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.2009年2月;10(2):218-34。
doi:10.1111/j.1600-0854.2008053.x。 Epub 2008年10月31日。

α-同核蛋白和多不饱和脂肪酸促进氯氰菊酯介导的内吞作用和突触囊泡再循环

附属公司

α-同核蛋白和多不饱和脂肪酸促进网格蛋白介导的内吞作用和突触囊泡再循环

Tzina Ben Gedalya公司等。 交通. 2009年2月.

摘要

α-同核蛋白(Alpha-synuclein,alphaS)是一种与帕金森病(Parkinson’s disease,PD)有关的丰富的神经元胞质蛋白,但其生理功能尚不清楚。αS具有与A1类载脂蛋白相同的结构基序,因此可以与膜可逆结合,帮助调节膜脂肪酸组成。我们之前观察到,多巴胺能培养细胞或大脑中αS表达水平的变化与多不饱和脂肪酸(PUFA)水平的变化和膜流动性的改变有关。我们现在报告,αS与PUFA作用,以增强膜结合染料FM 1-43的内化。具体而言,在神经元和非神经元培养的细胞中,αS的表达与某些PUFA的生理水平的暴露相结合,增强了网格蛋白介导的内吞作用。此外,alphaS表达和PUFA增强了野生型(wt)和基因缺失的alphaS小鼠大脑原代海马培养物中基础和诱发突触囊泡(SV)的内吞作用。我们认为,alphaS和PUFAs通常在内吞机制中发挥作用,并在神经元刺激后参与SV再循环。

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数字

图1
图1。αS存在于体内可溶性低聚物中,并促进14C-OA的掺入
(a) 将来自wt(16个月)、αS+/+(9个月)和αS−/−(15个月)小鼠的10万g后的脑细胞溶胶(15μg)样品与Lipidex-1000在4°C下孵育16小时,然后进行天然凝胶电泳(10%三甘氨酸)和syn-1抗体的western blotting。(b) 来自未经处理或αS-过度表达的MES细胞的100000g后细胞溶胶样品(15μg)14C OA(35μM)16小时,并进行天然凝胶电泳(放射自显影)。
图2
图2。αS过度表达和18:3 PUFA诱导FM1-43内化到MES 23.5多巴胺能细胞
(a) ●●●●。Naive、wt和A53TαS过度表达MES细胞,在标准含血清培养基中条件处理,并用2.5μM FM1-43荧光染料(分子探针Eugene,OR)标记4分钟。去除染料通道,10分钟后固定细胞并测试细胞内FM1-43荧光。在非饱和条件下,在共焦激光扫描显微镜(Zeiss LSM 410)上拍摄照片。(b) 。将过表达MES细胞的Naive、wt和A53TαS在补充有50μM BSA的无血清培养基中培养16–18小时,然后用FM1-43标记,如(a)所示。(c) ●●●●。细胞如(b)所示,但在仅补充了BSA(50μM)和250μM 18:3 PUFA的无血清培养基中调节。(d) ●●●●。BSA和PUFA处理培养物中细胞内FM1-43的定量表达。使用ImageJ软件在选定的图像平面上对细胞内FM1-43信号最大的捕获图像进行定量,测量整个细胞的平均荧光强度(高于阈值)除以被测细胞的面积。10–15个细胞的平均值±SD。*在幼稚细胞的相应处理中显著,在wtαS过度表达细胞的相应治疗中显著。TTEST P值<0.05(e)按(b)和(c)处理细胞,但分别用20μM BSA和100μM 18:3处理。(f) 经低聚物检测处理(49)并用抗αS H3C ab.Bar探针探测的原始、wt和A53T过表达细胞胞浆提取物的Western blot为10μm。
图2
图2。αS过度表达和18:3 PUFA诱导FM1-43内化到MES 23.5多巴胺能细胞
(a) ●●●●。Naive、wt和A53TαS过度表达MES细胞,在标准含血清培养基中条件处理,并用2.5μM FM1-43荧光染料(分子探针Eugene,OR)标记4分钟。去除染料通道,10分钟后固定细胞并测试细胞内FM1-43荧光。在非饱和条件下,在共焦激光扫描显微镜(Zeiss LSM 410)上拍摄照片。(b) 。将过表达MES细胞的Naive、wt和A53TαS在补充有50μM BSA的无血清培养基中培养16–18小时,然后用FM1-43标记,如(a)所示。(c) ●●●●。细胞如(b)中所述,但在仅补充BSA(50μM)加250μM 18:3 PUFA的无血清培养基中进行条件培养。(d) ●●●●。BSA和PUFA处理培养物中细胞内FM1-43的定量表达。使用ImageJ软件在选定的图像平面上对细胞内FM1-43信号最大的捕获图像进行定量,测量整个细胞的平均荧光强度(高于阈值)除以被测细胞的面积。10–15个细胞的平均值±SD。*在幼稚细胞的相应处理中显著,在wtαS过度表达细胞的相应治疗中显著。TTEST P值<0.05(e)细胞按(b)和(c)处理,但分别用20μM BSA和100μM 18:3处理。(f) 经低聚物检测处理(49)并用抗αS H3C ab.Bar探针探测的原始、wt和A53T过表达细胞胞浆提取物的Western blot为10μm。
图3
图3。FM1-43内吞作用作为脂肪酸长度和饱和度的函数
αS过表达MES多巴胺能细胞生长在12孔盖玻片上,并在仅补充了BSA(50μM)或姐妹培养物中250μM所示FA的无血清培养基中调节16小时。然后用FM1-43标记细胞,如图2a所示并固定。展示了具有代表性的图片。蔡司LSM 410采集图像。采集参数始终保持不变。Bar表示10μm。
图4
图4。αS和PUFA作用于诱导Tf内吞
(a) Naive和wtαS过度表达的MN9D细胞生长在12孔玻璃盖上,并在含有250μM 18:3 PUFA的DMEM或含有BSA(50μM)的DMEM.中调节18小时。然后将Alexa-488人Tf(分子探针,Eugene,Or)(50μg/ml)在低温条件下添加到普通DMEM培养基(不含血清、抗生素或营养素)中的细胞中,以使Tf与TfR结合。去除未结合的Tf后,将细胞在37°的无血清培养基中培养10分钟,相应地补充BSA或PUFA。然后用Olympus FluoView FV300共聚焦显微镜对细胞进行固定和观察。(b) Alexa-488 Tf内吞定量。细胞和处理(如(a)加上幼稚和αS过度表达MN9D,条件是在标准的补充血清培养基中。在相同的设置下拍摄所有图像,并选择包含最大细胞内信号的图像平面。阈值设置为仅测量内吞小泡,而不包括更弥漫的背景。所有测量值均为“选定感兴趣区域”,并归一化为细胞面积。每个处理的n=10个细胞的平均值±SD.*,ttest p<0.01。(c) Alexa-488-Tf在幼稚细胞和αS过度表达细胞中的内吞作用是PUFA剂量依赖性的。αS过表达SK-N-SH细胞如(a)中所示生长,用指示的18:3浓度进行调节,并按(b)中所述进行量化。图中显示了内吞囊泡(高于阈值)中18:3浓度的信号总和。n=10个细胞计数为αS过度表达细胞(虚线)和原始细胞(填充线)的±SD。Bar表示10μm。
图5
图5。αS和PUFA影响TfR水平和细胞分布
(a) 在12孔盖玻片上生长过表达MN9D神经元细胞的幼稚和人类wtαS,在250μM 18:3 PUFA或仅在BSA(50μM)中调节18小时。如图4a所示添加Tf(50μM),并使用抗TfR ab(美国佐米德实验室CA)处理细胞用于icc。(b) αS和PUFA增加细胞表面TfR水平。细胞表面TfR的生物素化,使用抗TfR ab归一化为总TfR(美国佐米德实验室CA)和肌动蛋白(以色列西格玛康复公司),及其密度分析。(c) αS和PUFA诱导TfR表达水平。从在BSA+/−18:3(BSA和18:3分别为50和250μM)中处理的幼稚和αS过表达MN9D细胞中提取的总RNA的定量实时PCR反应。TfR mRNA水平归一化为18S mRNA。三个实验的平均值±SE.Bar代表10μm。
图5
图5。αS和PUFA影响TfR水平和细胞分布
(a) 在12孔盖玻片上生长过表达MN9D神经元细胞的幼稚和人类wtαS,在250μM 18:3 PUFA或仅在BSA(50μM)中调节18小时。如图4a所示添加Tf(50μM),并使用抗TfR ab(美国佐米德实验室CA)处理细胞用于icc。(b) αS和PUFA增加细胞表面TfR水平。细胞表面TfR的生物素化,使用抗TfR ab归一化为总TfR(美国佐米德实验室CA)和肌动蛋白(以色列西格玛康复公司),及其密度分析。(c) αS和PUFA诱导TfR表达水平。BSA+/-18:3(BSA和18:3分别在50和250μM下)处理过的过表达MN9D细胞中提取的总RNA的定量实时PCR反应。TfR mRNA水平归一化为18S mRNA。三个实验的平均值±SE.Bar代表10μm。
图6
图6。αS和PUFA激活膜转运速率
在补充有BSA+/-18:3 PUFA(BSA和PUFA分别为50和250μM)的无血清培养基中,将过表达Naive和wtαS的MN9D细胞培养16–18小时。用Alexa 488 Tf加载TfR。通过FACS分析测量Tf的回收(见方法)。图表显示了三个实验的平均值和SD。(a) 内化,结果以每次测试中最大内化转铁蛋白的样本百分比表示。(b) 回收,结果以每种处理的细胞相关荧光损失(百分比)表示。
图7
图7。αS和PUFA诱导的Tf内吞依赖于氯菊酯
在添加了BSA+/-18:3 PUFA(BSA和PUFA分别为50和250μM)的无血清培养基中,将过表达Naive和wtαS的MES细胞培养16–18小时。全细胞提取液经western blot分析,并用克氏菌素(重链)抗体进行检测。结果被归一化为肌动蛋白,并以任意单位表示。(b) Naive和wtαS过度表达的MN9D细胞生长在12孔盖玻璃上,并转染模拟(空Plko.1质粒)或用于氯菊酯重链的shRNA。DNA转染后32小时,将细胞转移到无血清条件培养基中,补充BSA+18:3 PUFA(BSA和FA分别为50和250μM)16小时。DNA转染后48小时,向细胞中添加50μg/ml Alexa-488人Tf(如图4a所示)。固定细胞并进行处理,以检测Alexa 488-Tf和icc与抗甲氰菊酯抗体(见方法)。(c) Alexa-488 Tf内吞作用和网格蛋白水平的定量。如(b)所述的细胞和处理,在相同的设置下拍摄图像,并选择包含最大细胞内信号的图像平面。阈值设置为仅测量内吞小泡,而不包括更弥漫的背景。所有测量值均为“选定感兴趣区域”,并归一化为细胞面积。n=10个处理细胞的平均值±SD。方差分析p<0.001。(d) 如(b)所述,转染plko.1或网格蛋白shRNA并用PUFA处理的αS过度表达MES细胞中的网格蛋白(重链)蛋白水平。western blot的脱氮分析使用抗甲胎蛋白抗体进行探测,并在同一个blot上归一化为微管蛋白信号。(e) 定量转染有网格蛋白siRNA的MES细胞中Alexa-488 Tf内吞作用和网格蛋白水平(b)。图像如(c)所示。Bar表示10μm。
图7
图7。αS和PUFA诱导的Tf内吞依赖于氯菊酯
在添加了BSA+/-18:3 PUFA(BSA和PUFA分别为50和250μM)的无血清培养基中,将过表达Naive和wtαS的MES细胞培养16–18小时。全细胞提取液经western blot分析,并用克氏菌素(重链)抗体进行检测。结果被归一化为肌动蛋白,并以任意单位表示。(b) Naive和wtαS过度表达的MN9D细胞生长在12孔盖玻璃上,并转染模拟(空Plko.1质粒)或用于氯菊酯重链的shRNA。DNA转染后32小时,将细胞转移到无血清条件培养基中,补充BSA+18:3 PUFA(BSA和FA分别为50和250μM)16小时。DNA转染后48小时,向细胞中添加50μg/ml Alexa-488人Tf(如图4a所示)。固定细胞并进行处理,以检测Alexa 488-Tf和icc与抗甲氰菊酯抗体(见方法)。(c) Alexa-488 Tf内吞作用和网格蛋白水平的定量。如(b)所述的细胞和处理,在相同的设置下拍摄图像,并选择包含最大细胞内信号的图像平面。阈值设置为仅测量内吞小泡,而不包括更弥漫的背景。所有测量值均为“选定感兴趣区域”,并归一化为细胞面积。每个治疗组的平均数n=10个细胞±SD。方差分析p<0.001。(d) 如(b)所述,转染plko.1或网格蛋白shRNA并用PUFA处理的αS过度表达MES细胞中的网格蛋白(重链)蛋白水平。western blot的脱氮分析使用抗甲胎蛋白抗体进行探测,并在同一个blot上归一化为微管蛋白信号。(e) 定量转染有网格蛋白siRNA的MES细胞中Alexa-488 Tf内吞作用和网格蛋白水平(b)。图像如(c)所示。条形表示10μm。
图7
图7。αS和PUFA诱导的Tf内吞依赖于氯菊酯
在添加了BSA+/-18:3 PUFA(BSA和PUFA分别为50和250μM)的无血清培养基中,将过表达Naive和wtαS的MES细胞培养16–18小时。全细胞提取液经western blot分析,并用克氏菌素(重链)抗体进行检测。结果被归一化为肌动蛋白,并以任意单位表示。(b) Naive和wtαS过度表达的MN9D细胞生长在12孔盖玻璃上,并转染模拟(空Plko.1质粒)或用于氯菊酯重链的shRNA。DNA转染后32小时,将细胞转移到补充有BSA+18:3 PUFA(BSA和FA分别为50和250μM)的无血清条件培养基中16小时。DNA转染后48小时,向细胞中加入50μg/ml Alexa-488人Tf(如图4a所示)。固定细胞并进行处理,以检测Alexa 488-Tf和icc与抗甲氰菊酯抗体(见方法)。(c) Alexa-488 Tf内吞作用和网格蛋白水平的定量。如(b)所述的细胞和处理,在相同的设置下拍摄图像,并选择包含最大细胞内信号的图像平面。阈值设置为仅测量内吞小泡,而不包括更弥漫的背景。所有测量值均为“选定感兴趣区域”,并归一化为细胞面积。每个治疗组的平均数n=10个细胞±SD。方差分析p<0.001。(d) 如(b)所述,转染plko.1或网格蛋白shRNA并用PUFA处理的αS过度表达MES细胞中的网格蛋白(重链)蛋白水平。western blot的脱氮分析使用抗甲胎蛋白抗体进行探测,并在同一个blot上归一化为微管蛋白信号。(e) 定量转染有网格蛋白siRNA的MES细胞中Alexa-488 Tf内吞作用和网格蛋白水平(b)。图像如(c)所示。Bar表示10μm。
图8
图8。αS−/-初级海马神经元中FM1-43内化到突触小泡和突触池减少
正常和αS−/−小鼠大脑的海马原代培养物(18天)在补充有BSA+/−50μM 18:3的无血清培养基中培养16小时。(a) αS表达和PUFA治疗激活SV内吞。在90 mM K中暴露于10μM FM1-43后的荧光图像+溶解60s,然后冲洗。白色箭头表示插图的区域。条形表示50μM。(b) 用抗突触素ab(DAKO)在(a)的载玻片上进行icc。(c) 用70 mM K第二次刺激后,按(a)处理的培养物的荧光图像+(FM1-43下载)。(d) αS表达和PUFA处理诱导FM1-43内在化为神经元细胞体。Bar表示25μM。荧光图像如(a和b)所示,但无化学刺激。

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引用人

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