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生物化学杂志。2010年10月15日；285(42): 32486–32493.
2010年8月6日在线发布。 数字对象标识：10.1074/jbc。M10.139576号
预防性维修识别码：项目经理2952250
PMID：20693280

膜弯曲诱导和管状化是突触核蛋白和载脂蛋白的共同特征*保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg

约宾·瓦基,‡ 何塞·马里奥·伊萨斯,‡ 水野直子,§ 马丁·博尔奇·延森, 维克拉姆·科勒（Vikram Kjöller Bhatia）, 克里斯汀·饶,‡ 吉特卡·佩特洛娃,‖ 约翰·沃斯,‖ 迪米特里奥斯·斯塔姆, 阿拉斯代尔·史蒂文,§和拉尔夫·兰根‡,1
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关联数据

补充资料

摘要

突触核蛋白和载脂蛋白与许多膜和脂质转运事件有关。这两种蛋白质的脂质相互作用是由11个氨基酸重复序列介导的，这些重复序列形成两亲性螺旋。这种相似性表明，突触核蛋白和载脂蛋白可能对脂质膜有类似的作用，但这尚未直接显示。在这里，我们发现α-突触核蛋白、β-突触核蛋白和载脂蛋白A-1具有保守的功能，可以诱导膜弯曲，并将大的小泡转化为高度弯曲的膜小管和小泡。由此产生的结构在形态上与角蛋白类似，角蛋白是一种参与内吞作用的弯曲诱导蛋白。然而，与两性生长素不同的是，联核蛋白和载脂蛋白不需要任何支架结构域，曲率诱导仅通过两亲性螺旋的膜插入和楔入介导。此外，我们经常观察到α-突触核蛋白引起的膜结构具有初生芽囊泡的外观。α-突触核蛋白在囊泡运输中起作用，并增强内吞作用，其作为囊泡出芽的最小机制的能力与最近的研究结果非常一致。膜曲率的诱导必须严格控制体内; 然而，正如我们发现的那样，它也会破坏膜的完整性。由于膜弯曲诱导的程度取决于多种蛋白质的协同作用，因此控制微管蛋白的局部蛋白质密度可能很重要。细胞保护机制如何防止这种潜在的毒性事件，以及它们在疾病中是否会出错，仍有待确定。

关键词：载脂蛋白，电子显微镜（EM），膜，帕金森病，突触核蛋白，11个氨基酸重复，两亲螺旋，膜重塑

介绍

几种家族性帕金森病（PD）2与α-突触核蛋白的突变有关，动物研究进一步支持该蛋白在神经退行性变中的致病作用(1,2). α-突触核蛋白是一种主要的突触前蛋白，但在PD中，它在称为路易小体的细胞内包涵体中形成纤维和沉积(三).

α-突触核蛋白的膜相互作用对该蛋白的病理和生理功能具有重要意义(4,5). 虽然其生理作用尚未完全了解，但人们认为α-突触核蛋白与突触小泡结合，在神经元可塑性中起作用，调节神经递质的释放，在小泡运输中起作用并影响脑脂代谢(6,–14). 最近发现α-突触核蛋白的过度表达增加了海马神经元的基础和诱发突触囊泡内吞，这一发现支持了内吞作用(15). 然而，α-突触核蛋白也被证明破坏了细胞膜的完整性。α-synuclein在PD细胞系和动物模型中的过度表达为高尔基体裂解提供了证据(16,17)，线粒体变性(18,19)，溶酶体损伤(20)以及内质网和核膜的损伤(21). 此外，脂质是路易小体的重要组成部分，并被认为来源于降解的膜细胞器(22). 尽管α-突触核蛋白的齐聚和聚集可能是破坏膜完整性的重要因素(23,–26)α-synuclein促进细胞膜破裂的分子机制目前尚不清楚。因此，更好地理解α-突触核蛋白膜的相互作用可能有助于阐明其生理和病理作用。

许多生物物理研究已经得出结论，α-突触核蛋白的膜相互作用是曲率敏感的(27,–29)曲率敏感的膜结合由延伸的螺旋结构介导(27,30,–34). 最近的工作揭示了其他蛋白质的存在，这些蛋白质主要参与膜重塑和囊泡运输事件，具有与α-突触核蛋白类似的曲率感知能力(35,–37). 有趣的是，其中一些蛋白质具有将适度弯曲的双层转化为小而高度弯曲的囊泡或小管的额外能力(35,36,38). 嗜内激素和两性激素就是这种参与内吞作用的弯曲诱导蛋白的例子。这两种蛋白质都具有高度弯曲的BAR结构域，其凹面富含碱性残基(39,–41). 这些结构表明了一种支架机制，其中凹面直接与膜相互作用并塑造其形状(35,36,39,–42). 然而，这两种蛋白质都有一个N-末端的两亲性螺旋，可以通过楔入双层来促进弯曲(36,38,39,43,44). 此外，亲内素包含一个中心插入区域，它也形成一个膜插入的两亲螺旋(39,45,46).

考虑到两亲性螺旋的楔入可能足以导致膜弯曲，我们开始测试α-突触核蛋白是否能够产生这种效果。α-突触核蛋白可能诱导细胞膜的形态改变(31,47,48)，但尚未进行详细调查。例如，目前尚不清楚这种相互作用是否主要促进了膜曲率的增加或减少，因为据报道α-突触核蛋白会增加和减小囊泡大小(31,47,48). 一些研究报告称，α-突触核蛋白和其他淀粉样蛋白的膜相互作用可导致囊泡产生投射。虽然有人认为这些突起是由α螺旋形式诱导的膜小管(47)，它们通常被认为来源于富含β-薄片的纤维或其他与脂质混合的错误折叠形式(49,–52).

为了进一步测试诱导膜弯曲的能力是否是α-突触核蛋白和相关的11个氨基酸重复蛋白的共同特性，我们在本研究中还包括了β-突触核素和载脂蛋白a-1（apoA-1）。与α-突触核蛋白一样，这两种蛋白质的11个氨基酸重复区也可以形成与膜相互作用的双亲螺旋(53,–56). β-突触核蛋白与α-突触核素具有高度的序列相似性，但缺乏11个氨基酸重复序列，不易形成纤维(57). ApoA-1与膜和脂质颗粒相互作用体内已知在脂质代谢中起重要作用(53,58).体外众所周知，载脂蛋白可形成含脂盘，但其形成机制尚不清楚(59). 尽管长期以来人们怀疑联核蛋白和载脂蛋白可能对脂质膜有类似的作用，但这并没有直接显示出来。

实验程序

α-Synuclein、β-Synuclean、Amphiphysin和ApoA-I的制备

人α-synuclein和β-synuclean在大肠杆菌BL21（DE3）pLysS细胞，并按照之前的报告生成(60). 简单地说，细胞通过煮沸溶解，然后进行酸沉淀。上清液通过阴离子交换柱，用0–1.0洗脱米NaCl梯度。用Superdex 200柱进一步对人β-突触核蛋白进行凝胶过滤。

人类apoA-I在N末端含有六H亲和标记，在大肠杆菌如前所述，使用pET-20b载体培养BL21 Star（DE3）细胞株（Invitrogen）(61). 在His-Trap-Nickel-相关（GE）柱上使用pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水（PBS）和3米胍。然后在含有100 m的PBS（pH 7.4）中清洗蛋白质米咪唑，然后用含有500 m的PBS洗脱米咪唑。使用与PBS（pH 7.4）平衡的Bio-spin柱（Bio-Rad）从蛋白质样品中去除咪唑。

含有His的质粒6-标记的N-BAR结构域（氨基酸1-244）果蝇属两性激素由Harvey McMahon博士（医学研究委员会）提供。该蛋白表达于大肠杆菌BL21（DE3）pLysS细胞并使用镍-硝基三乙酸-葡萄糖进行纯化，然后使用Superdex 200凝胶过滤，最后使用由以下两种缓冲液组成的缓冲梯度进行单S阳离子交换色谱：缓冲液A（20 m米Hepes pH值7.4，1 m米二硫苏糖醇（DTT）和缓冲液B（20 m米Hepes pH值7.4 2米NaCl和1米米DTT），蛋白质洗脱约600 m米氯化钠。

磷脂囊泡的制备

以下合成脂类用于制备不同的膜成分：1-棕榈酰-2-油酰基-锡-甘油-3-磷酸乙醇胺（POPE），1-棕榈酰-2-油酰基-锡-甘油-3-磷酸-我-丝氨酸（POPS），1-棕榈酰-2-油酰基-锡-甘油-3-磷酸胆碱（POPC）和1-棕榈酰-2-油酰基-锡-甘油-3-[磷酸-RAC-（1-甘油）]（POPG），1,2-二油酰基-锡-甘油-3-磷酸-我-丝氨酸（DOPS），1,2-二油酰基-锡-1,2-二油酰基甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）-锡-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）、胆固醇、鞘磷脂。所有脂质均购自Avanti Polar lipids Inc.（Alabaster，AL）。通过在所需的缓冲液中旋转干燥的脂质膜，制备用于电子显微镜研究的大型非挤压囊泡。增加2m米缓冲液的EGTA表明，观察到的微管化不依赖于金属离子，如钙2+(补充图S5C).

磷脂囊泡清除率测定

通过使用Jasco V-550紫外/可见分光光度计测量光散射随时间的变化来监测α-突触核蛋白清除大脂泡的能力。监测波长设置为500 nm，狭缝宽度为2 nm，响应时间适中。简单地说，脂泡悬浮在20米米100 m pH值为7.4的Hepes米最终体积为500μl的NaCl置于石英试管中。

圆二色性（CD）

所有CD光谱都是在室温下使用Jasco J-810分光偏振仪和1mm石英池获得的。所有实验均使用50 nm/min的扫描速度、1 nm的带宽、0.1 nm的时间响应和0.5 nm的阶跃分辨率。根据蛋白质中色氨酸和酪氨酸分子的数量，使用蛋白质在280nm处的消光系数测定蛋白质浓度。在类似条件下收集适当的空白，并减去空白以获得最终光谱。A 10米米所有CD研究均使用pH为7.4的磷酸钠缓冲液。

荧光显微镜

巨型囊泡的制备如下：用POPG、POPG/POPE（1:1）、POPG/POPC（1:1）制备脂质混合物，并补充0.5%的1,2-二醇-锡-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）-Atto633（Attotec）和0.5%DOPE-生物素（Avanti）。在聚四氟乙烯杯中形成一层薄薄的脂质膜，并在37°C下重新水化过夜。脂质体的制备需要在37°C下进行2天的复水，并且不需要挤压。将巨大的脂质体固定在分析表面上，并在室温下与蛋白质孵育30分钟。

Alexa488标记的α-突触核蛋白Y136C衍生物与Alexa-488（Invitrogen）的10倍摩尔过量反应4h，得到Alexa488-标记的α-synuclein。使用PD-10柱（GE）凝胶过滤去除未反应染料。如前所述，用BSA:BSA-生物素混合物对玻璃表面进行钝化，然后涂上链霉亲和素，生物素化囊泡附着在链霉亲和素上(62). 显微镜在徕卡TCS SP5共焦荧光显微镜上进行，AOBS/AOTF系统允许波长检测间隔可调。所使用的物镜是一台放大倍率为100倍、数值孔径为1.4的油浸HCX PL APO。Alexa488标记的α-突触核蛋白在488 nm处用氩激光激发，同时在495 nm至555 nm处检测。含有DOPE-Atto633染料的囊泡在633nm处激发，检测范围为640-790nm。在实验期间同时记录两个通道，时间分辨率为～1.5 s。显微镜保持在22°C的恒定温度下。

电子显微镜

样品被负染以进行透射电子显微镜研究。将安装在铜格栅（EMS）上的碳涂层formvar膜漂浮在10μl样品液滴上5分钟，并用滤纸从格栅中去除多余液体。然后用2%醋酸铀酰对网格进行染色。使用加速至100 kV的JEOL 1400透射电子显微镜进行样品观察。

染料泄漏检测

泄漏试验是根据以前的方法修改的(63). 通过将干燥的脂质重新悬浮在9m的培养基中，制备了由66%POPG/33%POPE、100%POPG或POPG/POPC（摩尔比为1:1）组成的大单层囊泡（LUV）米ANTS（8-氨基萘-1,3,6-三磺酸，二钠盐）和25 m米DPX（DPX）[第页-双二甲苯（溴化吡啶）]（Invitrogen）。该脂溶液经过10次冷冻/解冻循环处理，通过将脂混合物通过带有1μm截止聚碳酸酯膜（Avanti Polar Lipids Inc.）的微型挤出器（20×），形成直径为1μm的大囊泡。使用PD-10柱（GE）通过凝胶过滤去除未包封染料。最终浓度为0.04%的Triton-X 100时，泄漏率达到100%。所有数据均归一化为100%泄漏。使用JASCO荧光计（FP-6500）记录荧光测量值，将激发和发射分别设置为380nm和520nm，狭缝分别为5nm和20nm。

结果

α-突触核蛋白将带负电荷的囊泡转化为较小的结构实体

为了测试α-突触核蛋白是否能诱导磷脂囊泡的形状和大小发生变化，我们将α-突触核蛋白与含有POPG的大囊泡孵育，并目视检查囊泡悬浮液。该试验类似于先前为研究载脂蛋白和洗涤剂对囊泡结构的影响而建立的试验(64,–66). 由于其尺寸较大，未经挤压的小泡表现出强烈的分散性，并呈现乳白色外观(图1A类). 值得注意的是，与α-突触核蛋白孵育仅1小时后，囊泡悬浮液就变得完全透明。在更定量的方法中，我们通过记录悬浮液在500nm处的吸收来监测光散射。如所示图1B在最初的5分钟内，分散度的降低表现出非常快的动力学，然后开始趋于平稳。随着α-突触核蛋白含量的增加，逐渐减少囊泡悬浮液的分散度，这种效应具有剂量依赖性。这些结果表明，α-突触核蛋白可以将含有POPG的大囊泡重塑为较小的结构实体。相反，当使用含有两性离子POPC的大囊泡进行类似实验时，未观察到任何变化。

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α-突触核蛋白清除磷脂囊泡。 A类，含有600μ的试管照片米添加60μ米α-突触核蛋白。由于囊泡尺寸较大，因此会散射光线，但添加α-突触核蛋白会使悬浮液变得清晰。B通过记录500nm处的表观吸光度，连续监测不同量α-突触核蛋白存在下磷脂小泡的清除。POPG囊泡（400μ米)在缺乏α-突触核蛋白的情况下破碎的蓝色痕迹POPG囊泡（400μ米)用10μ孵育米, 20 μ米和40μ米α-突触核蛋白的蓝色,绿色、和红色痕迹分别是。控制POPC囊泡（400μ米)在40μ米α-synuclein由黑色和红色虚线分别是。使用了大型非挤压囊泡。C用圆二色性来区分观察到的囊泡清除作用是由α螺旋介导还是由含有α-突触核蛋白的错误折叠β片介导。α-突触核蛋白（20μ米)与未挤压的大囊泡孵育5分钟。在含有POPC-的小泡存在时，光谱基本保持不变（蛋白质与脂质的摩尔比为1:20，红线)与先前的研究结果一致，α-突触核蛋白与此类脂质没有显著的相互作用(27). α-突触核蛋白(蓝色); α-突触核蛋白与POPC囊泡(红色); α-突触核蛋白与POPG囊泡(绿色).D类，将平均剩余椭圆度值的变化绘制为时间的函数。实验中使用了1:20的蛋白质与脂质的摩尔比。197.5纳米(蓝色); 203纳米(红色); 222纳米(绿色). 正如预期的那样，对于从随机线圈到α-螺旋结构的简单两态转变，等驻点（203 nm）的椭圆度没有显示出任何时间变化。相反，在197.5 nm和222 nm处获得的痕迹显示出光谱变化，表明在最初5分钟内快速形成α-螺旋。

使用圆二色性和ThT荧光增强的测量结果表明，α-突触核蛋白的膜清除作用是由其α螺旋而不是错误折叠的β片构象介导的(图1C). 有趣的是，α-突触核蛋白从溶液中的随机线圈转化为膜结合的螺旋结构，其速度与囊泡清除的速度非常匹配(图1D类). 此后，样品的螺旋结构保留了数天(补充图S1A类).

α-突触核蛋白与巨大囊泡的相互作用

为了直接观察α-突触核蛋白与含有POPG的囊泡的相互作用，我们在水环境中对固定化的单层和多层巨型囊泡进行了光学成像实验(62,67,68). 在添加蛋白质之前，小泡呈圆形(图2A类). 添加α-突触核蛋白后（～1:50蛋白质/脂质[P/L]摩尔比）；然而，它们失去了球形的完整性(图2A类). 这一过程在～15分钟内完成。在较低的P/L比率下，只有一小部分巨型囊泡在相同的时间内被破坏，与光散射数据吻合良好(图1B). 在添加蛋白质的特定阈值浓度以上，囊泡很快被破坏，时间尺度快于实验时间分辨率（约1.5秒）。单个巨大囊泡的变形如图所示图2B，显示相应的图像(t吨=0，1.5 s，3 s）囊泡(红色)结合α-突触核蛋白(绿色).

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α-突触核蛋白与POPG囊泡的相互作用。 A类，缓冲液中拴在玻璃表面的巨大囊泡之前通过荧光显微镜成像(左边)以及之后(正确的)与α-突触核蛋白以1:50的蛋白质/脂质摩尔比孵育15分钟。几乎所有囊泡都分散到较小的脂质结构中。比例尺为5μm。B，单个POPG囊泡的破裂发生在非常快速的时间尺度上。单个囊泡(顶部,红色)在3s的时间内成像，以及结合α-突触核蛋白的相应图像(底部,绿色). 囊泡破裂发生的速度快于1.5秒的时间分辨率。比例尺为500 nm。

将α-突触核蛋白添加到POPG/POPC或POPG/POP摩尔比为1:1的囊泡中，与POPG囊泡相比，其侵略性变形较小；虽然一些小泡被完全破坏，但最常见的观察结果是气泡，即小泡形成突起，如视频S1所示。这种气泡伴随着蛋白质荧光/浓度的局部增加，表明这一过程是协同的，需要多种蛋白质协同作用。

α-突触核蛋白管状体由带负电荷磷脂组成的大囊泡

鉴于光学显微镜的分辨率极限，我们使用透射电子显微镜对这一过程进行了更详细的研究(图3和补充图S2，A–C). 在没有α-突触核蛋白的情况下，囊泡呈球形(图3A类). 在与α-突触核蛋白以1:40的P/L摩尔比孵育5分钟后，我们主要观察到较厚的小管，直径为～30–40 nm(图3B). 较小的小管（直径10-15nm）大多以1:20摩尔比检测到(图3C). 小管通常具有宽度调制的外观(图3,B和C). 小管和α-螺旋结构在几天内似乎是稳定的，24小时后小管形态没有变化，这与α-突触核蛋白的稳定二级结构一致(补充图S1B). 在1:10的摩尔比下，我们经常观察到直径大多约为25纳米的小圆形结构。这些结构与高度弯曲的囊泡一致，尽管不能排除较小的非囊泡结构(31,69)可能也形成了(图3D类). 随着α-突触核蛋白含量的增加，膜曲率逐渐增加，这让人想起以前的一项研究，该研究调查了洗涤剂对囊泡结构的形态影响(64). 适量的洗涤剂会导致微管化，但光散射没有显著变化。然而，洗涤剂的增加会导致形成更小的球形结构，这对光散射有显著影响。与本研究相一致，我们发现导致形成较小圆形结构最显著的条件（1:10 P/L摩尔比；图3D类)也会导致最显著的小泡清除。

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电子显微镜显示磷脂小泡依赖α-同核蛋白的微管化和弯曲诱导。 A类无α-突触核蛋白的POPG囊泡的负染电镜照片；B–D类蛋白与脂质（P/L）比为1:40的α-突触核蛋白孵育的POPG囊泡的负染电镜照片(B), 1:20 (C)和1:10(D类).E类，β-突触核蛋白与POPG囊泡的摩尔比为1:20(F类和G公司)我，POPG/POPC（1:1摩尔比）囊泡与α-突触核蛋白以1:20 P/L摩尔比孵育。箭头表示“出芽囊泡”，以及明星表示“出芽囊泡”。H（H），POPG/POPC（1:4摩尔比）囊泡与α-突触核蛋白以1:10 P/L摩尔比孵育。箭头显示一个较小的管子从一个较大的管子中出来。使用了大型非挤压囊泡。黑色比例尺为100nm。

对不易形成纤维的β-突触核蛋白进行的类似实验表明，该蛋白也能够生成管状结构，其形态与观察到的α-突触核心蛋白相似(图3E类). 与α-synuclein的情况一样，β-synuclean数量的增加导致了更弯曲的膜结构的形成(补充图S2，D–F型). 然而，β-synuclein诱导小管形成的效率较低，观察小管形成需要较高的蛋白质浓度(图3E类和补充图S2). 同样，膜重构伴随着α螺旋结构的诱导(补充图S3). 这些结果进一步支持了这一发现，是螺旋结构而不是错误折叠的β-片结构负责膜重塑。

α-突触核蛋白诱导微管形成的能力并不局限于含有POPG的多层膜囊泡；巨大囊泡和大的挤压囊泡也观察到小管化(补充图S4，A–B，但不适用于小的单层囊泡）。此外，负电荷密度较小的囊泡也会引起小管化(补充图S4，D–G型、S4、，I–K型、S3、，F–H（飞行高度）和S5，C-D型). POPG不是哺乳动物的磷脂，因此我们还包括了含有磷脂酰丝氨酸的磷脂的囊泡，这些磷脂与哺乳动物膜的细胞内表面更相似(补充图S4H（H）). α-突触核蛋白对这些囊泡进行小管化的能力表明，不需要POPG，α-突触核蛋白能够用生理相关磷脂成分重塑囊泡。总的来说，小管的形态相似，但似乎电荷较少的小泡的小管化不如POPG小泡的完整。含有POPG/POPC的小泡的一个显著特征是小管末端存在圆形结构，给人以初生小泡“出芽”的印象(图3,F类和G公司和补充图S4G公司). 溶液中可检测到大小相当的小泡状结构，进一步支持了萌芽事件的推断(图3G公司). 在某些情况下，我们还观察到较小的小管从较大的小管中出现，这表明前者来源于后者(图3H（H）). 两性生长素也观察到类似的特征和形态，这是众所周知的诱导膜小管化的物质(图5,E–F).

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载脂蛋白A-1存在下磷脂小泡的膜微管化。 A类负染电镜图像显示apoA-1诱导POPG/POPC（1:4摩尔比）囊泡在1:100 P/L摩尔比下微管化。；B用apoA-1和POPG/POPC（1:4摩尔比）囊泡在1:200 P/L摩尔比下进行渗漏试验。使用大型挤压1μm囊泡；C和D类，POPG/POPC（1:4摩尔比）囊泡，α-突触核蛋白与脂质（P/L）摩尔比为1:10。E类，角蛋白的N-BAR结构域与POPC/PE（猪脑）/鞘磷脂/胆固醇（1:1:1:1.5摩尔比），蛋白质与脂质摩尔比为1:300；F类在蛋白与脂质摩尔比为1:40的情况下，两性激素的N-BAR结构域具有POPG/POPC（1:1摩尔比）。箭头显示一个较小的小管从一个较大的小管中出来。所有EM研究均使用大型非挤压囊泡。比例尺为200 nm。

膜重塑数据和圆二色性表明，但不能直接证明α-突触核蛋白与小管和小泡结构结合。为了解决这一点，我们用金标的α-突触核蛋白。如所示补充图S5，这种金标蛋白确实定位于小管和小泡结构。

膜重塑过程中的囊泡渗漏

为了测试形状和体积的快速变化是否伴随着膜完整性的破坏，我们对α-突触核蛋白和β-突触核蛋白进行了膜渗漏检测。作为阳性对照，我们加入了两性激素。在EM观察到显著微管化的条件下对所有蛋白质进行分析。含POPG的小泡用于合成核蛋白。在两性激素的情况下，含有POPG以及含有POPG/POPE的囊泡也获得了类似的结果。后一种成分的数据显示，因为EM观察到更均匀的小管化。对于所有三种蛋白质，膜重塑/小管化都伴随着快速而明显的小泡渗漏，表明小管化伴随着膜完整性的显著破坏(图4). 尽管α-synuclein和β-synuclean在本试验中大体相似，但β-synnuclein的总泄漏量似乎稍小(图4). 这些数据再次表明，β-突触核蛋白是一种功能稍弱的微管化因子。

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α-突触核蛋白和两性激素存在时，由带负电磷脂组成的囊泡泄漏。 红色，α-突触核蛋白与POPG囊泡（1:20 P/L摩尔比）；破碎的蓝色，β-突触核蛋白与POPG囊泡（1:20 P/L摩尔比）；绿色，含有POPG/POPE（2:1摩尔比）囊泡（1:100 P/L摩尔比）的两性激素；黑色，不含α-突触核蛋白或β-突触核蛋白的对照囊泡；蓝色，不含两physin N-BAR结构域的对照囊泡。使用大型挤压的1μm囊泡。

载脂蛋白A-I管状脂质体含有少量阴离子脂质

为了测试载脂蛋白是否也能促进微管形成，我们将载脂蛋白A I与小泡孵育，并通过阴性染色EM监测结果形状。有趣的是，载脂蛋白A-I能够将含有POPG/POPC（摩尔比为1:4）的小泡微管化(图5A类). 小管直径约为～25 nm(图5A类).

在可比较的条件下，与α-突触核蛋白形成的小管相比，apoA-I形成的小小管具有显著的相似性(图5,C和D类)提供证据表明，突触核蛋白和载脂蛋白的膜相互作用具有一些共同的特性。此外，apoA-1在显示小管化的条件下也会引起膜渗漏(图5B). 因此，在本研究中测试的所有病例中，微管化至少伴随着膜的短暂破裂。

然而，在膜小管形成的最佳脂质组成方面也存在一些差异。虽然α-突触核蛋白从含有POPG的小泡中生成小管，但我们没有观察到这种高电荷小泡的任何apoA-1介导的小管化。相反，在负电荷较少的膜条件下，apoA-1小管似乎更稳定。考虑到细胞外apoA-1主要暴露于中性脂质，而细胞溶质α-突触核蛋白主要暴露于带负电荷的膜，这一趋势反映了这两种蛋白质的细胞定位(70).

讨论

根据其相关的11个氨基酸重复序列，人们长期以来一直怀疑突触核蛋白和载脂蛋白具有类似的脂质结合特性，但这种相似性已被证明难以识别。在这里，我们发现α-突触核蛋白、β-突触核素和apoA-1具有共同的能力，可以诱导膜弯曲，并导致大量不同脂质成分的大囊泡微管化或囊泡化。考虑到已知联核蛋白和载脂蛋白与脂质和/或膜相互作用体内，它们诱导膜弯曲的能力可能具有生理相关性。例如，在α-突触核蛋白的情况下，已经提出了许多囊泡贩运事件的功能作用(13,14)包括氯氰菊酯介导的内吞作用(15). 我们的发现是，α-突触核蛋白可以诱导膜的形状，如“初生芽囊泡”(图3,F类和G公司)，表明该蛋白可能有助于囊泡出芽并诱导膜弯曲体内虽然α-突触核蛋白能够在具有生理相关脂质成分的囊泡中诱导膜弯曲(补充图S4H（H）)，需要未来的工作来解决这些功能影响体内.

然而，α-突触核蛋白和两性生长素的囊泡渗漏实验也表明，诱导膜弯曲可能伴随着膜完整性的显著丧失。因此，细胞机制必须到位，以防止发生这种潜在的毒性膜扰动体内先前的研究假设α-突触核蛋白的膜破裂在PD的病理学中起重要作用(23,–26). 目前的数据表明，不受控制地诱导膜弯曲可能是导致PD膜破裂的机制之一。有趣的是，在过度表达α-突触核蛋白疾病突变体的PD小鼠模型的细胞内沉积物中已经报道了小管样结构(19). 根据目前的结果，这些结构可能是由α-突触核蛋白产生的直接膜曲率效应引起的。虽然未来的工作将必须显示α-突触核蛋白聚集是否促进不受控制的膜弯曲诱导，但最近的研究预测，蛋白质的协同作用/聚集强烈增强了膜弯曲诱导(71,–73). 我们目前的数据很好地符合这一概念。首先，我们的光学成像显示，膜重构（气泡）与α-突触核蛋白浓度的局部增加相一致。其次，我们发现曲率诱导的程度强烈依赖于蛋白质与脂质的比率(图3,B–D类和补充图S2). 在低蛋白脂质比时，可以观察到相对较宽的小管，蛋白质含量的增加导致小管直径的减小，这表明随着更多蛋白质与膜结合，曲率诱导作用变得更强(图3,B和C和​和66A类,表格III和四、). 此外，我们的数据还表明，较小的小管可以逐步起源于较大的小管(图3H（H）)，因为我们经常观察到较小的小管从较大的小管中排出。在使用的最高蛋白质与脂质比例（1:10）下，形成了更高弯曲和更小的圆形结构(图3D类和​和66A类,形式V). 总的来说，这些数据清楚地表明，蛋白质含量的增加导致膜曲率的逐渐增加。因此，限制局部蛋白质浓度可能是实现可控且无破坏性诱导膜弯曲的有效方法。

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α-突触核蛋白依赖性膜重塑和曲率诱导综述。 A类，α-突触核蛋白分子与单个囊泡结合(我). 达到临界浓度后，曲率应变导致膜小管启动(二). 结合在膜上的蛋白质分子的浓度和可能的方向可以决定其大小(三或四、)和管的形状(六)浓度越高，越有利于弯曲结构。螺旋进入二,三、和四、以平行于管轴的方向绘制，该方向将导致最大各向异性曲率应变。然而，不能排除与此方向的轻微偏差。水泡形成或形成较小的脂质结构(五)可能来自较小的膜管(四、)或直接从大水泡(二).B，插入扩展螺旋结构(黄色条纹的红色圆柱体)完整囊泡上的α-突触核蛋白发生在磷酸盐水平(31)并导致高度各向异性的曲率应变。这个绿色箭头指示曲率应变的方向。

角蛋白和α-突触核蛋白的区别在于后者不具有刚性支架结构域（BAR域）。相反，α-突触核蛋白的曲率诱导是由膜相互作用诱导的α-螺旋结构介导的。已确定α-突触核蛋白的许多不同螺旋结构；当α-突触核蛋白与完整的单板层小泡稳定结合时，它会形成一个延伸的螺旋结构(30,–34). 相反，当与非双层或较小的胶束聚集体结合时，α-突触核形成包含两个反平行螺旋的结构(31,69,74,75). α-突触核蛋白所有α-螺旋结构的一个共同特征是，所有螺旋都是两亲性的，其疏水面插入双层或胶束的疏水内部。对于囊泡结合的α-突触核蛋白，延伸的单螺旋结构位于磷酸盐水平(31). 根据理论研究，这种位置会产生最大的楔形效应，将头部组推开(43,76,77)从而促进膜的弯曲(图6B). 此外，在已知结构中，α-突触核蛋白形成相对较长的螺旋（对于单螺旋结构，为～140Å；对于双螺旋结构，则为～50 \8491；和～70 \8491]）。这些螺旋应导致高度各向异性的曲率应变，这可能有助于保持小管数天的稳定性。然而，未来使用冷冻电镜、定点自旋标记和其他研究蛋白质结构的工具进行更高分辨率的结构分析，将有必要解决α-突触核依赖性曲率诱导的确切结构细节。事实上，这些研究很可能揭示，精确的α-突触核蛋白结构可能因不同的小管类型而异。

ApoA-1表现出与突触核蛋白类似的微管化能力，但略有不同的是，它更喜欢带负电较少的脂质组合物。未来的研究必须表明，两亲性片段使囊泡管状化和逐渐棘轮化脂质的能力是否可能是其产生成熟HDL颗粒的能力的基础。

补充材料

补充数据：

致谢

我们感谢Ulrich Baxa博士的有益讨论，感谢Tobias Ulmer博士、Jampani Nageswara Rao博士和Jae-Eun Suk博士提供β-突触核蛋白表达载体（pET-41）。

*这项工作得到了国立卫生研究院GM063915（至R.L.）、R01 AG029246（至J.C.V.）和NIAMS（至A.C.S.）的校内研究计划的全部或部分支持。这项工作也得到了拉里·希尔布洛姆基金会（对R.L.）、丹麦研究理事会、哥本哈根大学和伦德贝克基金会（向D.G.S.）的支持。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg本文的在线版本（可在http://www.jbc.org)包含补充图S1–S5.

2使用的缩写如下：

PD公司
帕金森病
教皇
1-棕榈酰-2-油酰基-锡-甘油-3-磷酸乙醇胺
持久性有机污染物
1-棕榈酰-2-油酰基-锡-甘油-3-磷酸-我-丝氨酸
POPC公司
1-棕榈酰-2-油酰基-锡-甘油-3-磷酸胆碱
POPG公司
1-棕榈酰-2-油酰基-锡-甘油-3-[磷酸-RAC-（1-甘油）]
损益表
蛋白质/脂质比率。

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文章来自生物化学杂志由提供美国生物化学和分子生物学学会