基孔肯雅病毒非结构蛋白2抑制I/II型干扰素刺激的JAK-STAT信号^{▿ †}

α病毒复制子和表达质粒的构建。

通过从CHIKV感染性克隆5′-pCHIKic中删除结构基因，构建了表达EGFP的CHIKV菌株37997复制子（CHIKrep-EGFP）（见图4A）(40)并插入增强型绿色荧光蛋白（EGFP）。接下来，使用引物AscI-Luc-F和BssHII-Luc-R通过PCR（Phusion DNA聚合酶；Finnzymes）从pGL3（Promega）中生成萤火虫荧光素酶（Fluc）基因，并将其克隆到EGFP基因框架和上游的CHIKrep-EGFP中，以生成CHIKrep-FlucEGFP（见图。​图1C）。1摄氏度). 红色荧光标记基因mCherry(33)使用引物AscI-mCherry-F和EcoRI-mCherry-R通过PCR扩增，并将其克隆到CHIKrep-EGFP中代替EGFP以产生CHIKrep-mCherry（见图5A）。用聚合酶链反应（PCR）从repPAC-βGal中产生了与口蹄疫病毒（FMDV）2A自动蛋白酶融合的嘌呤霉素乙酰转移酶基因(21)使用引物MluI-PAC2A-F和-R，将其克隆到CHIKrep-EGFP中，以代替EGFP生成CHIKrep-pac2AEGFP（见图6A）。将CHIKrep-pac2AEGFP的MluI片段亚克隆到pBluescript中，并在使用引物CHIK-nsP2-P718S-F和-R通过QuikChange PCR突变nsP2后重新插入，生成CHIKrep-pac2AEGFP-nsP2m。非细胞病变复制子SINrepGFP（pHY213；pToto1101衍生物）通过使用引物SINnsP2-726P-V426和SINsP2-726P-V427将726位的nsP2丝氨酸突变为脯氨酸，从中生成细胞病变的“野生型”Sindbis病毒复制子，以生成SINrepGFP-wt（见图6A）。使用列出的AttB1和AttB2引物从CHIKrep-EGFP中PCR扩增出单个CHIKV nsP（表​（表1）1)并使用pDONR207和pcDNA-DEST40（Invitrogen）通过传统克隆或Gateway技术克隆到巨细胞病毒（CMV）即时早期启动子下游的表达质粒中（见图6A）。使用带有引物EcoRI-mCherry-F和EcoRI-2A-mCherry-R的PCR将mCherry基因融合到FMDV 2A自动保护酶中，并将其克隆为CHIKV nsP框架和上游的EcoRI片段，用于转染细胞的实时可视化（见图5A）。来自nsP的红色荧光mCherry2A蛋白的自切割导致CHIKV nsP1到nsP4的表达，其N端几乎是真实的，以保持生物活性。所有结构均通过测序进行验证（Eurofins MWG Operon，德国）。

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图1。

CHIKV对I/II型干扰素治疗的耐受性。（A和B）CHIKV感染对干扰素治疗的敏感性。在感染前6小时（A）或感染后4小时（B）将IFN按指示添加到CHIKV感染的Vero细胞中。每天24小时收集上清液，并通过菌斑试验测定病毒滴度。误差条表示重复项的标准偏差。（C） 表达Fluc-EGFP融合蛋白的CHIKrep-FlucEGFP复制子的示意图。（D和E）CHIKV复制子RNA复制对干扰素治疗的敏感性。将不同浓度的干扰素添加到直接转染后（0小时/分钟）（D）或24小时/分钟（E）的96个平板中的CHIKV复制转染Vero细胞中，并在48小时/分钟测量Fluc活性。干扰素-α浓度以国际单位（IU）/ml表示，干扰素β/γ浓度以ng/ml表示。误差线表示标准偏差。

干扰素敏感性分析。（i） CHIKV公司。

对于干扰素预处理，用不同剂量的IFN-α（I-4276；Sigma）、IFN-β（I-4151；Sigma-）和IFN-γ（I-1520；Sigma/）处理生长在24孔板中的Vero细胞6小时。以每细胞1个PFU的感染倍数（MOI）冲洗细胞并用CHIKV感染。病毒吸收三小时后，清洗细胞；然后将其再培养21小时。对于干扰素后处理，Vero细胞以1 PFU/细胞的MOI感染CHIKV。病毒吸收后4小时，用不同剂量的干扰素处理细胞（图。​（图1）1)并再放置21小时。收集上清液，并通过Vero细胞上的斑块分析测定病毒滴度。

（ii）CHIKV复制子。

体外-根据制造商的建议，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）和Opti-MEM培养基（Invit罗gen）将转录的、带帽的CHIKrep-FlucEGFP复制子RNA（400 ng/well）转染到96 well平板中的Vero细胞中。培养4 h后去除转染混合物，并用DMEM加10%FBS替换。转染后（转染后0 h[p.t.]）或24 h p.t.，I型干扰素（IFN-α和IFN-β；英国诺丁汉Calbiochem）和II型干扰物（IFN-γ；德国杜塞尔多夫AbD Serotec）以越来越高的浓度添加到井中。转染后两天，在100μl被动裂解缓冲液（荷兰莱顿Promega Benelux）中裂解细胞，并在Fluostar Optima微孔板阅读器（德国BMG Labtech）上使用d日-荧光素（Synchem OHG，德国）作为底物，基本上如前所述(14).

干扰素报告分析。

将生长在24孔板中的Vero细胞与表达40 ng pRL-TK（Promega）质粒DNA的质粒共转染雷尼利亚荧光素酶（Rluc）和200 ng IFN-α/β-响应型（ISRE）萤火虫荧光素酶（Fluc(15)使用Genejammer（Stratagene）转染试剂。简单地说，在24小时p.t.时，细胞以5 PFU/细胞的MOI感染CHIKV。在感染后4、8和12小时（p.i.），用每毫升1000 IU的IFN-α（内含子A重新开放）或每毫升100 ng的IFN-γ（BD Pharmingen）处理细胞6小时，然后使用双荧光素酶报告检测系统（Promega）检测Fluc和Rluc活性，如前所述(22).

实时RT-PCR。

在24孔板中生长的Vero细胞以5 PFU/细胞的MOI感染CHIKV。随后，用每毫升1000 IU的IFN-α（内含子A重新开放）或每毫升100 ng的IFN-γ（BD Pharmingen）在每分钟4、8或12小时培养健康或受感染的细胞10小时。使用Trizol试剂（Invitrogen）纯化总RNA，并实时逆转录-PCR（real-time RT-PCR）在Rotor-Gene 3000 PCR机器（Corbett Research）上使用上标III（Invitrogen）和SYBR绿色（Invit罗gen）进行，基本如前所述(12). OAS2转录物扩增引物为HuOAS2-F和-R，看家基因RPL13A引物为(24)分别为HuRPL13A-F和-R。每个样本分析两次，并归一化为RPL13A mRNA水平。OAS2 mRNA转录水平的表达与模拟感染的IFN处理样品的水平相关。

免疫荧光和蛋白质印迹。（i） CHIKV病毒。

在24孔板的玻璃盖玻片上生长的Vero细胞以1 PFU/细胞的MOI感染CHIKV。感染后24小时，在37°C下用1000 IU/ml IFN-α（I-4276；Sigma）或50 ng/ml IFN-γ（I-1520；Sigmo）处理细胞30分钟。细胞在室温下固定在4%甲醛磷酸盐缓冲液（PBS）中10分钟，在−20°C下用冰镇丙酮-甲醇（1:1）渗透30分钟，然后依次用CHIKV包膜蛋白特异性交叉反应单克隆抗体和STAT1（SC-345；SantaCruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）或STAT2（SC-476；圣克鲁斯），浓度基本上如制造商所述为1μg/ml。从Invitrogen获得第二抗体（GaM-AF546和GaR-AF488），并用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行染色。使用蔡司LSM 510 Meta共焦显微镜进行显微镜检查。为了进行Western blot分析，6孔板中的Vero细胞以1 PFU/细胞的MOI感染CHIKV。每周24小时，用IFN-α（i-4276；Sigma）或IFN-γ（i-1520；Sigma30分钟）处理细胞，或如图所示不处理细胞（见图3）。如前所述，对Vero细胞裂解物进行蛋白质印迹(22)使用磷酸化STAT1（pSTAT1）抗体（加利福尼亚州圣地亚哥Pharmingen）、STAT1抗体（SC-345；Santa Cruz）和微管蛋白抗体（T2200；Sigma），并使用Odyssey红外成像系统（美国东北部林肯市LI-COR Biosciences）进行分析。

CHIKV感染抑制I/II型干扰素信号传导。

由于CHIKV复制对I型IFN启动细胞部分敏感（II型IFN的启动程度较低），但在病毒RNA复制顺利进行后，CHIKV对IFN治疗有很大抵抗力，因此CHIKV可能通过抗病毒活性阻断下游IFN信号传导和IFN刺激基因（ISG）的表达。为了验证这一假设，研究了CHIKV RNA复制对IFN诱导的下游基因转录的影响。用I型IFN-应答（ISRE）或II型IFN-响应（GAS）Fluc报告质粒转染Vero细胞，随后用CHIKV感染。在4、8和12 hpi时用I/II型IFN刺激诱导Fluc表达，并将其归一化为雷尼利亚在共转染的pRL-TK质粒上，组成型启动子表达的荧光素酶（Rluc）活性（图。​（图22A和B）。与模拟感染细胞（未显示）相比，在4、8和12 hpi时，Rluc活性分别下降了约1.5倍、2.5倍和4倍，表明CHIKV感染在这个时间范围内导致一些宿主关闭。然而，CHIKV对IFN刺激的基因转录的抑制更为明显。应答元件ISRE或GAS的相对Fluc表达（归一化为Rluc表达）对IFN-α治疗的反应（图。​（图2A）2安培)或IFN-γ（图。​（图2B），2B型)分别在感染CHIKV的Vero细胞中被显著抑制。这种抑制在4 hpi（2倍）和8 hpi（5到8倍）时明显，在12 hpi时基本上是100%（图。2A和B). 在没有CHIKV感染的情况下，IFN-α治疗对Fluc正常表达的诱导作用为7倍或58倍（图。​（图2A）2安培)或IFN-γ（图。​（图2B），2B型)分别观察到。这些结果清楚地表明，CHIKV感染可以有效地阻断干扰素信号，而不仅仅是通过阻断宿主介导的抑制。

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图2。

CHIKV感染对I/II型干扰素信号和ISG诱导的抑制。用表达Rluc的pRL-TK质粒和I型IFN-应答（ISRE）或II型IFN-响应（GAS）Fluc报告质粒转染（A和B）Vero细胞。在24小时p.t.时，细胞以5 PFU/ml的MOI感染CHIKV。在4、8和12小时p.i.时，用1000 IU/ml（A）的IFN-α或100 ng/ml（B）的IFN-γ处理细胞6小时；然后对其进行Fluc和Rluc活性分析。还测量了有/无干扰素诱导的模拟感染（未感染）细胞的活性。Fluc值除以Rluc读数，以补偿病毒诱导的转录/翻译下调，并相对于模拟感染、IFN处理的样品的值表达。显示了三份样品的平均值。误差线表示标准偏差。（C和D）健康或感染CHIKV的Vero细胞培养4、8或12小时，用每毫升1000 IU的IFN-α（C）或100 ng的IFN-γ（D）培养10小时。IFN-刺激基因OAS2的实时RT-PCR值标准化为看家基因RPL13A的实时RT-PCR值。OAS2 mRNA转录水平的表达与模拟感染、IFN处理的样本相关。显示了重复样本的平均值。误差线表示标准偏差。

为了说明CHIKV感染也抑制ISG表达的诱导，采用RT-PCR检测2′-5′-寡腺苷酸合成酶2（OAS2）转录物的表达。如预期(31)IFN-α或IFN-γ治疗后，Vero细胞中OAS mRNA水平显著增加（图。2C和D，前两个栏）。然而，在用CHIKV感染并在不同时间点用I型和II型IFN处理的细胞中，OAS mRNA水平相对于持家基因RPL13A的水平显著降低（图。2C和D). 这些结果表明，CHIKV感染可以有效地阻断ISG的表达，而不仅仅是通过宿主关闭介导。

CHIKV感染和CHIKV复制子RNA复制阻断I/II型IFN诱导的STAT1核易位。

为了研究CHIKV是否可以通过特异性干扰JAK-STAT通路来阻断IFN信号，Vero细胞在1个PFU/细胞的MOI处感染CHIKV，然后用I型IFN诱导。用I型干扰素诱导应导致STAT1/STAT2磷酸化/异二聚体化和随后的核移位。正如预期的那样，正常Vero细胞中的STAT1定位在细胞质中，但在I型干扰素诱导下转移到细胞核（图。​（图3A）。第3页). 相反，当细胞在干扰素诱导前12小时感染CHIKV时，STAT1核转位被完全阻断（图。​（图3A）。第3页). STAT2也获得了相同的结果（图。​（图3B）。3B公司). 同样，II型干扰素刺激应导致正常Vero细胞中STAT1磷酸化/同二聚体化和核移位，这确实在未感染细胞中观察到（图。​（图3C）。3C公司). 再次，CHIKV感染有效地阻断了STAT1核移位（图。​（图3C）。3C公司). 总之，这些结果表明CHIKV感染阻断了I型和II型干扰素诱导的JAK-STAT信号。

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图3。

（A到C）CHIKV感染阻断STAT1/STAT2核转位，而不消耗内源性STAT1水平。Vero细胞被CHIKV感染，并用IFN-α（A和B）或IFN-γ（C）处理30分钟。细胞被固定，并用CHIKV包膜蛋白和STAT1（A和C）或STAT2（B）特异性单克隆抗体染色。（C） 干扰素-γ治疗对CHIKV感染中STAT1核转位的阻断作用。箭头表示细胞被CHIKV负性感染，但被核STAT1/2感染。（D） CHIKV感染阻断Vero细胞对干扰素治疗的STAT1磷酸化。pSTAT1、STAT1和微管蛋白通过Western blotting在CHIKV感染或模拟感染的Vero细胞中检测，这些细胞要么未经治疗，要么用I型或II型干扰素诱导。通道1，蛋白质大小标记（单位：千道尔顿）。

众所周知，α病毒复制会导致宿主蛋白质合成停止(16). 然而，根据免疫荧光检测，感染和未感染细胞中内源性STAT1和STAT2的水平相似（图。3A至C)，CHIKV感染不太可能耗尽/降解STAT1/2蛋白。为了证实在感染CHIKV的细胞中缺乏核磷酸化-STAT1不是STAT1蛋白缺失的结果，进行了蛋白质印迹以检测内源性STAT1。很明显，细胞感染了CHIKV（图。​（图3D，三维，通道2）中内源性STAT1的水平与未感染细胞中的STAT1水平相似（图。​（图3D，三维，通道5），表明CHIVV不会降解内源性STAT1，但可能通过抑制STAT1磷酸化和/或核转位发挥作用。正如预期的那样，干扰素诱导未感染细胞中STAT1高度上调，可能是通过JAK-STAT通路进行信号传导(22). 相反，CHIKV感染细胞的情况并非如此，这表明CHIKV也能阻止IFN诱导的STAT1上调。重要的是，用抗磷酸-STAT1抗体进行的Western blot分析表明，CHIKV感染会导致诱导细胞中磷酸-STAT1的数量大幅减少（图。​（图3D，三维与干扰素诱导的未感染细胞（图。​（图3D，三维，第6和第7车道）。这些数据支持免疫荧光实验的观察结果，并表明CHIKV感染抑制STAT磷酸化。

一些所谓的新世界α病毒需要表达衣壳基因来调节干扰素反应(1). CHIKV是一种旧世界的α病毒，因此不需要表达衣壳蛋白来抑制IFN信号。为了确定CHIKV nsP的RNA复制和表达是否足以阻断JAK-STAT通路，构建了一个CHIKV复制子，其中结构基因被EGFP删除并替换（CHIKrep-EGFP[图。​[图4A]）。4A级]).体外-将转录的CHIKrep-EGFP RNA转染到Vero细胞中，然后用I型和II型IFN刺激细胞24小时。如预期的那样，在未转染的细胞中，用IFN-α诱导30分钟后，在Vero细胞的细胞核中发现磷酸化-STAT1，并且用IFN-β或IFN-γ更有效地发生这一过程（图。​（图4B）。4B类). 然而，相比之下，转染CHIKrep-EGFP（绿色；表达EGFP）并用IFN-β或IFN-γ诱导的细胞缺乏核STAT1（图。​（图4C，4摄氏度，箭头），表明CHIKV复制阻断了I型和II型IFN诱导的STAT1磷酸化和/或核移位。

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图4。

CHIKV复制子可有效抑制I/II型干扰素诱导的JAK-STAT信号传导，与宿主关闭无关。（A） CHIKrepEGFP的示意图，表达EGFP。（B） I型和II型干扰素诱导Vero细胞中pSTAT1核移位。（C） CHIKV复制子在I/II型干扰素诱导时阻断pSTAT1核易位。用抗pSTAT1抗体对Vero细胞进行免疫染色，24 h p.t.（D）CHIKV RNA复制，但不阻断翻译，阻断STAT1核移位。在没有或存在环己酰亚胺（Chx）的情况下，用CHIKrep-EGFP复制子RNA转染Vero细胞。在12小时p.t.用干扰素-β诱导细胞30分钟，并用抗STAT1抗体染色。开放箭头表示CHIKV复制阳性细胞缺乏核STAT1。

尽管图。​图3D三维表明CHIKV感染不会降低内源性STAT1水平。然而，为了排除这种可能性，细胞被放线菌酮处理以抑制翻译。这种药物诱导的宿主细胞蛋白质合成阻断方法最近被用于委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）的实验，以表明JAK-STAT信号传导被VEEV阻断，而不是被宿主阻断(35). 正如预期的那样，未经环己酰亚胺处理的对照细胞中的STAT1荧光是细胞质的，未转染细胞和绿色CHIKV复制转染细胞之间的定位或荧光强度没有明显差异（图。​（图4D，4D（四维），顶行）。在干扰素-β治疗后，STAT1转位到所有细胞的细胞核中，除了那些表达CHIKV复制子的细胞（图。​（图4D，4D（四维），打开箭头）。在用环己酰亚胺处理的细胞中，由于有效抑制蛋白质合成，CHIKV复制子编码的EGFP不存在（图。​（图4D，4D（四维），底部）。然而，尽管环己酰亚胺有效抑制了翻译，但在IFN-β诱导下STAT1核移位仍然明显（图。​（图4D，4D（四维），底部）。综上所述，这些实验清楚地表明，CHIKV感染和CHIKV复制子RNA的复制可以有效地抑制IFN刺激的JAK-STAT信号，而不依赖于宿主的关闭。

CHIKV nsP2抑制IFN诱导的STAT1核移位。

由于CHIKV复制子可以有效抑制JAK-STAT信号传导，下一个问题是是否有CHIKV nsP被发现与该活动有关。以前的报告表明，α病毒nsP2可能是干扰素应答的重要调节剂(三,11); 然而，单个α病毒nsP2对JAK-STAT通路的直接抑制尚未见报道。

为了鉴定负责阻断STAT1核转位的CHIKV编码蛋白，用表达与自切割mCherry2A融合的单个非结构蛋白的质粒转染Vero细胞；作为对照，用表达mCherry的CHIKV复制子（CHIKrep-mCherry）转染细胞（图。​（图5A）。5A级). 下午2天，用干扰素-β孵育细胞，并使用抗pSTAT1抗体观察磷酸化-STAT1的核定位（注意，这些图像中的pSTAT1显示为绿色）。转染Vero细胞的IFN-β诱导表明，STAT1在表达nsP1、nsP3或nsP4的细胞中有效地转位到细胞核（图。​（图5B，5亿，实心箭头）。只有极少数细胞缺乏核磷酸-STAT1（图。​（图5B，5亿，开放箭头），表明nsP1、-3和-4不能有效阻止STAT1核移位。然而，与之形成鲜明对比的是，在绝大多数表达nsP2的细胞中，STAT1核转位缺失（图。​（图5B，5亿，nsP2，开放箭头）和阳性对照CHIKrep-mCherry（图。​（图5C，5摄氏度，打开箭头）。在少数显示核pSTAT1的nsP2表达细胞中，荧光强度远低于未转染细胞（图。​（图5B，5亿，nsP2，实心箭头）。正如预期的那样，在干扰素-β治疗后，CHIKrep-mCherry转染的细胞也没有出现核移位（图。​（图5C，5摄氏度，打开箭头）。

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图5：。

单个CHIKV nsP抑制IFN-β诱导的STAT1核移位。（A） pCMV-nsP1、-2、-3和-4表达质粒和表达mCherry的CHIKrep-mCherry复制子的示意图。巨细胞病毒直接早期启动子；口蹄疫病毒2A自动蛋白酶。显示噬菌体SP6和CHIKV 26S启动子。（B） 转染pCMV-nsP1、-2、-3或-4的Vero细胞中IFN-β诱导的pSTAT1核移位。用抗pSTAT1抗体对细胞进行免疫染色。（C） CHIKrep-mCherry转染Vero细胞中IFN-β诱导的pSTAT1核移位。开放箭头表示nsP1、-2、-3或-4阳性的细胞，或缺乏核pSTAT1的CHIKV复制子阳性的细胞；实心箭头表示带有核pSTAT1的nsP1-至nsP4-阳性细胞。

这些结果清楚地表明，单独表达的CHIKV nsP2能够抑制JAK-STAT信号传导。

我们感谢VIDRL（澳大利亚）提供基孔肯亚病毒分离物。我们感谢Klaske Schippers和Dirk Martens（瓦格宁根大学工艺工程系）使用荧光显微镜。我们感谢Julia Eekels（荷兰阿姆斯特丹AMC）向我们发送pcDNA-DEST40质粒，感谢Brigitte Biesinger（荷兰纽伦堡大学）共享天然STAT1抗体，感谢Peter de Haan（荷兰莱顿Amarna Therapeutics B.V.）提供SINrepGFP构建，感谢Peter-Bredenbeek（荷兰莱登LUMC）提供BHK-21J细胞。我们感谢康斯坦丁·谢特萨金（Konstantin Tsetsarkin）和斯蒂芬·希格斯（Stephen Higgs）在CHIKrep-EGFP建设中发挥的作用。Joöl van Mierlo、Teije Kleikamp、Jason Leung和Jan Vermond分别参与了SINrepGFP-wt、CHIKrep-FlucEGFP、CHIKrep-pac2AEGFP和CHIKrep-pac2AEGFP-nsP2m的施工。