介绍
增殖细胞和静止细胞的代谢需求预计会有很大不同。增殖细胞必须复制其全部细胞内容物才能分裂。因此，增殖细胞中的大部分代谢能量用于合成DNA、蛋白质和脂质。静止的细胞由于没有分裂而不需要进行大量的代谢，并且在一些经过充分研究的模型系统中，它们会随着增殖率的降低而降低代谢率。例如，当液体培养物在富培养基中生长到饱和时，酵母培养物进入固定相[1]在这个群体中，静止的酵母细胞无法积累质量和体积[2]部分原因是静止的酵母细胞会诱导自噬或自噬[3]此外，稳定期的总转录速率比对数期的慢三到五倍[4]在对数生长的培养基中，蛋白质合成率降低到约0.3%[5]因此，静止期酵母培养物中的静止细胞可能是静止细胞显著降低其代谢活性的一个例子。
淋巴细胞在增殖和静止之间过渡时也会发生重大的代谢变化。早期研究表明，凝集素对淋巴细胞的刺激导致葡萄糖摄取增加，糖酵解速率和磷酸戊糖途径（PPP）活性增加[6],[7]最近的实验集中于鼠前B细胞淋巴细胞系FL5.12，该细胞系对细胞因子白介素IL-3产生增殖反应[8]IL-3刺激导致糖酵解通量增加8倍。IL-3还诱导细胞消耗更少的氧气/消耗的葡萄糖，并分泌更多的乳酸，表明从氧化代谢转向糖酵解代谢。对于人类外周血T淋巴细胞，刺激导致糖酵解增加30倍[9]; 胸腺细胞增加了50倍[10]静止淋巴细胞和增殖淋巴细胞的这些差异在我们理解静止状态中发挥了关键作用，以淋巴细胞为模型系统的实验对发展静止以代谢活动降低为特征的观点作出了重要贡献。然而，淋巴细胞在哺乳动物细胞中相对独特，在静止状态下主要具有“观察和等待”功能，而在激活后才发挥大部分生理作用。
我们的研究侧重于新生儿皮肤成纤维细胞作为静止的模型系统[11]–[13]在体外，直接从新生儿包皮分离的原代成纤维细胞可以通过血清提取或接触抑制被诱导进入可逆性静止状态。与大多数原代细胞不同，成纤维细胞在静止状态下培养长达30天保持健康，几乎没有凋亡或衰老，然后可以重新进入细胞周期[13]在体内，静止的成纤维细胞是正常生理学的核心，是细胞组织形成所必需的细胞外基质的主要合成物。作为对创伤的反应，成纤维细胞从静止状态进入细胞周期，增殖并分泌富含胶原蛋白的细胞外基质[14]、促血管生成因子，可招募新血管[13]和其他促进伤口愈合反应的分子[15]更好地理解成纤维细胞增殖和静止之间的过渡将对生理学和医学有广泛的意义。创伤愈合期间和之后，成纤维细胞过度增殖和分泌细胞外基质导致瘢痕和纤维化[16],[17]此外，肿瘤中可能含有有助于癌症休眠的静止细胞[18],[19]因此，更好地理解增殖和静止之间的过渡，包括发生的代谢变化，可能会对广泛的医疗条件产生影响。
代谢组学这一新兴领域有望通过系统水平的细胞内代谢物浓度和通量表征来增强我们对哺乳动物细胞生理学的理解。使用液相色谱-三重四极杆质谱法，我们开发了一种同时监测大量代谢物库大小和周转的方法[20]–[22]在这里，我们应用代谢组学技术、通量分析和生化分析来研究初级皮肤成纤维细胞进入静止状态后的代谢变化。我们发现，接触抑制的原代成纤维细胞在调节其代谢重点以产生NADPH、稳定地更新其蛋白质和脂质并促进特定细胞外基质蛋白分泌的同时，仍保持高度代谢活性。
结果
原发性成纤维细胞的细胞静止模型
我们开发了一个模型系统，可以监测增殖细胞和静止细胞之间的代谢差异。在生长至融合后1周（接触抑制7天[CI7]），融合后2周（接触禁止14天[CI14]），原代皮肤成纤维细胞在积极增殖的同时进行扩增和分析，或在与血清浓度汇合2周后，最后一周的浓度从10%降至0.1%（接触被禁止14天，血清被饥饿7天[CI14SS7]）。或者，将成纤维细胞稀疏地镀膜，使其彼此不接触，并通过血清饥饿诱导成静止状态，并在4 d（血清饥饿4 d[SS4]）或7 d（血清匮乏7 d[SS7]）后进行监测。在静止的成纤维细胞中，含有2N DNA的细胞比例增加，因此80%或更多的细胞位于G0/G公司1细胞周期的阶段(). S期细胞比例显著降低，表明在这些条件下很少有细胞活跃分裂。在接触抑制和血清缺乏的成纤维细胞中，细胞周期素依赖性激酶抑制剂p27的水平基普1如预期的那样，进入静止状态的细胞受到上调()[23]此外，对总RNA进行吡咯菌素Y染色表明，低吡咯菌肽Y的细胞部分被解释为G0
[24]，通过所有这些方法诱导成纤维细胞静止(). Pyronin Y标记数据表明，在作为静止模型研究的接触抑制和血清缺乏细胞群中，大约60%–75%的细胞位于G0剩下的大部分用G表示1.
增殖和静止成纤维细胞模型系统。（A） 增殖（P）、CI7、CI14和CI14SS7成纤维细胞用PI染色，并用流式细胞仪分析细胞周期分布。G中细胞的比例0/G公司1静止细胞增多。不同增殖状态的细胞图像如下所示。（B） 收集通过接触抑制或血清饥饿诱导成纤维细胞静止的裂解物，并用p27抗体进行免疫印迹分析基普1第27页基普1在任何一种抗增殖信号使之静止的细胞中都能诱导产生水平。（C） 用派罗宁Y和Hoechst 33342对增殖和静止的成纤维细胞进行染色，并用流式细胞术进行分析（下面板）。通过多种方法（上图）诱导成纤维细胞进入静止状态时，低派罗宁Y含量的细胞比例增加。
增殖和静止成纤维细胞中的快速糖酵解通量
先前的研究报告称，在丝裂原退出后，诱导淋巴细胞退出细胞周期的淋巴细胞表现出糖酵解活性降低[8]我们使用了几种方法来评估增殖、CI7、CI14和CI14SS7细胞的代谢率。我们监测了葡萄糖和谷氨酰胺从培养基中消耗的速率，以及乳酸和谷氨酸分泌到培养基中的速率。如所示接触抑制组的葡萄糖消耗率约为增殖成纤维细胞的2倍。单独接触抑制时，乳酸分泌减少不到2倍，而额外血清剥夺时，乳酸释放大约减少2倍。由于血清饥饿（无接触抑制）4或7天，成纤维细胞中的葡萄糖消耗量实际上略有增加，导致成纤维细胞静止(图S1). 我们还监测了在含有生理水平葡萄糖和谷氨酰胺的培养基中培养的成纤维细胞的代谢率（1 g/l葡萄糖和0.7 mM谷氨酰胺，而Dulbecco改良Eagle培养基[DMEM]中的葡萄糖和谷氨酸分别为4.5 g/l和4 mM）[25],[26]在这些低葡萄糖/低谷氨酰胺条件下，与标准培养基中的增殖成纤维细胞相比，增殖成纤维纤维细胞的代谢率稍低(图S1). 在这些条件下培养的静止成纤维细胞的消耗和排泄率约为增殖成纤维细胞消耗和排泄的一半。我们的发现是，在增殖和静止的成纤维细胞中，糖酵解速率在2倍以内是相似的，这是令人惊讶的，因为糖酵化速率的变化已被证明反映了多模型系统中增殖速率的变化[8]–[10]事实上，虽然增殖细胞周期中的细胞比例急剧下降，但即使是CI14SS7条件也只导致葡萄糖消耗量的2倍变化，远远低于其他系统的报告。因此，代谢活动减少并不是静止的普遍特征。
在增殖和静止的成纤维细胞中，糖酵解率相似。（A） 在增殖（P）、CI7、CI14和CI14SS7细胞的条件培养液中测量葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和谷氨酸的量。数据来自三个实验，每个时间点有五个重复，误差条表示标准误差。（B） 从处于不同增殖状态的细胞中提取代谢物，并使用质谱法定量特定代谢物的水平。单个样品中的代谢物水平标准化为收获时的蛋白质含量。显示了四个实验的平均值，每个实验包含4-5个重复。误差条表示标准误差。假发现率为0.05，增殖细胞、CI7细胞和CI14细胞之间的代谢产物水平没有差异。（C） 增殖、CI7和CI14成纤维细胞糖酵解的同位素标记动力学。介质已更改为[U-13C] -时间零点时的葡萄糖，以及每种代谢物的分数13在切换到标记培养基后的指定时间测定C-标记。数据来自五个实验，误差条表示标准偏差。3PG，3-磷酸甘油酯；己糖-P，己糖磷酸；戊糖-P，磷酸戊糖；PEP，磷酸烯醇丙酮酸。
为了进一步评估增殖和接触抑制的成纤维细胞的糖酵解速率，我们使用液相色谱-串联质谱法监测了糖酵解中间体的稳态池大小[20]–[22]总的来说，我们监测了172种代谢物的水平，其中62种在增殖、CI7和CI14成纤维细胞中发出背景以上信号。由于静止成纤维细胞比增殖成纤维细胞更小，每个细胞所含的蛋白质更少，因此在相同密度的细胞中，每微克蛋白质的代谢物水平被归一化（E.M.Haley、A.L.-M.和H.A.C.，未发表的数据）。测定每种代谢物的接触抑制（CI7和CI14）与增殖成纤维细胞中代谢物水平的比率。一些代谢物在增殖的成纤维细胞中一直处于较高水平，而其他代谢物则在接触抑制的成纤维纤维细胞中富集，尽管代谢物水平的这些变化幅度一般不大(图S2).
五种糖酵解中间体和5-磷酸戊糖（一种核糖-5-磷酸、核糖-5-5-磷酸和木糖-5-磷酸酯的组合，在我们的液相色谱-串联质谱法[LC-MS/MS]中无法可靠区分）的水平如所示在接触抑制的（CI7或CI14）和增殖的成纤维细胞之间，糖酵解中间体的水平没有观察到统计学上的显著差异，错误发现率为0.05。一些糖酵解代谢产物在接触抑制、血清缺乏（CI14SS7）的成纤维细胞中含量较低。因此，仅由接触抑制诱导的增殖和静止之间的过渡对初级成纤维细胞糖酵解代谢物的池大小几乎没有影响。虽然池的大小不是流量变化的直接指示，但增殖、CI7和CI14成纤维细胞中糖酵解代谢产物的恒定水平与我们的发现一致，即在这些不同状态下，成纤维细胞的葡萄糖摄取或乳酸分泌速率几乎没有变化。
为了更直接地评估糖酵解途径的流量，我们用[U-13C] -葡萄糖，并测定标签并入糖酵解中间体的速度(). 对于磷酸己糖（葡萄糖-1-磷酸、葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸的组合）、果糖-1,6-二磷酸（FBP）、磷酸二羟丙酮（DHAP）和磷酸烯醇丙酮酸盐，未标记的中间产物池被转换为完全13C标记的中间产物在增殖、CI7和CI14成纤维细胞中的比率相似。
我们还开发了一个基于中心碳代谢常微分方程（ODE）的计算模型，用于增殖、CI7、CI14和CI14SS7成纤维细胞。模型中的ODE量化了转换为13C标记碳源(图S3). 通过拟合所有可用的实验室数据（标记动力学、伪静态标记模式、测量的池大小以及摄取和排泄率），确定了模型参数（即代谢通量和一些未测量的池尺寸）。这种系统级方法能够定量增殖、CI7、CI14和CI14SS7成纤维细胞通过不同代谢途径的流量(图S4和表S1). 对于糖酵解，从磷酸己糖到FBP以及从DHAP到3-磷酸甘油酯的推断通量在增殖、CI7和CI14条件下相似(和S4系列和表S1; 看见材料和方法有关统计显著性的信息）。在CI14SS7成纤维细胞中，磷酸己糖对FBP和DHAP-to-3-磷酸甘油酯的通量约为其他条件下的一半(图S4和表S1)与葡萄糖消耗量减少约2倍一致。我们的结论是，通过接触抑制，成纤维细胞的葡萄糖消耗和乳酸排泄迅速进入静止状态。
增殖成纤维细胞和CI14成纤维细胞中央代谢通量的比较。通量是通过系统级通量平衡代谢模型中所有可用实验数据的计算集成得出的。箭头大小表示CI14成纤维细胞的流量大小。颜色表示与增殖成纤维细胞相比的相对比率；红色表示CI14成纤维细胞的流量较高，绿色表示增殖成纤维细胞流量较高。虽然磷酸核糖到UTP的通量在增殖过程中比静止的成纤维细胞更快（在1000种确定的溶液中），但它的分布在不同的增殖状态中重叠，因此在这种特殊情况下，不符合我们对不同速率的严格条件（参见材料和方法). αKG，α-酮戊二酸；己糖-P，己糖磷酸；草酰乙酸；戊糖-P，磷酸戊糖；PEP，磷酸烯醇丙酮酸。
静止成纤维细胞表现出高PPP活性
PPP产生核苷酸生物合成所需的5-磷酸核糖和NADPH，NADPH可用作包括脂肪酸在内的大分子生物合成的辅因子。我们预计，与静止细胞相比，增殖细胞对核糖-5-磷酸和NADPH的需求更高，因此PPP通量更高。令人惊讶的是，戊糖磷酸盐池13当细胞与标记的[U孵育时，C标记在增殖、CI7和CI14成纤维细胞中非常迅速-13C] -葡萄糖(). 事实上，根据我们的计算模型，接触抑制（CI7和CI14）成纤维细胞中磷酸己糖到磷酸戊糖的流量实际上略高于增殖成纤维细胞（尽管这种影响在统计学上并不显著）。额外的血清剥夺只会略微降低氧化PPP通量，CI14SS7成纤维细胞中的氧化PPP流量与糖酵解流量之比最高。因此，氧化PPP在增殖细胞和静止细胞中都被积极利用。
PPP在静止的成纤维细胞中是活跃的。（A） 增殖（P）、CI7和CI14成纤维细胞PPP中的同位素标记动力学。添加[U后，完全标记的磷酸己糖、磷酸戊糖或7-磷酸sedoheptulose的分数-13C] -在每个时间点绘制每个条件下细胞的葡萄糖。类似地，ATP和UTP与5的分数13绘制了C原子。5×13C-ATP和5×13经串联质谱分析证实，C-UTP在其核糖部分均匀标记，而在基础部分未标记。数据来自五个实验，误差条表示标准偏差-P、 磷酸盐。（B） [1,2中乳酸标记示意图-13C] -葡萄糖。[1, 2-13C] -葡萄糖转化为2×13通过典型糖酵解途径和1×13C-乳酸通过PPP。（C） 不同增殖条件下的成纤维细胞与[1,2-13C] -葡萄糖4小时，水平为1×13C-乳酸和2×13用质谱法监测C-乳酸。1×13C-乳酸到2×13为每种条件下的成纤维细胞绘制C-乳酸盐。平均值±一个标准误差(n个 = 4） 如图所示。星号表示第页-值<0.01（与CI7相比增殖，第页 = 0.006，与CI14成纤维细胞相比增殖第页 = 0.002（按学生）t吨测试）。
我们预计，PPP产生的核糖在增殖过程中会比静止细胞更快地并入三磷酸腺苷，因为它们在RNA和DNA合成中对三磷酸腺苷酸的需求增加。事实上，在增殖的成纤维细胞中，带有标记核糖环的ATP和UTP在增殖的纤维细胞中积聚得更快(). 结果证实，增殖细胞中核苷酸的生物合成速度更快。
鉴于静止的成纤维细胞不会将磷酸核糖参与核苷酸生物合成，我们推断静止的细胞可能通过PPP的非氧化分支将磷酸核糖体再循环回糖酵解中间产物。为了验证这一假设，我们监测了1×13C-乳酸到2×13细胞与[1,2孵育后的C-乳酸-13C] -葡萄糖。如前所述[27], 1×13当葡萄糖通过PPP的氧化部分代谢为5-磷酸核酮糖时，会形成C-乳酸。在这一途径中，葡萄糖分子失去一个13CO形式的C原子2，然后通过PPP的非氧化分支返回糖酵解(). 2×13C-乳酸是由葡萄糖到乳酸的典型糖酵解途径形成的。1×13C-乳酸到2×13C-乳酸提供了PPP非氧化分支利用程度的指示。CI7的这一比率明显高于增殖成纤维细胞，CI14成纤维细胞的这一比例更高().
作为通过PPP非氧化分支的流量的另一个指标，我们监测了非氧化PPP中的代谢中间产物sedoheptulose-7-phosphate的标记。Sedoheptulose-7-磷酸在CI7和CI14中快速标记，但在喂食[U-13C] -葡萄糖()，表明静止细胞中PPP的非氧化分支流量较高。我们的系统级流量分析证实，与增殖的成纤维细胞相比，接触抑制状态下从磷酸核糖到糖酵解的流量增加(和S4系列和表S1). 因此，PPP产生的磷酸核糖用于增殖成纤维细胞的核苷酸生物合成，但在静止的成纤维细胞中回收为糖酵解中间产物。
PPP的功能重要性
为了研究静止成纤维细胞高PPP通量的机制基础，我们监测了PPP中两种关键酶的蛋白质水平，这两种酶都产生NADPH：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（PGD）。与增殖的成纤维细胞相比，通过接触抑制或血清饥饿诱导成纤维细胞静止时，G6PD和PGD的蛋白水平升高(). 这些结果表明，接触抑制和血清缺乏的成纤维细胞可能激活一个程序，导致PPP酶水平升高。
PPP酶被诱导，静止成纤维细胞中GSH的比例增加。（A） 通过免疫印迹法监测增殖（P）和静止成纤维细胞中生成NADPH的G6PD和PGD的蛋白水平。GAPDH作为负荷控制进行监测。（B） 增殖、CI7、CI14和CI14SS7的总GSH和GSSG含量。数据表示重复进行的一次实验，误差条表示标准偏差。（C） 利用（B）中的数据计算GSH与GSSG的比值。
增殖和静止的成纤维细胞通过PPP生成NADPH。NADPH可用于生物合成或再生还原形式的谷胱甘肽或硫氧还蛋白。我们监测了增殖、CI7、CI14和CI14SS7成纤维细胞中还原和氧化的谷胱甘肽（GSH和GSSG）。如所示与增殖的成纤维细胞相比，静止状态下（CI7、CI14和CI14SS7）GSH略有增加，GSH与GSSG的比值显著增加。结果与静止的成纤维细胞上调NADPH生成以确保足够的谷胱甘肽抵抗自由基的模型一致[28].
然后我们测试了PPP在静止和增殖成纤维细胞中的功能重要性。我们用脱氢表雄酮（DHEA）（PPP的小分子抑制剂）培养增殖或CI14成纤维细胞[29],[30]持续4天，并用碘化丙啶（PI）标记后用流式细胞术监测死亡细胞的分数。我们发现，与100µM和250µM剂量DHEA处理的增殖成纤维细胞相比，接触抑制成纤维细胞的细胞死亡在统计学上显著增加(第页<0.01) (). 鉴于几乎所有已知的代谢抑制剂和细胞毒素都优先杀死增殖细胞，这一结果尤其令人印象深刻[18],[31],[32]caspase-3/7活性测定表明DHEA诱导静止成纤维细胞死亡的机制是通过凋亡(). DHEA在汇合11d的成纤维细胞中诱导凋亡的作用明显强于增殖成纤维细胞，但在缺乏接触抑制的情况下，在血清饥饿7d的成细胞中诱导细胞凋亡的作用更强。
PPP有助于静止成纤维细胞的存活。（A） 用DMSO对照、100µM DHEA或250µM DHEA处理增殖（P）或CI14成纤维细胞4 d。用PI培养细胞并用流式细胞仪分析。数据来自四个独立的实验；误差条表示标准误差。对于CI14与未经治疗的增殖相比，第页 = 0.113. 对于CI14与使用100µM DHEA进行增殖的比较，第页 = 0.0012. 对于CI14与使用250µM DHEA进行增殖的比较，第页 = 0.0011. 星号表示p<0.01的统计显著性。（B） 用乙醇载体对照或不同量的DHEA溶解在乙醇中4 d处理增殖成纤维细胞、接触抑制11 d的成纤维细胞（CI11）或SS7成纤维细胞。通过监测caspase-3/7底物的发光发射来分析细胞的caspase-3/4活性。数据按照车辆控制标准化。对于增殖细胞与CI11细胞，结果是平均四次实验，重复2-3次；误差条表示标准误差，星号表示第页<0.05. 除100µM外，所有剂量的CI11和增殖细胞中正常化caspase-3/7活性在统计学上均存在显著差异。对于增殖细胞与SS7细胞，数据代表三个实验，每个实验有三个重复。SS7和增殖细胞中正常化的caspase活性在所有剂量下都有显著差异。
增殖而非静止成纤维细胞中的截断三羧酸循环
先前的研究得出结论，增殖的淋巴细胞积极利用糖酵解途径生成ATP，而静止的淋巴细胞通过脂肪酸和蛋白质的流入产生能量，这些脂肪酸和蛋白通过三羧酸（TCA）循环代谢[8]为了研究TCA循环的使用情况，我们在添加[U-13C] -葡萄糖，[3-13C] -葡萄糖或[U-13C] -谷氨酰胺在增殖、CI7和CI14成纤维细胞中的表达。如所示增殖和接触抑制的成纤维细胞通过乙酰辅酶A将葡萄糖中的两个碳单位以可比较的速率并入柠檬酸盐中。在CI7和CI14成纤维细胞中，标记碳通过TCA循环形成2×13C-α-酮戊二酸，如预期。然而，在增殖的成纤维细胞中，标记碳从柠檬酸盐到α-酮戊二酸盐、琥珀酸盐和苹果酸盐的传递显著减少。使用[U的实验-13C] -谷氨酰胺进一步支持TCA循环的截断(). 而谷氨酰胺中的碳有效地沿标准顺时针方向横穿TCA循环的左侧，生成4×13柠檬酸C在增殖和静止的成纤维细胞中，随后形成3×13异柠檬酸脱氢酶引起的C-α-酮戊二酸在增殖的成纤维细胞中几乎不存在。通过我们的系统级流量鉴定，证实了增殖成纤维细胞中柠檬酸盐到α-酮戊二酸盐的流量减少(和S4系列和表S1).
增殖但非接触抑制的成纤维细胞中的TCA周期被截断。增殖（P）、CI7和CI14成纤维细胞从未标记转变为[U-13C] -时间零点时的葡萄糖。图中显示了13随着时间的推移，C转化为指定的代谢物。数据表示三个实验的平均值，误差条表示标准偏差。注意增殖细胞中α-酮戊二酸和琥珀酸的最小标记。
谷氨酰胺通过TCA循环驱动顺时针和逆时针流量。（A） 增殖（P）、CI7或CI14成纤维细胞与[U-13C] -谷氨酰胺。采集代谢物并通过LC-MS/MS测量其标记程度。TCA循环中的α-酮戊二酸可顺时针（或“正向”）方向转化为琥珀酸，或逆时针（或”反向”）方向转换为柠檬酸。唯一已知的5×13柠檬酸C-通过α-酮戊二酸的“反向”通量。5×13然后可以将C-柠檬酸盐转化为3×13通过ATP柠檬酸裂解酶产生乙酰辅酶A来驱动脂肪酸生物合成。数据表示四个实验的平均值。误差线表示标准偏差。（B） IDH1在静止成纤维细胞的转录和蛋白水平上调。通过微阵列（左面板）在增殖、CI7和CI14成纤维细胞的两个独立实验（用下标表示）中监测IDH1的转录水平。数据以热图格式显示，静止细胞中的高表达以红色显示，而静止细胞中表达则以绿色显示。结果显示了多种异柠檬酸脱氢酶同工酶。IDH1是一种代谢酶，可催化异柠檬酸盐转化为α-酮戊二酸盐，从而生成NADPH，IDH1的蛋白质水平通过免疫印迹法进行监测（右图）。GAPDH作为负荷控制进行监测。（C） 增殖、CI7、CI14和CI14SS7成纤维细胞与[U-14C] -谷氨酰胺24小时。提取脂肪酸，以及14C掺入量通过闪烁计数测定，并根据存在的蛋白质量进行标准化。误差条表示标准误差。第页-通过学生的t吨测试，星号表示第页<0.05. 对于CI7与增殖，第页 = 0.0025; CI14与增殖，第页 = 0.018; CI14SS7与增殖，第页 = 0.0001.
当碳骨架从TCA循环中移除以合成包括氨基酸在内的大分子前体时，需要其他长碳骨架来取代它们。这种回补对增殖的成纤维细胞尤其重要，因为它们的TCA循环活性在柠檬酸盐下被截断。糖酵解产生的主要回补反应涉及丙酮酸的羧基化，形成草酰乙酸。这种反应可以通过喂食细胞进行监测[3-13C] -葡萄糖和用标签监测柠檬酸或苹果酸的分数，因为13只有当通过丙酮酸羧化酶的回复反应被利用时，C才被保留。令人惊讶的是，1×13C-柠檬酸盐到未标记柠檬酸盐和/或1×13与增殖成纤维细胞相比，CI7、CI14和CI14SS7成纤维细胞中C-苹果酸与未标记苹果酸的比值显著增加(表S2). 此外，定量通量分析显示，与增殖成纤维细胞相比，CI7、CI14和CI14SS7中丙酮酸到草酰乙酸的回复通量升高(图S4和表S1)，而从丙酮酸盐到乙酰辅酶A的流量在CI14和CI14SS7成纤维细胞中低于增殖成纤维细胞。因此，接触抑制与柠檬酸盐后典型TCA循环活性的增加以及丙酮酸盐到草酰乙酸盐的补体TCA循环通量的增加有关。相反，增殖的成纤维细胞似乎不太可能从葡萄糖中获得足够的碳骨架来生产细胞生长介质中不存在的蛋白原氨基酸。
谷氨酰胺是增殖性成纤维细胞的首选无补体来源
我们假设增殖的成纤维细胞依赖于另一种碳骨架来源。对培养的细胞，特别是增殖活跃的细胞来说，补充谷氨酰胺是必要的[33]–[36]因此，我们监测了增殖、CI7、CI14和CI14SS7成纤维细胞的谷氨酰胺消耗率(和S1（第一阶段）). CI7、CI14和CI14SS7成纤维细胞每微克蛋白质消耗的谷氨酰胺约为增殖成纤维细胞的一半。与增殖成纤维细胞相比，CI7和CI14成纤维细胞分泌谷氨酸的速率较低，而CI14SS7成纤维细胞释放谷氨酸的速度较低。另一方面，SS4和SS7成纤维细胞消耗谷氨酰胺并以比增殖成纤维细胞更快的速度分泌谷氨酸(图S1). 在低葡萄糖/低谷氨酰胺条件下，增殖细胞与CI14成纤维细胞中谷氨酰胺消耗的相对速率与标准培养基中的相似。如所示用[U培养增殖、CI7和CI14成纤维细胞-13C] 谷氨酰胺可快速标记谷氨酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、苹果酸和柠檬酸，表明谷氨酰胺被增殖和接触抑制的成纤维细胞用于TCA循环修复。由于在增殖的成纤维细胞中，很少有葡萄糖碳被纳入TCA循环，因此谷氨酰胺可能是增殖成纤维细胞的主要回补前体[36]–[39].
谷氨酰胺标签显示“反向”TCA通量
[美]-13C] -谷氨酰胺转化为5×13C-谷氨酸，随后生成5×13C-α-酮戊二酸。5×13C-α-酮戊二酸可以向前进行TCA循环，生成4×13C-琥珀酸，或者，它可以被还原羧基化为5×13以NADPH为电子源的C-柠檬酸盐[40],[41]。如所示，介绍[U-13C] -谷氨酰胺导致约15%的柠檬酸盐转化为5×13增殖、CI7和CI14成纤维细胞在8小时后形成C型，而接触抑制成纤维细胞的标记速度更快。这些结果支持一种模型，即柠檬酸盐和α-酮戊二酸盐之间存在正向和反向通量，在接触抑制的两个方向上的通量大于增殖的成纤维细胞(和S4系列和表S1). 正向和反向通量可能发生在不同的腔室中，α-酮戊二酸在线粒体中被异柠檬酸脱氢酶2（IDH2）还原羧基化，由此产生的柠檬酸在胞浆中被IDH1重新转化为α-酮戊二酸[42]由于IDH1和IDH2都使用NADP（H）作为其氧化还原辅因子，净效应是以NADPH的形式将高能电子转移到胞浆。与接触抑制的成纤维细胞中通过这一途径的更大流量一致，IDH1蛋白在转录和蛋白水平上通过接触抑制而增加(). 因此，细胞溶质NADPH的两条主要途径，PPP和IDH2/IDH1穿梭，在接触抑制的成纤维细胞中的蛋白质和流量水平上均上调。
脂肪酸和蛋白质在增殖和静止的成纤维细胞中快速降解和再合成
静止的细胞不会随着细胞分裂而稀释较老的大分子、细胞器或膜，因此可能比增殖细胞更依赖于分解和重新合成膜成分和大分子的机制。我们的数据与接触抑制成纤维细胞中脂肪酸降解增加一致。肉碱是脂肪酸降解过程中参与脂肪酸从细胞质运输到线粒体的代谢产物，在CI7和CI14成纤维细胞中的含量高于增殖成纤维细胞(图S2). 此外，定量通量鉴定显示，基于柠檬酸盐的长期标记模式，CI7和CI14成纤维细胞中的脂肪酸分解增加，但CI14SS7成纤维细胞的脂肪酸降解率降低(和S4系列和表S1).
接触抑制的成纤维细胞中脂肪酸降解速率的提高似乎使脂肪酸生物合成能够以类似的速率在增殖和接触抑制的成纤维细胞中发生。在脂肪酸合成过程中，柠檬酸盐从线粒体运输到细胞质，在细胞质中被ATP柠檬酸裂解酶分解为草酰乙酸和用于脂肪酸生物合成的乙酰辅酶A。ATP柠檬酸裂解酶活性可根据5×13C-柠檬酸盐至2×13C-乙酰-CoA和3×13C-草酰乙酸（测量为3×13C-苹果酸）。如所示,×13C-苹果酸在增殖、CI7和CI14细胞中的生成类似，与所有这些状态下积极参与脂肪酸生物合成的成纤维细胞一致。为了更直接地评估增殖和静止成纤维细胞中脂肪酸的生物合成，我们从喂食[U-14C] -谷氨酰胺。与增殖的成纤维细胞相比，所有静止的成纤维细胞中碳对谷氨酰胺脂肪酸的贡献显著更高()与从α-酮戊二酸到柠檬酸盐的较高“反向”通量一致(和S4系列和表S1). 接触抑制型成纤维细胞中较高水平的脂肪酸合成可能有助于维持膜的完整性，也可能为胞质NADPH提供主要汇。
同样，我们的结果表明，接触抑制的成纤维细胞也可能积极降解现有的蛋白质，从而重新合成蛋白质以取代降解的蛋白质。如所示在所有条件下，当细胞转换为[U-13C] -谷氨酰胺，然后在CI7和CI14成纤维细胞中下降，但在增殖成纤维细胞内没有下降。含有五个标记碳的谷氨酸分子比例的下降对应于未标记谷氨酸的比例的增加。对这些数据的一个可能解释是未标记蛋白质的分解和游离氨基酸释放到谷氨酸池中。这些结果与我们的定量通量分析一致：蛋白质合成速率在所有条件下都是相似的[43],[44](和S4系列和表S1). 在最佳模型中，增殖成纤维细胞的蛋白质合成速率为3.3 nmol/min/µg蛋白质，CI7成纤维细胞为4.3 nmol/min/µg蛋白质，CI14成纤维细胞是4.1 nmol/min.µg蛋白，CI14SS7成纤维组织是2.9 nmol/mins/µg蛋白质。因此，在接触抑制的成纤维细胞中观察到活性代谢的一个原因可能是重建，从而刷新其脂质和蛋白质含量。
切换到[U后，标记的谷氨酸水平随时间降低-13C] -谷氨酰胺存在于CI7和CI14中，但不存在于增殖成纤维细胞中。增殖（P）、CI7或CI14成纤维细胞从未标记培养基切换到含有[U-13C] -谷氨酰胺，并随时间测定完全标记的谷氨酸（左图）和未标记的谷氨酰胺（右图）的分数。结果是四个实验的平均值，误差条表示标准偏差。
接触抑制的成纤维细胞分泌大量细胞外基质蛋白
静止成纤维细胞的高代谢活性也可以部分解释为其合成和分泌组织结构完整所需的细胞外基质分子。而增殖的成纤维细胞会分泌对伤口愈合很重要的分子[15]静止的成纤维细胞可能会分泌创伤愈合过程结束或维持静止组织所需的细胞外基质分子[45].我们监测了从含有增殖或CI14成纤维细胞的平板收集的条件培养液中分泌蛋白的水平[13]由于血清会干扰特定蛋白质的免疫印迹，因此这些实验是在无血清和0.1%血清条件下进行的。如所示CI14成纤维细胞条件培养液中的纤维连接蛋白、胶原21A1和层粘连蛋白α2的水平高于增殖成纤维细胞的条件培养液，因此表明接触抑制成纤维细胞具有生物合成能力，这可能有助于其高代谢率。
成纤维细胞增殖和静止之间的代谢变化综述
增殖和CI14成纤维细胞的代谢谱总结于处于增殖和接触抑制状态的成纤维细胞广泛利用糖酵解。增殖成纤维细胞依赖PPP生成核糖用于核苷酸生物合成，NADPH用于生物合成。接触抑制的成纤维细胞利用氧化PPP生成NADPH，碳骨架大部分以3-磷酸甘油醛和6-磷酸果糖的形式返回糖酵解。处于增殖和接触抑制状态的成纤维细胞为TCA循环贡献了一些葡萄糖碳。在接触抑制的成纤维细胞中，葡萄糖产生的碳通过TCA循环传递；在增殖的成纤维细胞中，柠檬酸盐和α-酮戊二酸盐之间的正向流动很小。接触抑制型成纤维细胞更依赖丙酮酸羧化酶从丙酮酸到草酰乙酸的补偿性流量；增殖的成纤维细胞更依赖谷氨酰胺，可能是因为它们对氮的需求更高。谷氨酰胺驱动TCA循环中的正向流量，也使α-酮戊二酸盐向柠檬酸盐的反向流量，特别是在接触抑制的成纤维细胞中。这种反向流动提供了一种将NADPH从线粒体穿梭到胞质溶胶的机制。
讨论
静止成纤维细胞利用其全部能量做什么？
我们发现，通过接触抑制诱导成纤维细胞进入静止状态，维持了较高的代谢率。在接触抑制的成纤维细胞中，核苷酸生物合成减少，但糖酵解、PPP和TCA的速率几乎完全保持。即使是接触抑制2周并在最后一周缺乏血清的成纤维细胞，其糖酵解通量也仅减少了2倍。接触抑制的成纤维细胞也可能通过TCA循环产生大量能量，在TCA循环中，我们观察到葡萄糖和谷氨酰胺衍生碳在超过一个完整循环中的流动。与这些多途径的能量生成一致，接触抑制型成纤维细胞的ATP/AMP比率较高(图S2).
然后，静止的成纤维细胞用它们所有的能量做什么？我们的数据表明，能源利用有三种途径。首先，接触抑制的成纤维细胞可能通过增加自噬持续降解和重新合成其大分子和膜成分[43],[44]（E.M.Haley、A.L.-M和H.A.C.，未发表的观察结果），这是一种有助于确保旧的和潜在损坏的大分子和膜不会积聚的策略。我们的数据表明，与增殖成纤维细胞相比，接触抑制的成纤维细胞降解蛋白质和脂肪酸的速度更快。与我们的数据最为一致的结论是，增殖和接触抑制的成纤维细胞合成氨基酸和脂肪酸的速率是可比较的，新生物量在增殖成纤维细胞中形成新细胞，而新生物量替代接触抑制成纤维细胞的降解分子。
其次，接触抑制和血清缺乏的成纤维细胞诱导产生NADPH的途径。我们发现三种NADPH生成酶G6PD、PGD和IDH1在静止状态下的表达水平高于增殖状态下的成纤维细胞。结果表明，静止的成纤维细胞激活了NADPH生成的酶诱导程序。NADPH的一个作用可能是确保GSH和硫氧还蛋白的可用性，以对自由基进行解毒。事实上，接触抑制组的总自由基水平低于增殖成纤维细胞（E.M.Haley和H.A.C.，未发表的数据）。生成的NADPH的另一个作用可能是支持脂肪酸的再合成，因为脂肪酸降解产生NADH，而合成需要NADPH。
第三，静止的成纤维细胞可能获得新的细胞类型特异性功能。淋巴细胞（除浆细胞外）在静止状态下缺乏主要的生物合成功能，与之相反，成纤维细胞即使在静止状态也会分泌细胞外基质所需的蛋白质和其他分子。接触抑制的成纤维细胞将其某些代谢活性导向这一生物合成目的，因为我们观察到，与增殖成纤维细胞相比，接触抑制成纤维细胞中的特异性细胞外基质蛋白水平升高(). 因此，静止的成纤维细胞解除了与生成子代相关的生物合成需求，可以将其蛋白质合成机制转向对整个生物体有益的蛋白质合成。
接触抑制的成纤维细胞分泌高水平的特异性细胞外基质蛋白。从增殖（P）和CI14成纤维细胞收集条件培养基（4d），条件培养基用无血清或0.1%血清和0.03%血小板衍生生长因子（PDGF-BB）进行增殖细胞的条件培养。将条件培养基的量标准化为蛋白质含量随时间的变化。沉淀条件培养基，并用纤维连接蛋白、胶原蛋白（col21a1）或层粘连蛋白（lama2）抗体进行免疫印迹。
安静的独特之处是什么？
我们的发现揭示了关于静止的一些更大的问题：静止状态的基本属性是什么？是否存在单一静态或多个静态？我们的结果表明，如淋巴细胞和胸腺细胞所报告的那样，静止不一定与糖酵解的停止有关[6]–[10]静止细胞实际上具有高度的代谢活性。在这方面，静止的成纤维细胞类似于终末分化细胞，如心肌细胞、神经元和肾小管上皮细胞，它们是哺乳动物中能量消耗最高的细胞。众所周知，这些最终分化的细胞利用营养物质实现收缩、信号传递和运输功能。它们的代谢活动，如接触抑制的成纤维细胞的代谢活动一样，是否也会持续刷新其蛋白质和脂质组成，值得进一步研究。
除了不同于静止淋巴细胞外，不同类型的静止成纤维细胞也可能不同。虽然CI7、CI14和CI14SS7成纤维细胞在形态学上或通过传统的细胞周期分析无法区分，但它们的代谢特征不同。与通过接触抑制诱导成纤维细胞静止相比，无血清的成纤维细胞乳酸排泄率降低，糖酵解中间产物池较小，丙酮酸到乙酰辅酶a的流量减少。我们的发现表明，不同类型的细胞实际上可能处于不同的静止状态，并且可能已经发现了与静止相关的代谢挑战的不同解决方案。
最后，我们的研究结果表明，接触抑制和血清缺乏的成纤维细胞特别容易受到DHEA（戊糖磷酸途径抑制剂）治疗诱导的凋亡。选择性杀死静止细胞的能力可能具有治疗潜力[46],[47]例如，肿瘤干细胞可以在静止状态下存在数年，同时保持从休眠中苏醒、增殖和引发肿瘤复发的能力。靶向这些细胞激活的通路以促进其在休眠期存活的小分子可能是我们治疗手段的有益补充。我们发现，接触抑制和血清缺乏的成纤维细胞依赖PPP和其他可能产生NADPH的反应来获得生存能力。像DHEA这样的小分子抑制剂可能最终被证明对靶向静止的肿瘤细胞有价值。
材料和方法
组织培养
如前所述，从包皮中分离出原代人成纤维细胞（参见[48]). 成纤维细胞保存在补充有10%胎牛血清（Hyclone）和100µg/ml青霉素和链霉素（Invitrogen）的DMEM（Hyclone，Thermo Fisher Scientific）中。细胞在增殖时收集，融合维持1周（CI7）后，融合维持2周（CI14）后，维持2周后，最后7天在0.1%血清中（CI14SS7），以及在0.1%血浆中饥饿3天、4天（SS4）或7天（SS7）后。单靠血清饥饿使细胞静止的细胞被足够稀疏地镀上，这样它们就不会接触周围的细胞。每2天更换一次培养基。在播种后第二天对增殖细胞进行取样。为了更好地模拟体内条件，我们还使用了低葡萄糖/低谷氨酰胺条件，其中葡萄糖水平为1 g/l，谷氨酰胺水平为0.7 mM，而标准DMEM中的葡萄糖水平为4.5 g/l，谷酰胺水平为4 mM。当细胞汇合时，培养基定期更换。为了进行分析，在实验前一天，用7.5%的透析胎牛血清（亚特兰大生物制品或Hyclone）将细胞转移到DMEM（Invitrogen）中。成纤维细胞通过尼康Eclipse TS100显微镜使用Scion 8位彩色火线1394数码相机拍摄。使用Scion VisiCapture软件（Scion）捕获图像。
细胞周期的流式细胞术
将细胞胰蛋白酶化并收集到含有5%牛生长血清（Hyclone）的磷酸盐缓冲液（PBS）中。将细胞制成颗粒，再悬浮在PBS中67%的乙醇中，并在4°C下保存。对于流式细胞术，细胞被造粒，用PBS洗涤，并用PI（40µg/ml）（VWR）和RNAse A（200µg/ml）（Thermo Fisher Scientific）在PBS中重新悬浮。样品在室温下在黑暗中培养1小时，并使用FACSort流式细胞仪（BD Biosciences）进行分析。PI在488nm处激发，并使用585/42nm的带通滤波器在探测器FL2上收集发射的荧光。使用CellQuest软件（BD Biosciences）收集并分析了至少20000个细胞。使用ModFit LT软件和Watson Pragmatics算法计算细胞周期分布。
吡喃Y的流式细胞术分析
分化G中的细胞0与G相比1，将代表每种静止状态的成纤维细胞胰蛋白酶化并悬浮在2×10浓度的冷Hank’s缓冲盐水溶液中6细胞/ml，然后添加到冰镇70%乙醇的固定剂中。细胞固定至少2小时，清洗，并在4×10的条件下重新悬浮6细胞/ml。将4µg/ml吡咯宁Y和2µg/mlHoechst 33342的溶液添加到细胞悬浮液中，并在冰上培养20分钟，然后通过流式细胞仪测量细胞周期状态。为了测定RNA含量，在488 nm处激发吡咯宁Y，在562-588 nm处测量发射。DNA含量由Hoechst 33342测定。在355 nm处测量激发，在425–475 nm处测定发射。G中的细胞0被鉴定为2N DNA含量和RNA含量低于S期水平的人群[49].
p27增殖和静止成纤维细胞的蛋白质含量及免疫印迹分析基普1、IDH1、G6PD和PGD水平
通过接触抑制、血清饥饿或文本或图中所示的组合使细胞静止，并在指定的时间收集。在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂（10 mM NaPO4[PH7.2]，0.3 M NaCl，0.1%SDS，1%NP40，1%脱氧胆酸钠，2 mM EDTA，蛋白酶抑制剂鸡尾酒）的RIPA缓冲液（50 mM Tris-Cl[PH7.4]，150 mM NaCl.，1%Triton X-100，1%脱氧胆酸钠盐，0.1%十二烷基硫酸钠）中溶解细胞和Halt磷酸酶抑制剂[SThermo Fisher Scientific]）。用五个脉冲以60 J/W的速度对裂解液进行超声处理，每个脉冲持续15 s。然后将裂解液在冰上培养30 min，并定期旋涡，然后在4°C、10000 rpm下离心2–5 min进行清除。按照制造商的说明，使用Lowry方法，使用Bio-Rad DC蛋白质检测试剂盒II（Bio-Rad-）评估总蛋白质量。将在650nm处获得的分光光度计读数与标准曲线进行比较，以确定裂解物浓度。总蛋白质含量测定为裂解液浓度和裂解液体积的乘积。在12%SDS-PAGE上分解等量的细胞总蛋白，并将其电转移到PVDF膜上。在室温下，在含有0.1%吐温-20（TBS-T）（10 mM Tris[PH7.6]、15 mM NaCl和0.1%吐温-20）的Tris缓冲盐水或含有0.1%Tween-20（PBS-T）的磷酸盐缓冲盐水（含5%脱脂奶粉）中封闭膜1小时。将膜与p27抗体（在TBS-T/5%牛奶中稀释1∶500）（Santa Cruz Biotechnology）、IDH1抗体（在PBS-T/1%牛奶中稀释一微克/毫升）（Lifespan Biosciences）、G6PD抗体（在PBS-T/1%奶中稀释一倍1500）（Novus Biologicals）或PGD抗体（在PPS-T/1%乳中稀释一比1000）（GeneTex）孵育过夜。培养后，将膜在TBS-T或PBS-T中清洗三次，并用辣根过氧化物酶结合的抗兔二级抗体（1∶3000稀释成TBS-T/5%牛奶中的p27或1∶10000稀释成PBS-T/1%牛奶中的IDH1和G6PD）培养1小时（GE Healthcare）。用TBS-T或PBS-T清洗膜三次，并用增强化学发光试剂盒（Pierce，Thermo Scientific）检测免疫反应带。根据制造商的说明，使用Restore Western Blot Stripping Buffer（Thermo Scientific）对膜进行剥离，并使用PBS-T/1%牛奶或TBS-T/5%牛奶中的GAPDH（Abcam）（1∶5000稀释）进行免疫印迹，作为负荷控制。
细胞内代谢物分析
如前所述，对细胞内代谢物进行了高度平行的测量[21]从增殖细胞、CI7、CI14或CI14SS7细胞中提取代谢物，方法是从培养皿中抽吸培养液，并用80%甲醇在−80°C下保持闪蒸猝灭代谢活性。细胞在甲醇中培养15分钟，在干冰上刮擦，并以4400 rpm离心造粒5分钟。样品用80%的干冰甲醇重新萃取两次。将三种提取物混合在一起，在氮气下干燥，溶解在300µl 50%甲醇中，并在13000×g下旋转5分钟。然后将甲醇上清液通过氨丙基柱[50]通过配备电喷雾电离源的Finnigan TXQ Quantum Ultra三重四极杆质谱仪（Thermo Fisher Scientific），用正离子质谱法分析柱中的洗脱液[22]TSQ Quantum Discovery MAX质谱仪也配备了电喷雾电离源，在25cm C18柱上与三丁胺离子对试剂耦合分离后，用于收集负模式离子的数据，以帮助保留极性化合物[51],[52].
为了量化代谢物，最初使用XCalibur软件（Thermo Fisher Scientific）指定峰高，然后手动评估。与仅含培养基的对照板相比，样品中富集了至少5倍的代谢物被保留在分析中。在监测的172种代谢物中，有62种符合这些标准。低于检测限的信号分配为100个。代谢物水平根据存在的蛋白质量进行标准化。
代谢通量分析
为了监测通过代谢途径的流量，样品与含有同位素标记营养素的培养基培养不同时间。通过添加回葡萄糖或谷氨酰胺（[U-13C] -葡萄糖[1,2-13C] -葡萄糖，[3-13C] -葡萄糖，或[U-13C] -谷氨酰胺；剑桥同位素实验室）达到最终浓度4.5 g/l葡萄糖或0.584 g/l谷氨酰胺。在更换培养基后的指定时间点采集样品，并按照上述方法进行处理。的级别12C和13使用LC-MS/MS监测C型代谢中间体[53].
代谢物摄入和排泄
在多种条件下从细胞中取样培养基：增殖、CI7、CI14、CI14SS7、SS4、SS7、低葡萄糖/低谷氨酰胺增殖和低葡萄糖/低谷氨酰胺CI14。根据实验结果，在0到96小时的时间过程中对条件培养基中的成纤维细胞进行取样。使用YSI 7100 Select生化分析仪（YSI Incorporated）测量葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和谷氨酸的水平。葡萄糖消耗率、乳酸排泄率、谷氨酰胺消耗率和谷氨酸排泄率被确定为这些代谢物在培养基中出现或消失的速度除以该时间段平板上细胞蛋白质质量的时间积分。
谷胱甘肽测定
根据制造商的说明，使用Cayman Chemical的谷胱甘肽检测试剂盒测定增殖、CI7、CI14和CI14SS7成纤维细胞的总GSH和GSSG含量（Cayman Chemical）。Cayman的GSH检测试剂盒采用了精心优化的酶循环方法，使用谷胱甘肽还原酶对GSH进行定量。简而言之，使用细胞提升器在1.5 ml冷缓冲液（即50 mM MES或含有1 mM EDTA的磷酸盐缓冲液[pH6–7]）中收集细胞，并在4°C下以10000×g离心15分钟，然后进行偏磷酸脱蛋白和添加三乙醇胺溶液。然后用2-乙烯基吡啶对一半样品进行处理，以完全量化GSSG池。加入测定鸡尾酒（2-（N-吗啉基）乙磺酸缓冲液[11.25ml]、重组辅因子混合物[4.45ml]、重组酶混合物[2.1ml]、水[2.3ml]和重组5,5′-二硫代双（2-硝基苯甲酸）[4.45ml]的混合物），在405nm的分光光度计中测量脱蛋白样品中的总GSH和GSSG。样品的谷胱甘肽浓度通过终点法测定，并以微摩尔浓度表示。
PPP抑制和PI活/死分析
用溶解于乙醇或二甲基亚砜（0.1%vol/vol）中的DHEA处理增殖和CI14成纤维细胞4天。在用抑制剂处理的第四天，将细胞胰蛋白酶化并收集到条件培养基中。然后以1000 rpm离心细胞5分钟。吸取上清液，用1µg/ml PI（VWR）在PBS中提取细胞。细胞保存在冰上，并立即使用BD-LSRII多激光分析仪（BD Biosciences）通过流式细胞仪进行分析。PI在488nm处激发，并通过610/20带通滤波器收集发射的荧光。使用FACSDiVa软件（BD Biosciences）收集并分析了至少40000个细胞。PI-阴性细胞计数为活细胞，PI-阳性细胞计数为死细胞。
PPP抑制与细胞凋亡分析
根据制造商的说明（Promega），使用ApoTox-Glo Triplex分析法，根据释放到培养基中的caspase-3/7水平测量细胞凋亡。细胞以每孔10000个细胞的速度分三次在白色、底部清晰的96个板中进行电镀（Costar，康宁生命科学公司）。对于接触抑制，在治疗开始前7天对细胞进行电镀；对于血清饥饿，在治疗前4d进行细胞培养，并在剩余的3d内切换至0.1%血清培养基；在开始治疗前一天，将增殖细胞进行培养。在每个孔的培养基中单独添加浓度增加的DHEA或乙醇载体，并进行4天的处理。在处理期间，在血清饥饿条件下的细胞也在0.1%的血清中培养。以100µl/孔的速度添加凋亡试剂，并在读取之前培养1 h。使用Synergy-2平板阅读器（Biotek）从顶部读取发光度。将发光数据归一化为仅适用于车辆的条件。
脂肪酸中碳含量的测量
使用先前公布的方案的修改版本测量谷氨酰胺的脂质合成[53]简单地说，在含有5µCi/ml[U-14C] -4 mM下的谷氨酰胺（0.4%标记）。培养24 h后，抽吸培养基，用PBS洗涤细胞，并通过添加500µl 3∶2己烷∶异丙醇提取磷脂。然后用额外的500µl己烷∶异丙醇混合物清洗培养皿。使用speed-vac干燥得到的总提取物，将其重新悬浮在500µl 1 N KOH和90∶10甲醇∶水中，并在70°C下培养60分钟以皂化脂类。然后添加硫酸（100µl，2.5 M），然后添加己烷（700µl）以提取皂化脂肪酸。通过离心和闪烁计数来分离有机相和水相。
微阵列分析技术
为了监测基因表达水平，将增殖的CI7或CI14成纤维细胞胰蛋白酶化，从平板上取出，造粒，并储存在−80°C下。根据制造商的说明，使用mirVana miRNA分离试剂盒（Ambion）分离总RNA。使用生物分析仪2100（安捷伦科技）验证RNA质量，并使用纳米滴分光光度计（纳米滴科技）测定数量。根据制造商的方案，使用低RNA输入荧光标记试剂盒（安捷伦科技公司）扩增总RNA（325 ng）。Cy-3（PerkinElmer）在体外转录过程中被直接掺入来自增殖细胞的cRNA中。Cy-5被并入CI7或CI14成纤维细胞的互补RNA中。将Cy-3标记和Cy-5标记的cRNA混合物在60°C下与全人类基因组寡核苷酸微阵列载玻片（安捷伦科技）共杂交17小时，然后根据安捷伦技术标准杂交协议进行清洗。载玻片用双激光扫描仪（安捷伦科技公司）进行扫描。对图像进行质量控制监测。安捷伦科技公司（Agilent Technologies）推出了提取软件，并与普林斯顿大学MicroArray数据库相结合(http://puma.princeton.edu/)，用于计算背景减除和染料归一化后每个基因的两个样本的对数比。整个实验进行了两次。
条件培养基中细胞外基质蛋白水平的分析
为了分析条件培养基中的细胞外基质蛋白，我们不能在高浓度血清的情况下进行实验，因为血清抑制免疫印迹后的蛋白转移。如前所述[13]在无血清或0.1%血清的血小板衍生生长因子存在下，增殖的成纤维细胞在低细胞密度下进行调节。静止成纤维细胞在不含血小板衍生生长因子的情况下高密度培养，无血清或0.1%血清。培养基经过4天的调节，在此期间，在一个时间过程中收集蛋白裂解物。细胞裂解物的蛋白质含量与裂解物收集时间成图。生成一条符合数据的曲线，曲线下的面积，即积分蛋白质-小时量，除以从增殖板或静止板收集的培养基体积。每个样品的总蛋白-小时/体积用于调整调节培养基的体积，然后将其与25%体积的含有0.1%脱氧胆酸钠（Sigma-Aldrich）的三氯乙酸（Sigma Aldrich。离心后，用−20°C丙酮清洗样品3-4次，再悬浮在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳样品缓冲液中，并在5%（对于纤维连接蛋白和COL21A1）或12%（对于LAMA2）的还原条件下分离。将蛋白质在100 V下转移到Westran聚偏氟乙烯膜（PerkinElmer）上1 h。在PBS-T中的5%脱脂奶粉中室温下将膜封闭1 h。然后在4°C下将膜与小鼠单克隆抗纤维连接蛋白克隆HFN7.1（1∶2000稀释，普林斯顿大学Jean Schwarzbauer慷慨捐赠）、小鼠抗COL21A1多克隆抗体（1∶750稀释，Abcam）、，或在PBS-T/1%牛奶中稀释的抗LAMA2（3µg/ml，Abnova）的小鼠单克隆抗体。在初级抗体中培养过夜后，在PBS-T中清洗膜三次，在1∶10000稀释的辣根过氧化物酶-结合羊抗鼠二抗（GE Healthcare）PBS-T/1%牛奶中培养1h。将膜暴露在X射线胶片上，使用Hewlett-Packard Scanjet 4890扫描软件对胶片进行扫描。用ImageJ分析软件测定单个谱带的强度。
通量的计算测定
通量是通过在定量通量平衡框架内整合所有可用形式的实验数据，使用与Munger等人所述相同的策略确定的。[53].ODE模型(图S3)构建了中枢碳代谢的模型。该模型假设稳态、质量平衡的通量，并模拟细胞从未标记介质切换到均匀介质后产生的标记动力学13C-标记葡萄糖或谷氨酰胺。该模型由55个ODE组成，描述了未标记代谢物的损失率和标记代谢物的积累率。它建立在前面描述的模型之上[53]有一些变化。交换通量(F类
12)在DHAP和FBP之间的糖酵解中引入。反向通量(F类
11)在TCA循环中引入了从α-酮戊二酸到柠檬酸盐，以及从未标记的潜在柠檬酸盐池（由所有实验中观察到的最低未标记柠檬酸盐池大小确定）。添加潜在的柠檬酸盐池是因为对于柠檬酸盐，而不是其他代谢物，池中的很大一部分（增殖细胞约为40%）在实验过程中没有标记。除了标记动力学之外，其他输入数据还包括代谢物水平、代谢物消耗和排泄率以及喂食后测定的糖酵解-PPP通量收敛比[1,2-13C] -葡萄糖2小时。通过遗传算法识别模型参数（通量以及无法直接通过实验测量的少量代谢物的池大小），该算法将成本函数最小化，该成本函数定义为实验数据和计算结果之间的加权差之和(表S3)[54]作为一种全局搜索算法，遗传算法通过计算探索与实验结果一致的替代通量解。对于每个单元类型，运行该算法直到获得1000个一致的解决方案（即，当算法达到收敛时产生最低成本值的参数集）。然后使用1000个值的分布来定量表示每个确定的参数。由于分布不是高斯分布，只有当增殖和静止成纤维细胞的分布不重叠时，才认为增殖细胞和静止细胞之间的通量在数量上不同。此措施可最大限度地减少仅确定一个或几个解决方案时可能出现的误报[54]虽然在定性上支持模型增强静止成纤维细胞中葡萄糖引起的胸膜炎流量-13C] -葡萄糖在第8小时测得，在数量上与其他标记数据不一致，这些数据仅涵盖孵育的前2小时。【3】-13C] -血糖数据因此被排除在计算分析之外。计算机代码可根据要求提供。
支持信息
图S1
增殖和静止成纤维细胞的糖分解率。（A） 使用YSI 7100生物分析仪监测增殖、CI7、CI14、CI14SS7、SS4、SS7、增殖性低血糖/低谷氨酰胺和CI14低血糖/低谷酰胺成纤维细胞的葡萄糖消耗率、乳酸排泄率、谷氨酰胺消耗率和谷氨酸排泄率。根据调节期间存在的细胞蛋白量对水平进行标准化。误差条表示标准误差。（B–E）用于确定报告速率的代谢物水平随时间变化的代表图。
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图S2
增殖、CI7和CI14成纤维细胞中的基本代谢产物。使用LC-MS/MS对代谢物进行分析。对单个代谢物水平进行蛋白质含量标准化。测定每个样品的CI7或CI14与所有实验中平均增殖代谢物水平之比的对数（基数2）。显示了四个实验的平均值，每个实验包含4-5个重复。误差条表示标准误差。
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图S3
中心碳代谢的通量平衡模型。建立了一个基于ODE的中心碳代谢模型来描述时间依赖性代谢标记。（A） 模型中通量的示意图。F类
0–F类
12表示未知通量，除了F类
9，这是潜在的己糖-磷酸盐池。A类,B类,C、和D类是摄取率和排泄率。X（X）,Y（Y）、和Z轴是上述通量和池大小的相关参数，其表达式由平衡所有相关通量确定。X（X）是蛋白质合成速率，Y（Y）是丙酮酸的回复通量，以及Z轴是苹果酸到草酰乙酸的净通量。（B） 葡萄糖和谷氨酰胺标记实验中同位素标记代谢形式的转换。代谢物名称下的数字表示标记代谢物的位置（“0”表示未标记的代谢物）。低丰度同位素标记形式，例如1×13柠檬酸C被排除在模型之外。
（1.15 MB畅通节能法）
图S4
中心碳代谢的建模结果。（A） 模型适用于增殖、CI7、CI14和CI14SS7成纤维细胞中的代谢物。根据典型通量溶液集的模型预测（平滑曲线）绘制指示时间点不同标记和未标记代谢物的实验测量浓度（平均值±一个标准偏差）。时间轴采用对数刻度，以更好地说明早期时间点的样本。[U的数据和模拟结果-13C] -葡萄糖标记实验仅标记代谢物名称。对于[U-13C] -谷氨酰胺标记，代谢物名称前有“Q”。（B） 每个条件下一致通量分布的直方图。这个x-轴表示通量值（以对数标度表示）；这个年-axis是具有特定通量值的计数数（在1000个一致解决方案集内）。由此得到的溶液分布提供了通量的表示，这些通量可能与在每个细胞状态下观察到的实验室数据一致。
（0.43 MB畅通节能法）
表S1
增殖和静止成纤维细胞的绝对流量。对于每个确定的通量，报告其分布的中值（A）和最佳值（即导致实验数据和计算模拟之间最佳匹配的值）（B）。静态条件下统计上高于增殖条件的通量值（即其分布不重叠）以红色突出显示，而静态条件下低于增殖条件的流量以蓝色突出显示。
（0.07 MB文件）
表S2
与[3孵育后的苹果酸和柠檬酸标记-13C] -增殖、CI7、CI14和CI14SS7成纤维细胞中的葡萄糖。
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表S3
遗传算法代价函数的组成部分的函数形式。总成本的表达式为
当模型结果完全符合所有实验数据时，最佳可能成本值为1。
（0.06 MB文件）
