高通量联合测序可识别NUBPL公司和FOXRED1系列人类复合物I缺乏

CI患者先前已知和新发现的变异基因分型

我们的下一个目标是对每个患者样本中发现的“可能有害”变异以及之前已知的疾病变异进行基因分型(补充表4和方法）。基因分型有多种用途。首先，有必要从共用发现屏幕验证新变体。其次，它使我们能够搜索之前已知的CI缺乏的突变，这些突变由于缺乏能量而没有在我们的发现屏幕中检测到（例如mtDNA变体）。第三，它允许我们将变体分配给单个患者。

在新发现的“可能有害”变体中，我们验证了84%的高置信度变体，正如预期的那样，只有11%的低置信度变体(补充表4). ‘根据101个额外的高置信度变异基因型，不太可能有害的变异具有较高的96%验证率(补充表4). 由于Sequenom基因型对极为罕见的变异的假阳性率估计为11%，因此我们使用Sanger测序进一步验证了特别感兴趣的SNV(补充说明). 在我们识别出感兴趣的杂合变异体的一个子集中，我们使用桑格测序法对基因进行完全重测序。

总的来说，我们验证了151种“可能有害”的患者变异，对应于115个独特的基因座（91个高置信度，12个低置信度，和12个在发现筛选中遗漏的致病性变异）。详细数据见补充表2我们发现，与欧洲对照组相比，我们的患者队列中“可能有害”变体的频率更高，尽管这种富集可能是由于血统差异所致(补充说明).

CI患者中新发现的突变等位基因

有了Mito10K序列数据，我们接下来在60名未确诊患者的队列中寻找纯合子、复合杂合子和致病性mtDNA变体(图3). 我们预计许多患者在已知的疾病相关基因中会有纯合子或两个杂合子变体，这与隐性遗传一致。我们将这些变体称为“隐性型”。

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图3

60名CI缺乏症患者，之前未经基因诊断，按每个基因检测到的“可能有害”变体类型进行分类。红色表示可能存在致病性变体的患者，蓝色表示存在显著性不确定变体（VUS）的患者，灰色表示没有“可能有害”变体的患者。方框中列出了每个患者中包含“可能有害”变体的基因。黑色三角形表示新的实验确定的基因诊断。^{a、 b条}指出受影响的兄弟姐妹对。

只有3名患者之前报告过致病性线粒体DNA突变，只有8名患者在已知疾病基因中有隐性突变，包括5个新突变和2个先前报告的突变(表3). 有趣的是，2名患者的候选疾病基因存在隐性突变(NUBPL、FOXRED1) (表3). 其余患者包括3名临床意义不明的线粒体DNA“可能有害”变异，17名临床意义未知的杂合子“可能有害的”核变异，27名无“可能有害“变异(补充表2).

在已知疾病基因中建立11个患者诊断

接下来，我们评估了3例mtDNA突变患者中检测到的变异体的致病性ND3号机组²⁵,ND5型²⁶、和MT-TW公司²⁶)以及之前报道的CI疾病基因中具有隐性变异的8名患者：NDUFS4型^10,27–31,NDUFAF2型¹⁷,NDUFV1型³²、和NDUFS8型³³(表3). 除下文所述外，所有其他患者和已测序的HapMap样本中均未发现患者突变。

我们确定了一部小说和两部之前报道的小说NDUFS4型3例Leigh综合征患者的基因突变(表3和补充图4). 兄弟姐妹DT37和DT38是报告突变c.462delA的复合杂合子（p.K154NfsX34）³⁰和c.99-1G>A（p.S34IfsX4）¹⁰无血缘关系的患者DT107是同一c.99-1G>A突变和一个新突变c.351-2A>G的复合杂合子，分别遗传自其父亲和母亲。生物信息学RT-PCR分析表明，c.99-1G>A和c.351-2A>G突变均改变NDUFS4型拼接。DT107基因组DNA中检测到杂合c.351-2A>G突变，但在cDNA+/-环己酰亚胺（CHX）中未检测到该突变，表明mRNA高度不稳定。对DT38和DT107患者的成纤维细胞进行Western blot分析，未检测到NDUFS4蛋白。这是关于c.99-1G>A突变的第二次报道¹⁰和第三个c.462delA突变^28,30不仅仅是暗示NDUFS4型显示了Leigh综合征的复发突变，但该基因中可能存在一些以前未被识别的创始突变。

我们还发现了新的纯合突变NDUFAF2型3名Leigh综合征患者(表3和补充图5). 一名近亲患者DT16在6.3Mb纯合子区域（由Affymetrix 250K确定）内含有纯合c.221G>A突变（p.W74X）标准普尔SNP芯片）。兄弟姐妹DT67和DT68携带纯合子c.103delA突变（p.I35SfsX17）。患者成纤维细胞的cDNA分析表明NDUFAF2型含有这些突变的转录本是稳定的。此外，DT16的c.221G>A无义突变（位于外显子3的4bp处）导致外显子2偶尔跳跃，这也产生了一个编码截短蛋白的转录物（p.A73GfsX5）。通过western blot分析，所有三名患者均缺乏任何可检测到的NDUFAF2蛋白，这表明截短的蛋白产物是不稳定的。

一种新型纯合子NDUFV1型突变（c.1129G>A，p.E377K）在2.1Mb纯合子区域被鉴定（由Affymetrix 250K测定标准普尔SNP芯片）在一名患有致命婴儿线粒体疾病（LIMD）的黎巴嫩血缘患者DT3中(表3和补充图6). 未受影响的父母都是杂合携带者。这种突变在铁硫结合位点（pfam10589）的共识基序中引入了一个带正电的残基，该位点在真核生物物种中高度保守。

我们发现了一种新的纯合子NDUFS8型苏丹DT61患者线粒体脑病突变（c.460G>A，p.G154S）(表3和补充图7). 这种突变影响一种高度保守的氨基酸，并改变高度保守的Fer4 4Fe-4S铁硫簇结合域（pfam00037）内的极性。该突变与该家族的疾病分离，受影响的兄弟姐妹也是纯合的，而未受影响的父母都是杂合携带者。

潜在CI缺乏的新基因：NUBPL公司和FOXRED1系列

在我们的60名患者中，我们还发现了两个以前与CI缺乏症无关的基因的隐性突变：NUBPL公司和FOXRED1系列.

患者DT35表现为线粒体脑肌病，并被发现含有明显的纯合子NUBPL公司：c.166G>A突变(补充图8). 我们没有在204条其他患者染色体或84条已测序的HapMap控制染色体中检测到这种突变。据预测，这种突变会导致精氨酸（p.G56R）取代高度保守的甘氨酸残基，精氨酸是TargetP预测的线粒体靶向序列切割位点的18个氨基酸(补充图8). 虽然患者的父亲是这种突变的杂合基因，但母亲没有携带这种突变(补充图8). 为了确定母亲是否传播了涉及外显子2这一部分的缺失，我们对DT35的DNA进行了基于Affymetrix阵列的细胞遗传学分析。我们检测到一个复杂的染色体重排，包括一个240Kb的缺失，该缺失跨越了结节和涉及第7外显子的a~130Kb重复NUBPL公司如所示补充图8接下来，我们评估了NUBPL公司DT35中存在mRNA物种。RT-PCR显示全长转录物的表达非常低，而主要的mRNA物种是一个较短的片段(补充图8). 测序结果表明，较短的片段是由外显子10跳跃引起的，它含有c.166G>A突变，表明它是父系等位基因。没有证据表明母体等位基因表达。为了确定外显子10跳跃的原因，我们对外显子十和侧翼内含子区域（之前高通量序列覆盖率低的区域）进行了Sanger测序。发现一个c.815-27T>c突变，该突变预计会消融一致性分支序列。这种突变存在于2/232条白种人控制染色体中。因此，DT35包含一个NUBPL公司包含跨外显子1-4缺失的等位基因和包含p.G56R错义突变和可能导致外显子10跳跃的c.815-27T>c突变的第二个等位基因。

我们进行了一项互补实验，以评估将野生型cDNA引入患者成纤维细胞是否挽救了CI活性的缺陷。该患者的成纤维细胞表现出强烈的CI缺陷，用分光光度酶分析法测定时仅有19%的残余CI活性，用试纸酶分析法检测时仅有40%的残余CI活动。使用慢病毒表达系统，我们用野生型cDNA转导了患者成纤维细胞。野生型的表达NUBPL公司抢救患者的CI活动NUBPL公司突变，但未改变对照成纤维细胞或患者成纤维细胞的CI活性FOXRED1系列突变(图4a)，建立NUBPL公司作为本例的致病基因。

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图4

NUBPL公司和FOXRED1系列患者成纤维细胞CI缺陷的cDNA修复。条形图显示CI活性，通过CIV活性标准化，在用野生型转导之前和之后在对照和患者成纤维细胞中测量NUBPL-V5信使核糖核酸（a）或野生型FOXRED1-V5mRNA（b）。条形图表示3个生物复制的平均值，误差条形图表示±1 s.e.m。星号表示p<0.01。代表性的量油尺分析如下所示。

尽管我们已经证明了这一点NUBPL公司在该患者的复合物I缺乏症的基础上，我们尚未确定个体突变的致病性。由于其在对照组中流行，c.815-27T>c分支位点突变可能是一个伪缺陷等位基因，如果纯合子产生足够的全长NUBPL公司NUBPL功能的成绩单。然而，当与DT35等位基因为空的基因遗传时，这种突变可能是致病性的。或者，p.G56R错义突变可以消除NUBPL公司功能或可能与分支突变协同作用导致疾病。

患者DT22表现为Leigh综合征，被发现为两种基因突变的复合杂合子FOXRED1系列，c.694C>T（p.Q232X）和c.1289A>G（p.N430S）(补充图9). 在发现筛查中检测到c.694C>T突变，而在204条其他患者染色体或84条HapMap控制染色体中未检测到该突变。c.1289A>G突变位于低覆盖率区域，但随后通过Sanger测序确定FOXRED1系列通过RFLP分析筛选出的102条欧洲祖先的控制染色体中不存在。对用CHX治疗以抑制无义介导的衰变的成纤维细胞的cDNA进行分析，证明存在这两种突变。然而，在没有CHX的情况下，含有c.694C>T（p.Q232X）的转录本无法检测到，而含有c.1289A>G突变的转录本为优势种，这与复合杂合性一致(补充图9). c.1289A>G突变是从患者母亲遗传来的，预计会导致高度保守的天冬酰胺残基被丝氨酸取代（p.N430S）(补充图9). 父亲的DNA无法用于基因分型。患者cDNA的RT-PCR分析还显示，第6外显子偶尔跳跃（包含c.694C>T），这导致一个转录本预计缺少40个内部残基(补充图9).

如上所述，我们在患者成纤维细胞中进行了一项互补实验，以评估狐狸红1CI活动中。该患者的成纤维细胞表现出明显的CI缺陷，用分光光度酶法测定时仅有9%的残余CI活性，用试纸酶法测定则有15%的残余CI活力。我们能够使用慢病毒介导的野生型cDNA拯救这些成纤维细胞中的缺陷FOXRED1系列cDNA，这种拯救是针对这种细胞系的(图4b).

突变数据和互补实验共同支持NUBPL公司和FOXRED1系列作为真诚地分别在DT35和DT22个体中发现CI疾病相关基因。

DNA制备和汇集

使用核子DNA提取试剂盒从培养细胞中分离DNA，或通过蛋白酶K消化和盐析从患者组织（骨骼肌或心肌和肝脏）中分离DNA。使用带有100ng输入DNA的QIAGEN REPLI-g™试剂盒对每个患者样本进行全基因组扩增。HapMap样本未进行全基因组扩增。DNA浓度通过在Thermo Scientific Varioskan Flash上检测到的Quant-iT™PicoGreen®dsDNA试剂进行测量。基于两轮量化和稀释，DNA浓度标准化为20ng/μL，得出平均19.2ng/μL浓度（1.56标准偏差）。我们允许10%的偏差，因为这是PicoGreen®定量的精度极限。使用Packard Multiprobe II HT EX自动执行标准化步骤。在整个装置和所有步骤中使用相同的机器人自动化，以确保均匀的移液误差。20或21个样品，然后以等摩尔量汇集。每个患者库包含诊断未知、已知mtDNA突变和已知核突变的患者，计数如下：Pool1=12,5,4；池2=13，5，3；池3=12,5,4；池4=12，5，3；池5=11,5,4。请参见补充说明用于HapMap样本标识符。

目标选择

目标包括来自103个基因位点的111个RefSeq转录本（第29版）的2个mtDNA区域和编码及UTR外显子(补充表1). 使用PRIMER3软件对hg17参考序列（扩增子长度150–600bp，无缓冲区）进行重复设计，并使用三次设计迭代在3个HapMap CEU样本上进行验证。不是我添加尾部是为了为下游串联提供识别站点。使用20 ng全基因组扩增DNA、1×HotStar缓冲液、0.8 mM dNTPs、2.5 mM MgCl对靶区进行PCR扩增₂、0.2单位HotStar酶（Qiagen）和0.25μM正向和反向引物，反应体积为10-μl。PCR循环参数为：一个95°C循环15分钟；35次循环，95°C持续20秒，60°C持续30秒，72°C持续1分钟；然后进行72°C的一个循环，持续3分钟。按照上述要求分别对PCR产物进行量化、归一化和汇总。通过在2%琼脂糖E凝胶上对1kb DNA梯架上的一个PCR产物柱进行测试，以观察PCR产物的大小，从而确定二次确认。然后使用Packard Multiprobe II HT EX将PCR产物汇集到DNA样本池中。

排序

每个合并样本的PCR产物使用不是我适配器并如前所述剪切成碎片⁴³.文库是通过修改的Illumina单端文库协议构建的，通过225–275bp凝胶大小选择和14个PCR周期的PCR富集，然后在Illumiana基因组分析仪上用76个周期进行单端测序。使用MAQ算法将76 bp的读数与基因组对齐⁴⁴在Picard分析管道内，并使用SAMtools软件进行进一步处理⁴⁵和自定义脚本。

变量发现

使用Syzygy算法在目标碱基上检测每个集合样本中的高置信SNV，至少有100个高质量的对齐读取（碱基质量≥20，映射质量>0，每条链上的读取≥30）。高置信度SNV的对数比值（LOD）得分≥3，股特异性LOD>-1.5或Fisher链偏差精确测试>0.1（参见补充说明). 每条链上至少有3个读取支持低自信SNV（基本质量≥20，映射质量>0，每条链上≥200个读取）。从未对齐的读序列中识别出索引，并且在与目标外显子精确匹配20bp之前包含插入/缺失的每条链上有≥10个未对齐读序列支持索引，不包括与均聚物序列相邻的索引（参见补充说明).

根据基因型数据估计发现筛查的敏感性，使用库中≥1个个体与hg18相比含有变异的位点，而在所有个体均含有hg18参考等位基因的位点计算特异性。

根据以下任何标准，变异被标注为“可能有害”：i）根据人工管理和人类基因突变数据库（HGMD）专业版2009.1，以前报告为疾病变异²⁴; ii）存在于线粒体tRNA基因中；iii）存在于5′UTR中并改变上游ORF的存在⁴⁶; iii）存在于剪接位点（剪接受体位点−1、−2、−3和剪接供体位点−1,1,2,3,5，根据包含所有8189个HGMD疾病相关剪接变异体的训练数据选择）；iv）编码索引；v） 无义变体；vi）根据从UCSC基因组浏览器下载的多z44向基因组比对，在10个以上的脊椎动物物种中保守的氨基酸的错义变体⁴⁷（请参见补充说明)或PolyPhen-2.0预测为“破坏性”（HumVar训练数据）⁴⁸（请参见补充说明). 如果在42个HapMap对照（dbSNP）中存在先前与疾病无关的变异，则将其排除²²，1000个基因组试点1，或在mtDB中出现>0.005个次要等位基因频率²³基于致病性线粒体DNA突变无症状携带者的频率⁴⁹保护阈值选自训练数据：2009年1月版HGMD中所有与疾病相关的错义变体，以及注释为非同义的所有dbSNP128位点，不包括HGMD中存在的位点。

基因分型

使用Sequenom MassARRAY®iPLEX™GOLD化学分析103例CI患者的全基因组扩增DNA中的SNV⁵⁰在Integrated DNA Technologies，Inc.合成寡核苷酸并进行质谱QCed。所有SNV均在由AssayDesigner v.3.1软件设计的20–38次分析的复合池中进行基因分型，从每个池10ng DNA开始~将7 nl反应加载到预加载有7 nl基质（3-羟基吡啶甲酸）的384孔SpectroCHIP的每个位置。SpectroCHIPs通过MassArray MALDI-TOF Compact系统和固相激光质谱仪在自动模式下进行分析（Bruker Daltonics Inc.，2005）。我们在至少有一个SNV的所有样本中获得了高质量的数据（>95%的基因型呼叫率，HWE P值>0.001，MAF>1%）。变体由实时SpectroCaller算法调用，由SpectroTyper v.4.0软件分析，并手动审查罕见变体。

根据制造商的协议，使用ABI 3130XL和BigDye v3.1终止子（Applied Biosystems）对基因组DNA进行Sanger重测序，以验证缺失和选择的SNV。

克隆

这个FOXRED1系列开放阅读框（ORF）是在pDONR223载体（克隆ID:3956972，开放生物系统）中购买的，并通过网关克隆（Invitrogen）克隆到pLEX TRC970（V5 C末端标记）中。使用该载体的初始实验没有挽救CI活性，因此根据制造商的说明，使用QuikChange II XL定点突变试剂盒（Stratagene）进行定点突变，将密码子343从CCA（脯氨酸）（dbSNP rs17855445）改变为hg18参考密码子GCA（丙氨酸）（引物列于补充表5)生成RefSeq FOXRED1-V5 pDest矢量。通过RT-PCR结合Gateway适配器从MCH58细胞中扩增出全长NUBPL ORF，然后通过Gateways克隆克隆到pLEX TRC970（V5 C末端标记）中，生成NUBPL-V5 pDest载体。

病毒颗粒的产生和转导

HEK-293T细胞在10cm平板上生长至60%汇合，并与包装质粒（pCMV-δ8.91）、假分型质粒（pMD2-VSVg）和NUBPL-V5-pDest或FOXRED1-V5-pDest共转染。根据制造商的方案，使用效应试剂（Qiagen）进行转染。转染后16小时将新鲜培养基应用于细胞，24小时培养后，收集含有包装病毒的上清液，并通过0.45μM膜过滤器过滤。

患者成纤维细胞在6孔板中生长到80%的汇合处，然后在8.75mL总培养基中添加62.5μL NUBPL-V5或125μL FOXRED1-V5病毒颗粒和最终浓度为5μg/ml的聚brene。在更换培养基之前，将平板以2500rpm的转速旋转90分钟，并在37°C下培养24小时。细胞在无抗生素培养基中培养30小时，然后使用含有1μg/mL嘌呤霉素的选择培养基。经过12-20天的选择，收集细胞进行试纸分析。

油尺酶活性测定

根据制造商的方案（Mitosciences），分别对10μg和15μg清除的细胞裂解液进行CI和Complex IV（CIV）试纸活性分析。使用Hamamatsu ICA-1000免疫色谱试纸阅读器进行密度测定。使用双向重复测量方差分析（ANOVA）对各组进行比较，然后使用Bonferroni方法进行事后分析，以确定具有统计学意义的差异。

纯合度映射

利用SNP定位基因芯片确定纯合度标准普尔250 k阵列（Affymetrix），由澳大利亚基因组研究机构执行。使用GCOS客户端软件（Affymetrix）的杂合性丢失（LOH）分析工具对数据进行分析。

逆转录聚合酶链反应

使用RNAspin Mini Kit（Illustra）从培养的患者成纤维细胞中提取RNA，并根据制造商的协议使用SuperScript III第一链合成试剂盒（Invitrogen）生成cDNA。为了分析无义介导的衰变和mRNA剪接，在制备RNA之前，在含有100ng/μL CHX的培养基中培养成纤维细胞24小时⁵¹.PCR引物(补充表5)设计用于在一个PCR产物或重叠片段中扩增整个cDNA。PCR产物要么按照制造商的协议使用ABI 3130XL和BigDye v3.1终止子（Applied Biosystems）直接测序，要么使用MinElute凝胶提取试剂盒（Qiagen）进行凝胶纯化。

SDS-PAGE和western印迹

在含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）的RIPA缓冲液（50mM Tris pH 8.0，150mM NaCl，1%NP-40，0.5%脱氧胆酸钠和0.1%SDS）中溶解主要对照组和患者成纤维细胞。每个泳道在10%NuPAGE Bis-Tris凝胶（Invitrogen）上运行25-50μg清除的裂解物，将蛋白质转移到PVDF膜（Millipore）上，封闭（PBS含有5%脱脂奶粉，0.05%吐温-20），并与一级抗体在4°C下孵育过夜（一级抗体详细信息和浓度见补充方法). 清洗后，在抗鼠或兔中培养膜^{人力资源计划}二级抗体（以1:10000使用的DakoCytomation）在室温下1小时，并使用ECL或ECL Plus检测试剂开发（Amersham Bioscience）。

RFLP屏幕（FOXRED1:c.1289A>G和NUBPL:c.815-27T>c）

第11外显子FOXRED1系列或第10外显子NUBPL公司PCR扩增(补充表5)从100ng的患者gDNA中，通过凝胶电泳检查产物，用AflIII型或NlaIV公司（新英格兰生物实验室），然后用1%琼脂糖凝胶溶解。

蛋白质印迹抗体

抗体包括1:1000的NDUFS4（MS104，线粒体）、1:10000的Porin（529534，钙生物化学）、复合物II 70kD亚基（A-1142）。分子探针）1:1000，NDUFAF2（来自维多利亚州本杜拉拉筹伯大学Mat McKenzie博士和Michael Ryan教授的礼物）1:5000。

微阵列DNA拷贝数分析

根据制造商的说明，使用Affymetrix GeneChip 2.7M阵列进行全基因组微阵列分析。使用染色体分析套件（ChAS）软件v1.2（Affymetrix）进行数据分析。

我们感谢S.Tregoning、A.Laskowski和S.Smith在酶分析和DNA制备方面提供的帮助，感谢M.McKenzie和M.Ryan提供的NDUFAF2抗体，感谢J.Boehm提供的慢病毒表达载体，感谢S.Flynn提供的人类受试者方案方面的协助，感谢R.Onofrio设计PCR引物，感谢K.Ardlie和S。Mahan负责协助DNA样品制备，J.Wilkinson和L.Ambrogio负责Illumina序列项目管理，T.Fennel负责序列比对，L.Ziaugra负责基因分型协助，M.Cabili负责工具评估，J.Flannick负责协助汇总序列分析，I.Adzhubei和S。Sunyaev善意地提供PolyPhen-2.0预测，M.DePristo、E.Banks、A.Sivachenko提供序列数据分析建议，M.Garber提供进化保护分析帮助，J.Pirruccello、R.Do和S.Kathiresan提供数据和控制数据分析，还有许多医生介绍患者并协助这些研究。这项工作得到了澳大利亚国家卫生与医学研究委员会授予DRT的一笔赠款（436901）和首席研究员奖学金、澳大利亚EJT研究生奖和美国国立卫生研究院授予VKM的一笔拨款（GM077465）的支持。作者们希望把这篇文章献给我们的合著者丹尼斯·柯比，一位杰出的科学家和亲爱的同事，他在编写这份手稿时去世。