纤溶酶原激活物抑制剂-1是p53诱导复制性衰老的关键下游靶点

摘要

原代小鼠成纤维细胞激活p19^{农业研究基金}–长期培养过程中的p53肿瘤抑制途径在体外诱导有丝分裂后状态，称为复制性衰老。衰老可以通过失去任一p19来克服^{农业研究基金}p53或三种视网膜母细胞瘤家族蛋白的联合缺失^1,2成纤维细胞的增殖由生长因子诱导，这些生长因子激活细胞周期素依赖激酶（CDKs），进而使pRb的生长抑制能力失活²G1细胞周期检查点在癌症中经常被解除管制^三目前尚不清楚在许多下游p53靶基因中，哪一个负责p53依赖性诱导复制性衰老。一个有吸引力的候选药物是CDK抑制剂p21基因^CIP1级然而，小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）被敲除p21基因^CIP1级不是不朽的⁴.

在此，我们确定尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）–PAI-1系统在诱导复制性衰老中的意外因果作用。蛇蛋白和细胞外基质（ECM）相关蛋白PAI-1是p53的直接靶点（参考文献。^5,6)，在衰老的成纤维细胞中上调体内和在体外，被认为是复制衰老的标志^7–9PAI-1通过形成稳定的复合物抑制分泌蛋白酶uPA的活性。uPA表达可使细胞通过G1进入S期¹⁰很可能是通过增加生长因子的生物利用度来激活有丝分裂信号级联。

为了研究PAI-1在复制性衰老中的作用，我们制备了两种独立的逆转录病毒载体，以小鼠为靶点PAI-1型通过RNAi进行抑制¹¹当主要MEF感染PAI-1型击倒（kd）构造(PAI-1型^克朗我或PAI-1型^克朗二)，在集落形成试验中观察到衰老旁路(图1a). 作为对PAI-1型表达导致uPA激活^12,13，我们询问uPA的过度表达是否也会导致永生。逆转录病毒介导的前uPA过表达与PAI-1型导致中小企业不朽的击倒(图1a). 评估PAI-1型感染MEF的水平，第53页^克朗,PAI-1型^克朗或美国公共行政管理局对过度表达的细胞进行连续传代，直到它们在第9代（P9）变为后衰老（即当对照MEF衰老时），并观察到PAI-1型mRNA表达PAI-1型^克朗通过定量RT-PCR（QRT-PCR）检测MEF；图1b). 作为PAI-1型是转录的p53靶点^5,6p53在复制性衰老过程中被激活，PAI-1型在衰老MEF中高度表达⁹因此，P9 MEF表达了更多PAI-1型大于P3或第53页^克朗细胞，具有可比性PAI-1型mRNA水平(图1b). uPA活性位于PAI-1和p53的下游，因此uPA过度表达的永生细胞PAI-1型表达水平与P9 MEF中观察到的表达水平相似(图1b). 在长期细胞增殖试验中检测PAI-1^克朗也使MEF的增殖能力远远超过野生型细胞（参见补充信息，图S1a). MEF的自发永生可能由p53突变或p19缺失引起^{农业研究基金}表达¹⁴−¹⁶，在PAI-1中未观察到^克朗根据正常p53依赖性DNA损伤反应判断的细胞（参见补充信息，图S1b). 同于第19页^{农业研究基金}PAI-1中的水平^{kd（分子量）}细胞与野生型衰老细胞中观察到的细胞具有可比性，我们得出结论p19^{农业研究基金}在击倒后表达式不会丢失PAI-1型与这些观察结果一致，PAI-1型淘汰赛(PAI-1型^–/–)MEF的增殖速度远远超过衰老检查点，尽管比第53页^–/–MEF公司(图1c). 重要的是，六个独立不朽PAI-1型^–/–DNA损伤后MEF细胞系p53功能正常(图1d).

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图1

PAI-1型丢失诱导小鼠原代成纤维细胞衰老。(一)原发性MEF中过度表达所示结构的集落形成分析。的击倒向量第53页作为阳性对照。(b条)相对PAI-1型通过QRT–PCR对所示衰老后多克隆细胞系提取物的表达进行分析。P3为年轻第3代，P9为衰老第9代MEF。(c（c）)的增长曲线PAI-1型^–/–,第53页^–/–和野生型（WT）MEF。对于每个基因型，显示了六种独立培养物的平均值±标准差。(d日)六个独立的自发不朽系（spi）的Western blot分析PAI-1型^–/–通道19（P19），第53页^克朗和第16页^{INK4A（墨水）}–第19页^{农业研究基金}-显示p53及其靶点p19状态的缺陷永生NIH3T3细胞系^{农业研究基金}和p21^CIP1级顺铂诱导DNA损伤后。CDK4是一个加载控件。未截取的完整扫描显示在补充信息.

接下来，我们试图了解MEF永生化的分子途径PAI-1型敲除或uPA过度表达。肿瘤抑制因子p16^{INK4A（墨水）}和第21页^CIP1级在P9 MEF和永生PAI-1中诱导^克朗或uPA过度表达细胞，表明这些MEF中的衰老应激途径被激活(图2a). 有趣的是，在非增殖P9和增殖PAI-1中观察到细胞周期蛋白D1水平急剧增加^克朗或uPA过度表达MEF，这可能中和p21的高水平^CIP1级(图2a). 我们询问是否涉及通过PI（3）K、PKB（也称为AKT）和GSK3β的信号传导。激活PI（3）K并随后通过Ser 473上的磷酸化完全激活PKB，导致PKB抑制Ser 9上GSK3β的磷酸化^17,18GSK3β通过抑制Thr 286的磷酸化作用控制细胞周期蛋白D1的定位和降解，这种抑制磷酸化作用的丧失可保护细胞周期蛋白D_1免受核排斥和降解¹⁹因此，通过PI（3）K–PKB–GSK3β的有丝分裂信号影响细胞周期蛋白D1的稳定性及其核活性，导致细胞周期进展²uPA诱导生长因子相关PI（3）K–PKB信号²⁰因此，uPA活性可能通过Ser 9上的磷酸化导致GSK3β活性的丧失，从而导致cyclin D1的核滞留。当在老化MEF中测定细胞周期蛋白D1的定位时，观察到细胞周期蛋白D1显著但逐渐的核排斥(图2b)，这与生长速率的下降相关（注意，野生型MEFs在第8代时完全衰老；参见补充信息，图S2a经衰老相关酸性β-半乳糖苷酶染色证实²¹，SA-β-Gal；数据未显示）。此外，在连续传代过程中，野生型MEF通过失去磷酸化而表现出PKB活性的逐渐下降，通过失去抑制性磷酸化而逐渐增加GSK3β活性(图2c). 相反，永生PAI-1^克朗或uPA过度表达的MEFs持续PKB–GSK3β信号传导（参见补充信息，图S2b). 因此，我们得出结论，在复制衰老过程中，细胞周期蛋白D1被排除在细胞核外，并在胞质溶胶中稳定，这与生长速率下降和PKB–GSK3β信号下调有关。衰老细胞中高水平的细胞周期蛋白D1(图2a)是意料之外的，因为GSK3β活性不仅诱导核排斥，而且还诱导细胞周期蛋白D1的转换（参考文献。¹⁹). 值得注意的是，在衰老的人BJ成纤维细胞中也观察到高水平的细胞周期蛋白D1(图5c). 显然，与循环NIH3T3细胞相比，衰老细胞中cyclin D1的周转不同¹⁹.

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图2

在复制衰老过程中，MEFs减少PKB的激活并将细胞周期蛋白D1从细胞核中排除。(一)P3、P9、，第53页^克朗,PAI-1型^克朗或美国公共行政管理局细胞周期相关蛋白的过度表达MEF。PCNA和CDK4分别是增殖和负载控制。(b条)连续传代MEF（P1–P8）细胞周期蛋白D1表达的定性免疫荧光显微镜分析。比例尺代表50μm。(c（c）)磷酸化PKB或GSK3β的表达与P3、P6和P9 MEF中相同蛋白质的非磷酸化部分和衰老后相关第53页^克朗westernblot分析细胞。

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图5

PAI-1对人BJ成纤维细胞的衰老是必要的和充分的。（a）)原代人BJ成纤维细胞过度表达所示结构的生长曲线。显示了每个基因型三个独立培养物的平均值±标准差。(b条)相对PAI-1型和p21基因^CIP1级通过QRT–PCR分析指示的衰老后BJ细胞系和对照感染的年轻或衰老BJ成纤维细胞的表达。(c（c）)细胞的Western blot分析一对于p53目标p21^CIP1级和细胞周期相关蛋白cyclin D1。CDK4是一个加载控件。(d日)SA-β-Gal阳性衰老后细胞的定量PAI-1型^克朗或第53页^克朗逆转录病毒过度表达后的BJ成纤维细胞PAI-1型,PTEN公司,GSK3β,p21基因^CIP1级或RFP控件。显示了三块独立板的平均值±s.d。(e（电子）)衰老后的集落形成分析第53页^克朗或PAI-1型^克朗BJ成纤维细胞感染指示的逆转录病毒过表达结构。招标书为阴性对照。(如果)成纤维细胞衰老模型的示意图。p53诱导PAI-1型和p21基因^CIP1级在培养过程中老化。PAI-1通过PI（3）K–PKB–GSK3β和p21拮抗uPA–GF（生长因子）向细胞周期蛋白D1的信号传导^CIP1级直接阻断细胞周期蛋白D1的活性。PAI-1–cyclin D1连接在p21上占主导地位^CIP1级活性并控制p53下游和pRb上游衰老反应的诱导。

接下来，我们研究了MEF是否通过PAI-1型敲除可能是PI（3）K–PKB–GSK3β信号激活的结果。用PI（3）K（p110α）组成活性突变体逆转录原代MEF^民航总局; Ca-PI（3）K）或PKB（Myr-PKB；Ca-PKB），一种针对GSK3β的逆转录病毒击倒短发夹RNA（shRNA）构建物，或针对野生型细胞周期蛋白D1（D1）或不可降解细胞周期蛋白D1（T286A-cyclin D1；TA-D1）的逆转录酶表达构建物，并在克隆形成分析中确定其永生化潜力。TA-D1突变体对GSK3β的磷酸化不敏感，因此是组成核¹⁹我们发现Ca-PI（3）K、Ca-PKB、GSK3β^克朗或TA-D1（但不是野生型D1）能够使野生型MEF永生化(图3a). 此外，无p19丢失^{农业研究基金}在任何永生化MEF中都发现了p53的表达或突变证据（数据未显示）。在长期增殖试验中，Ca-PI（3）K、Ca-PKB、GSK3β的过度表达^克朗或TA-D1（但不是野生型D1）也诱导了MEFs衰老的旁路(图3b). 同样，永生化并没有伴随着p19的丢失^{农业研究基金}或p53功能（数据未显示）。如前PAI-1所述^克朗或uPA过度表达MEF(图2a)，p21的诱导^CIP1级表达Ca-PI（3）K、Ca-PKB、GSK3β的衰老后多克隆细胞系的蛋白质水平^克朗，或注意到TA-D1构建体（参见补充信息，图S2c). 此外，在Ca-PI（3）K或Ca-PKB过度表达细胞中观察到高PKB-GSK3β信号传导，并降低GSK3^克朗单元格（请参见补充信息，图S2d). 我们的研究结果表明，PI（3）K–PKB信号传导的强制组成型激活、GSK3β活性的降低或细胞周期蛋白D1的核保留，足以绕过p53下游MEFs的衰老。因此，与表达衰老野生型或HA-tagged cyclin D1的MEF相比，用本研究中使用的各种结构永生化的MEF的衰老后多克隆细胞系的免疫荧光显微镜分析显示内源性cyclin D_1的核定位(图3c并查看补充信息，图S2e).

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图3

持续的PI（3）K-PKB信号或细胞周期蛋白D1的核滞留诱导衰老旁路。(一)感染所示逆转录病毒构建物的原发性MEF的集落形成分析。不朽的效率控制是第53页^克朗1或3周后MEF染色。(b条)各种描述的永生结构与野生型的生长曲线细胞周期蛋白D1受感染的MEF。的过度表达第53页^克朗或控制向量分别为正控制和负控制。结果显示每个结构（I，II）有两种独立感染。(c（c）)定性免疫荧光显微镜分析用所示结构和对照P3和P9 MEF永生化的衰老后MEF的细胞周期蛋白D1。比例尺代表50μm。

为了检测PI（3）K–PKB–GSK3β信号的减少是否足以诱导衰老，在第53页-耗尽的细胞。逆转录病毒cDNA表达构建物用于人类PAI-1型（它不是小鼠PAI-1的靶点^克朗向量），鼠标PTEN公司和GSK3βPTEN是一种强效肿瘤抑制因子，常在癌症中缺失，可阻断PI（3）K的激活²²并通过调节细胞周期蛋白D1的核可用性发挥其作用（参考。²³). 当在中过度表达时第53页^克朗或PAI-1型^克朗细胞、PAI-1、PTEN和GSK3β均能单独诱导衰老，如扁平细胞形态和SA-β-Gal阳性染色所示(图4a–d). 为了测试细胞周期蛋白D1是否是PAI-1下游的重要靶点，PAI-1在第53页^–/–MEFs、过度表达TA-D1的MEFs或口袋蛋白缺乏的三重敲除细胞（pRb^–/––第107页^–/––第130页^–/–; TKO）。不朽的TKO对照缺乏视网膜母细胞瘤家族功能，因此具有持续的E2F活性^24,25在正常成纤维细胞中，pRb（家族）-E2F介导的抑制是细胞周期退出对p19的反应所必需的^{农业研究基金}–p53激活²⁶因此，MEF中TA-D1的过度表达可能与通过阻断视网膜母细胞瘤家族功能在TKO细胞中看到的表型相似。图4e表明PAI-1在第53页^–/–细胞，但当这些细胞也表达TA-D1或口袋蛋白缺乏时则不会。这些结果表明，在存在野生型细胞周期蛋白D1蛋白的情况下，PAI-1能够诱导停搏，但在细胞周期蛋白D_1构成核且对GSK3β不敏感的情况下则不能诱导停搏。

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图4

PAI-1型表达足以诱导复制性衰老。(一)PAI-1型,PTEN公司或GSK3β过度表达诱导衰老第53页^克朗衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色显示MEF。对照细胞为模拟感染、血清耗尽（饥饿）和野生型衰老MEF。比例尺代表400μm。(b条)SA-β-Gal阳性的定量第53页^克朗逆转录病毒过度表达构建物后的细胞一显示了三块独立板的平均值±s.d。(c（c）)不朽菌的菌落形成测定PAI-1型^克朗所示结构的逆转录病毒过度表达后的MEF。p21基因^CIP公司1和红色荧光蛋白(招标书)分别为阳性和阴性对照。(d日)SA-β-Gal阳性的定量PAI-1型^{kd（分子量）}逆转录病毒过度表达后的MEFPAI-1型,PTEN公司,GSK3β,p21基因^CIP1级或一个招标书控件。所示为每次感染的平均值±标准差。(e（电子）)不朽菌的菌落形成测定第53页^–/–,TA-D1型或TKO公司视网膜母细胞瘤家族三重基因敲除；卢比^–/––第107页^–/––第130页^–/–)用指示的逆转录病毒过表达结构感染成纤维细胞。

首先，人类成纤维细胞的衰老反应主要依赖于p53（M1检查点），与MEF一样，PAI-1在衰老过程中上调，是这些细胞衰老的标志^7,27当原代人BJ成纤维细胞感染两种独立的人类特异性细胞中的任何一种时PAI-1型击倒结构（PAI-1^克朗I或PAI-1^克朗二） 长期生长试验中观察到M1衰老旁路(图5a). 与MEF一样，uPA的过度表达也诱导了原代BJ细胞的衰老旁路，尽管效率较低(图5a). 当衰老后和增殖人群加倍（PD）68 PAI-1时^克朗进行了化验PAI-1型水平，甚至低于在年轻的PD 30 BJ成纤维细胞中观察到的水平(图5b).PAI-1型PD68 uPA过度表达的BJ细胞中的水平与衰老细胞中的类似，这与uPA作用于p53下游的观点一致。PAI-1型^克朗或uPA过度表达的成纤维细胞具有明显较高的p21基因^CIP1级比p53^克朗单元格(图5b、c)，与PAI-1的概念一致^克朗调节p53下游的衰老旁路。p53是PAI-1中的野生型^克朗或uPA过表达的BJ成纤维细胞也受到其对DNA损伤的正常反应的支持（数据未显示）。如在MEFs中观察到的，PAI-1中细胞周期蛋白D1的诱导^克朗观察到uPA在衰老后的BJ细胞以及非增殖衰老的BJ电池中过度表达(图5c). 此外，在老化的BJ成纤维细胞中发现细胞质周期蛋白D1增加，这与p21相关^CIP1级（请参见补充信息，图S4a–c)尽管细胞周期蛋白D1的核-细胞质转变似乎不像衰老MEF中那样明显。重要的是，小鼠PAI-1、PTEN或GSK3β在不朽人类p53中的过度表达^克朗或PAI-1^克朗细胞阻滞和SA-β-半乳糖染色(图5d，e)表明PAI-1的表达和PI（3）K–PKB–GSK3β信号通路的下调也足以诱导p53和PAI-1下游的人成纤维细胞衰老。综上所述，我们得出结论，PAI-1对于人BJ成纤维细胞的衰老是必要的和充分的。作为p21基因^CIP1级是人成纤维细胞衰老反应中一个重要的p53靶点^28,29，我们问p21是否同时被击倒^CIP1级PAI-1可诱导比单独使用两种方法更有效的衰老旁路。击倒任何一种表达PAI-1型或p21基因^CIP1级导致衰老旁路的效率低于敲除第53页（请参见补充信息，图5a、b). 有趣的是，同时击倒PAI-1型和p21基因^CIP1级导致了比击倒第53页自身（参见补充信息，图S5a−c). 我们得出结论，PAI-1和p21^CIP1级两者都是p53在诱导人成纤维细胞衰老中的相关下游靶点，从其联合敲除的效果可以明显看出。

在这里，我们表明PAI-1是衰老小鼠和人类二倍体成纤维细胞衰老反应中p53的关键下游靶点。我们的数据表明，p53通过上调PAI-1控制生长因子依赖性增殖，导致PI（3）K-PKB信号下调和细胞周期蛋白D1的核排斥。相反，我们发现PAI-1型MEFs中uPA的表达或过表达通过诱导持续的PI（3）K-PKB信号传导和细胞周期蛋白D1核滞留，赋予了对p53抗增殖活性的抵抗力。我们的数据与PAI-1在诱导复制性衰老过程中限制cyclin–CDK活性的模型一致，并表明PAI-1作为成纤维细胞增殖能力的分泌门控者的作用(图5f).

我们发现，有丝分裂原刺激的PI（3）K-PKB通路与成纤维细胞的衰老旁路有关，其拮抗物PTEN的过度表达²²，可以反转此过程。据报道，PTEN的水平在决定成纤维细胞的衰老反应中至关重要——PTEN的部分丢失具有增殖优势，而所有PTEN的急性丢失都会导致衰老³⁰与此一致的是，我们发现PTEN公司在野生型MEF中，尽管没有达到Ca-PI（3）K或Ca-PKB过度表达细胞的程度（参见补充信息，图S3b). 我们的数据显示活性PKB可以绕过衰老，但与此明显冲突的是，有报道称活性PKB的过度表达导致衰老的诱导。然而，当这些细胞随访6天以上时，感染人群的增殖并未完全消失³⁰我们在较长的时间内选择了PKB感染的野生型MEF，因此对增殖细胞进行了富集，可能只有适度增强的PKB活性。综上所述，这些数据支持以下观点：PKB水平稍高或PTEN部分丢失会导致增殖增强，而PKB高度升高或PTEN完全丢失会导致衰老。这让人想起RAS信号传导中观察到的情况，在RAS信号转导中RAS系统癌基因诱导衰老，而在生理水平表达的活化RAS具有生长优势³¹.

PAI-1型由多种生长因子诱导，是c-Myc的靶点^7,32uPA转录及其细胞外活性受生长因子信号和蛋白酶调节。因此，PAI-1的诱导可能是生长因子刺激的负反馈回路的一部分，该回路在衰老成纤维细胞中被p53组成性激活。因此，衰老的成纤维细胞可能通过分泌PAI-1诱导生长因子无反应状态。因此，归纳PAI-1型p53或uPA或PAI-1水平的紊乱影响肿瘤内异型信号和局部肿瘤微环境。这一点尤其值得注意，因为uPA和PAI-1参与伤口愈合、血管生成和转移^12,33-主要受细胞-细胞信号调节的过程³⁴此外，uPA由乳腺癌和前列腺癌侵袭前沿的基质成纤维细胞和肌成纤维细胞分泌³⁵uPA的丢失可以减少小鼠模型的转移^36,37越来越清楚的是，基质组织在肿瘤转化和转移中起着不可或缺的作用^38,39，我们的观察可能有助于更好地了解成纤维细胞在癌症中的作用。

方法

补充材料

致谢

脚注

参考文献