Rab7 T22N突变体更有效(). 因此，我们得出结论，GTP-结合的Rab7在体内与UVRAG竞争Rubicon结合。
GTP结合的Rab7与UVRAG竞争Rubicon结合。(A类)UVRAG的过度表达损害了Rab7-Rubicon相互作用。不同浓度的UVRAG在HEK293T细胞中过度表达(顶部)，并用抗Rab7抗体对所得细胞裂解物进行免疫沉淀(中间)或抗潞碧垦抗体(底部). 然后在Rab7或Rubicon免疫复合物中检测所示蛋白。Rubicon和Rab7的标准化结合被量化为结合/输入的相对比率（B/I）。对照细胞中的B/I设置为1.0。(B类)Rab7的过度表达降低了UVRAG–Rubicon相互作用。Rab7在HEK293T细胞中表达。然后用抗潞碧垦抗体对所得细胞裂解物进行免疫沉淀。对结合组分和输入组分进行检测，以确定所示的蛋白质。(C类)GTP–Rab7在体内与Rubicon和UVRAG竞争。表达不同形式的Rab7（WT、T22N、Q67L），并用抗UVRAG抗体免疫沉淀产生的细胞裂解物。对所示蛋白质的结合和输入进行了探测。(D类)重组纯化GST标记的Rab7 WT及其突变体大肠杆菌用10%SDS/PAGE进行分析，然后用考马斯蓝染色。(E类)Rubicon、UVRAG和不同形式Rab7之间的体外竞争。Rubicon-Flag-His（0.1μM）首先与Ni柱结合，然后与UVRAG-Flag（0.1μM）孵育，形成Rubicon–UVRAG复合物。不同浓度（0.1、0.5、2μM）的Rab7蛋白与Rubicon–UVRAG复合物孵育。结合蛋白用抗Flag和抗Rab7抗体进行Western blotting分析。
我们进一步测试了Rab7和UVRAG在体外对Rubicon结合的直接竞争。我们表达并纯化了重组全长GST标记的Rab7 WT、GDP-结合的T22N突变体和GTP-结合Q67L突变体蛋白大肠杆菌()并在纯化系统中用预先组装好的Rubicon–UVRAG复合物培养这些蛋白质。Rab7 Q67L突变体与UVRAG–Rubicon相互作用的竞争效率最高，而与GDP结合的Rab7 T22N对这种相互作用几乎没有影响(). 该分析通过提供Rab7以核苷酸依赖的方式与UVRAG竞争Rubicon的直接证据，支持了我们之前的数据。
Rubicon在Rab5修饰的早期内切体上高度富集。
为了探讨潞碧垦在内体组织中的潜在作用，我们研究了其在人U型骨肉瘤中的亚细胞定位2稳定表达Flag-Rubicon的OS细胞。我们生成了一个在多西环素控制下诱导表达Flag-Rubicon的细胞系。当极低剂量的多西环素（1 ng/mL）诱导Flag Rubicon表达时，检测到Flag Rubicon的水平与内源性Rubicon相当(图S3A类). 生理水平上表达的Flag-Rubicon与早期内体标记物EEA1、UVRAG和FYVE2有显著重叠(图S3B类). 然后，我们在表达Rubicon的细胞中测试了Rubicon-与Rab7的共定位。在生理水平上表达Rubicon的细胞中，只能观察到Rubicon和Rab7之间的有限共定位。在Rubicon和非活性Rab7 T22N GDP-结合形式之间未检测到共定位(图S3C类). Rab7与Rubicon的共定位仅在表达组成型活性GTP结合的Rab7 Q67L形式时才明显(图S3C类)或者Rubicon被高水平表达(图S3D类). 该观察结果与我们的体外结合结果一致，即潞碧垦优先与活性GTP结合的Rab7结合。
接下来，我们将Rubicon与Rab5和两个Rab5突变体（GDP-结合S34N和GTP-结合Q79L）在生理水平上的定位进行了比较。Rubicon和Rab5共培养的细胞内(,顶部)在大细胞点状结构中，Rubicon与Rab5显著重叠。大多数潞碧垦信号在Rab5附近共定位或被检测到。然而，Rubicon punta与GDP-bound S34N形式的Rab5没有重叠(,中间). Rab5 GTP-结合的Q79L突变体的表达刺激早期内体的同型融合并导致大环状膜结构的形成(28). 在获得Rab7后，这些扩大的内体被认为在内体成熟的收敛点处停滞，因为Rab5不能被低效的GTP水解所取代(5,8,29). 在表达Rab5 Q79L的细胞中，潞碧垦在Rab5阳性的大环状早期内胚体结构的亚结构域中高度富集(,底部). 这些数据表明，Rubicon定位于扩大的早期内体和成熟内体的亚结构域。
Rubicon定位于成熟的早期内体。(A类)Rubicon定位于成熟的早期内体。U型2表达Rubicon-Flag的OS细胞转染GFP-Rab5-WT、GFP-Rap5-S34N或GFP-Rab 5-Q79L，并在荧光显微镜下观察。用Cy3-结合M2抗体标记Rubicon-Flag。（比例尺：5μm）Rab5 Q79L表达细胞的框架区域扩大(底部). (B类)Rab7 GTP结合形式破坏了Rubicon–UVRAG的重叠。模拟转染：GDP结合的Rab7 T22N或GTP结合的Rab7 Q67L与GFP–UVRAG和Rubicon-Flag在U2OS细胞。在荧光显微镜下观察UVRAG（绿色）和Rubicon（红色）的亚细胞定位。(C类)对UVRAG和Rubicon阳性的细胞点状点的数量进行计数并绘制B类.
为了证实Rab7在体内与UVRAG竞争Rubicon结合，我们表达了GTP结合的Rab7 Q67L或GDP结合的Rab7 T22N，并评估了它们对Rubicon-和UVRAG-共定位的影响(,顶部、和). GDP-结合的Rab7 T22N表达后，这两种蛋白的共定位没有改变(,中间、和)，但在GTP-结合的Rab7 Q67L表达后显著降低(,底部、和). 这进一步支持了我们的假设，即Rab7 GTP结合形式与Rubicon与UVRAG结合竞争。
潞碧垦从C-VPS/HOPS中分离UVRAG并阻断Rab7激活。
UVRAG与C-VPS/HOPS相互作用并激活其GEF活动，导致Rab7激活(15). 我们推测，潞碧垦从C-VPS/HOPS中隔离UVRAG并阻断Rab7激活。我们在Rubicon RNAi缺失细胞中测试了UVRAG-Vps16（C-VPS/HOPS成分）相互作用。在没有潞碧垦的情况下，UVRAG和Vps16之间的相互作用显著增加(). 相反，在Rubicon过度表达的细胞中，与UVRAG共沉淀的Vps16更少(). 这表明，潞碧垦能够从C-VPS/HOPS相互作用中隔离UVRAG。
Rubicon从C-VPS/HOPS中隔离UVRAG，并负调控Rab7的激活。(A类)Rubicon耗竭促进UVRAG和C-VPS/HOPS之间的相互作用。Rubicon WT或敲除（KD）U的细胞裂解物2用抗UVRAG抗体免疫沉淀OS细胞。检测到指示的蛋白质。(B类)Rubicon过表达降低了UVRAG与C-VPS/HOPS的结合。用Rubicon-Myc或单独载体转染HEK293T细胞。用抗UVRAG抗体免疫沉淀细胞裂解物。检测到指示的蛋白质。(C类)潞碧垦枯竭刺激Rab7-RILP相互作用。在由WT或Rubicon RNAi缺失细胞制备的细胞裂解液中，对Rab7进行免疫沉淀，并对产生的免疫复合物进行Rab7和RILP检测。收集前用3-MA（10 mM）处理Rubicon WT和耗尽细胞8小时。(D类)潞碧垦枯竭促进Rab7–Vps41相互作用。在由WT或Rubicon RNAi缺失细胞制备的细胞裂解液中，对Rab7进行免疫沉淀，并对产生的免疫复合物进行Rab7和Vps41的检测。
我们假设Rubicon从C-VPS/HOPS相互作用中螯合UVRAG以阻断Rab7的激活。如果这是真的，潞碧垦耗竭应导致Rab7激活，这可以通过活性GTP-结合的Rab7和Rab7效应器之间的增强相互作用检测到。为了验证这一假设，我们检测了Rab7和一种众所周知的Rab7效应器RILP（Rab-interacting溶酶体蛋白）之间的相互作用(30). RILP与GTP-bound Rab7特异性相互作用；与Rab7共沉淀的RILP的量可以反映Rab7的GTP结合和活化。在缺乏Rubicon的细胞中，Rab7和RILP之间的联系显著增加()表明Rab7被激活。然而，也有可能Rubicon的丢失释放了更多GTP-结合的Rab7用于RILP结合，而不是Rab7激活。为了测试这种可能性，我们在WT和缺乏Rubicon的细胞中表达了一个组成活性的GTP结合Rab7 Q67L突变体。Rab7 Q67L与RILP强烈结合，但在缺乏Rubicon的细胞中未观察到进一步增加，而在缺乏Rubincon的情况下，Rab7–RILP相互作用明显增加(图S4A类)进一步支持了这样一种观点，即在没有潞碧垦的情况下，GTP-bound Rab7的生成可能受到上调。
Rab7与另一个Rab7效应器Vps41之间的相互作用(14)，也进行了调查。在缺乏Rubicon的细胞中，Rab7和Vps41之间的相互作用显著增加(). Rubicon缺失细胞中Rab7–Vps41和UVRAG–Vps16之间增加的相互作用可以通过RNAi抗性Rubion的互补有效抑制(图S4B类)，不包括RNA干扰的离靶效应。此外，Rubicon的过度表达导致Vps41–Rab7相互作用减少(图S5). 因此，Rubicon通过C-VPS/HOPS抑制Rab7激活，这可以通过Rubicon-缺陷细胞中Rab7和Rab7效应器之间的相互作用增加来说明。在缺乏Rubicon的细胞中，Rab7从核周区移位到胞质点状突起，进一步支持了这一结论(图S6).
由于UVRAG通过与Beclin 1的相互作用而成为PI3KC3的成分(21)，我们还研究了潞碧垦是否从Beclin 1中隔离UVRAG。有趣的是，在Rab7或Rubicon过度表达的情况下，UVRAG与Beclin 1或Vps34之间的相互作用在很大程度上不受影响(图S7)，表明UVRAG-Beclin 1相互作用和UVRAG-Rubicon相互作用之间没有竞争，这与这三种蛋白质在同一蛋白质复合体中共存一致(16,20). 为了测试红细胞缺失细胞中Rab7的激活是否依赖于PI3KC3的活性，用PI3KC2抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）处理红细胞缺失的细胞。3-MA处理对Rab7–RILP相互作用没有影响()表明Rab7以PI3KC3非依赖性方式激活。
潞碧垦控制内分体成熟和内分泌物降解。
潞碧垦从C-VPS/HOPS结合中隔离UVRAG并阻断Rab7激活。鉴于Rab7在内体成熟中的重要作用，因此我们预计Rubicon在内吞降解途径中会发挥负面作用。我们监测了Rubicon耗竭细胞中表皮生长因子受体（EGFR）的内吞降解。EGF用于刺激EGFR激活和随后的降解。与在Rubicon WT细胞中观察到的情况相比，在缺乏Rubicon-的细胞中，EGFR降解加快(). 在Rubicon过度表达细胞中也测试了EGFR降解。在Rubicon过度表达的细胞中，EGFR转换显著减缓(). 这些数据进一步证实了潞碧垦对EGFR降解的负调控。
Rubicon的耗竭通过内吞途径改变EGFR的降解。(A类)在缺乏Rubicon的细胞中EGFR降解加速。在Rubicon RNAi缺失的293T细胞中检测EGFR的降解。细胞在仅含DMEM的培养基中无血清培养10 h，然后添加200 ng/mL EGF以启动EGFR降解。在指定的时间点收集细胞，并通过Western Blotting检测EGFR水平。(B类,D类、和F类)EGFR水平A类,C类、和E类用荧光成像仪定量，并通过计算初始受体含量的百分比进行归一化。(C类)在Rubicon过表达细胞中测试EGFR降解。(E类)在单独表达载体Rubicon WT或Rubicon-ΔCT的Rubicon-deficied 293T细胞中检测EGFR降解。(G公司)EGFR积聚在Rubicon过度表达细胞的大液泡中。在U方向2单独表达载体或Rubicon的OS细胞，用抗EGFR抗体免疫染色检测内源性EGFR定位。（比例尺：5μm）(H（H）)计算并绘制细胞中直径大于800 nm的液泡数量(G公司).
我们用Rubicon WT或突变形式的各种抗RNAi cDNA来补充Rubicon-敲除细胞，并监测EGFR的降解。WT潞碧垦能够挽救加速的EGFR降解，而单独载体却不能(). 重要的是，破坏与Rab7相互作用的Rubicon CT缺失突变()未能补充潞碧垦缺陷(). 此外，在潞碧垦过度表达细胞中，EGFR积聚在大液泡中(). 这些结果表明，Rab7相互作用对于Rubicon在内吞降解中的功能是不可或缺的。
讨论
在本研究中，我们证明了潞碧垦在内吞运输中的关键作用，即通过调节Rab7和UVRAG来控制内体成熟。一些证据支持这一结论。首先，潞碧垦与Rab7和UVRAG以互斥的方式相互作用。Rubicon与UVRAG结合，并将其与C-VPS/HOPS复合物隔离。此外，GTP结合的Rab7选择性地与潞碧垦相互作用，并与UVRAG–潞碧垦结合竞争，后者反过来激活Rab7上的C-VPS/HOPS活性。最后，潞碧垦的枯竭促进Rab7激活和EGFR的内吞降解。因此，潞碧垦作为Rab7效应器负向调节Rab7激活和内体成熟(图S8).
我们已经确定GTP结合的Rab7从Rubicon螯合物中释放UVRAG。UVRAG的释放有两个后果(图S6). 首先，释放的UVRAG结合并激活C-VPS/HOPS(15). 此外，鉴于UVRAG对PI3KC3具有正向调节作用，PI3KC2活性可能受到影响(21). 如果是这样，我们预计活性Rab7可以刺激PI3KC3活性。有趣的是，过表达的Rab7能够刺激PI3KC3并部分补偿PI3KC3缺乏(27)，支持这个想法。建议p150与Rab7相互作用以实现此功能。然而，p150优先与一种不活跃的无核苷酸形式结合，而不是与活性GTP结合的Rab7形式结合(27)，我们也证实了这一点(). 这一观察结果很难解释Rab7对PI3KC3激活的刺激作用。我们的研究提供了另一种模型，在该模型中，GTP-结合的Rab7消除了Rubicon对UVRAG的隔离，并允许UVRAG-激活PI3KC3(图S8).
UVRAG和Rubicon不仅在内体成熟中起关键作用，而且在自噬体成熟中也起关键作用(18,19). 新的证据表明，内吞蛋白也参与自噬调节(31,32). 自噬体形成后，它们与内涵体融合形成两质体，最终与溶酶体融合，或直接与溶酶体融合形成自溶体。在肝细胞中，形成的两性体数量是自体溶酶体的五倍多(33)这表明与内吞小泡的融合可能构成自噬体成熟的主要部分，至少在某些细胞类型中是如此。由于ESCRTIII的参与，内切体与自噬体成熟有关(34,35)和COPI(36)在自噬调节中。在这项研究中，我们提供了一个连接PI3KC3、自噬和内吞的分子链，其中潞碧垦是关键的负调控因子。
总之，潞碧垦作为Rab7效应器，负向调节内体成熟。对这种分子开关的解剖将为深入了解内吞和自噬途径的机制提供重要的信息。这些信息对于开发针对自噬和内吞降解途径功能障碍导致的多种人类病理状况的新型治疗工具至关重要。
