谷氨酸转运体细菌同源物的转运机制

摘要

谷氨酸是大脑中主要的兴奋性神经递质，负责学习、记忆形成和高级认知功能。专门的膜蛋白，谷氨酸转运体，也被称为兴奋性氨基酸转运体（EAAT），介导从细胞外空间向星形胶质细胞和神经元的细胞质吸收递质，以对抗陡峭的浓度梯度，从而允许神经传递并防止谷氨酸介导的兴奋性毒性¹EAAT是普遍存在的二级溶质转运蛋白SoLute载体1（SLC1）家族的成员²催化酸性和中性氨基酸和二羧酸在与钠和/或质子的同配位和（或）钾的反配位偶联的反应中的集中摄取。蛋白质介导的溶质转运的概念机制是在40多年前发展起来的^三–5并重点研究了转运蛋白在两种状态之间进行异构化的能力：一种是外向状态，在这种状态下，底物结合位点可以从外部溶液进入；另一种是内向状态，在该状态下，它可以从细胞质到达。虽然我们对转运分子机制的理解在过去十年里有了很大的进步^6,7外向型和内向型国家之间的结构转换特征仍然很差。

钠/天冬氨酸转运体霍里克希热球菌（总合_酸碱度)是EAAT的古老同源物，是首批钠偶联转运体之一，其结构已在近原子分辨率下确定^8,9.Glt的结构分析_酸碱度发现单个原聚体聚集成同源三聚体，形成一个充满溶剂的深碗，向细胞外溶液开放，到达脂质双层的一半(图1a). 每个Glt的前六个跨膜片段（TM）_酸碱度原聚体介导所有亚单位间的接触，并形成一个扭曲的圆柱体，其中蛋白质高度保守的羧基末端折叠成一个紧密的核心。核心由一个细胞内重入螺旋发夹（HP）1、一个未缠绕片段的TM7、一个细胞外发夹HP2和一个两性TM8组成。尽管存在三聚体组装，但所有特征性谷氨酸转运体同源物都具有这种组装^10–12，原聚体独立发挥作用^13–17.始终以Glt表示_酸碱度晶体结构L（左）-asp分子和两个钠离子结合在每个单体的核心内。基质位于细胞外碗底部HP1和HP2的尖端之间，仅被HP2阻挡在水环境中。引人注目的是，在Glt的晶体结构中_酸碱度与竞争性拦截器，L（左）-苏氨酸-β-苄氧基天冬氨酸(L（左）-TBOA）^9,18，HP2呈开放构象，揭示了其动力学性质，并提示其可能作为细胞外闸门。绑定L（左）-asp和L（左）-TBOA从细胞质中分离出超过15μl的致密蛋白核，表明这些结构对应于转运体的外向状态。然而，向内状态的结构以及底物和钠离子释放到细胞内溶液中的方式仍然未知。

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图1

Glt的交叉链接_酸碱度-K55C/A364C

a、，两个子串Glt的卡通表示_酸碱度在膜平面上观察到的原生质体（PDB代码2NWX）。为了清楚起见，去掉了右侧的第三个原聚体和原聚体的TM4。TMs 1至6为有色鲑鱼和小麦；羧基端核为浅蓝色；发夹HP1和HP2为深蓝色。绑定L（左）-asp和Na⁺分别显示为棍子和紫色球体。橙色球体对应于残基55和364的Cα原子。所有分子表示都是使用Pymol生成的⁴⁶.b条Glt的SDS-PAGE分析_酸碱度-K55C/A364C在与100μM CuPhen孵育指定时间前后。洗涤剂固溶纯化Glt_酸碱度-K55C/A364C（左）和原油中的未净化运输车大肠杆菌通过考马斯染色和western印迹分别观察细胞膜（右）。c（c），Glt的交叉链接_酸碱度-50μM HgCl存在下的K55C/A364C₂样品分析如下b条.

TM2和HP2中的交联半胱氨酸

在Glt晶体结构测定之前的一项研究中_酸碱度，Vandenberg和同事报告说，放置在EAAT1的TM2和HP2中的两个半胱氨酸形成了自发的二硫键，表明这些残基非常接近¹⁹引人注目的是，在L（左）-asp和L（左）-TBOA-绑定Glt_酸碱度TM2中的相应残基K55和HP2中的A364相隔25度以上，这些位置的半胱氨酸不太可能交联。此外，子单元间的残差-残差距离也为25–30º(图1a). 这些结果引起了我们的兴趣，我们推断TM2和HP2以一种尚未在结构上具有特征的转运蛋白功能状态并置，并开始在Glt中复制双半胱氨酸突变_酸碱度用于晶体学研究。K55C/A364C突变是在无半胱氨酸的Glt中产生的_酸碱度，单位为大肠杆菌并在洗涤剂溶液中纯化。Glt的氧化交联_酸碱度-在SDS-PAGE上，K55C/A364C在铜1,10-酚妥啉（CuPhen）存在下产生了具有较高电泳迁移率的不同蛋白质物种(图1b)我们将其鉴定为分子内交联Glt_酸碱度原生质体(补充图1a–c). 有趣的是，在没有钠离子（Na⁺)和L（左）-asp，表明残基55和364接近的状态，在这些条件下更容易被填充(图1b和补充图2a). 使用未纯化的K55C/A364C突变体也获得了类似的定性结果大肠杆菌粗膜，证明Glt_酸碱度与EAAT1一样，在脂质双层的背景下采用了新的构象。此外，结构相邻位置的半胱氨酸没有形成二硫键，这表明位置55和364之间的距离缩短是以高度特异的方式发生的(^参考19和补充图2b). 引人注目的是，Glt的孵化_酸碱度-含有二价汞（Hg）的K55C/A364C²⁺)作为双功能硫醇特异性交联剂，在钠存在和不存在的情况下都能产生基本完整的交联⁺和L（左）-洗涤剂和粗膜中的asp(图1c). 此外，交联在几秒钟内完成，表明无底物和结合Glt_酸碱度快速采样交联能态。

晶体结构测定

汞²⁺-交联K55C/A364C突变体（Glt_酸碱度-55摄氏度/364摄氏度_汞)在Na在场的情况下⁺和L（左）-asp产生的晶体衍射到3.5–3.9Å（参见补充表1). Slotboom及其同事先前进行的一项广泛研究表明，相关细菌谷氨酸转运体的功能相关构象转变并不涉及蛋白质三聚化的区域，因为多个界面残基的交联对底物转运没有影响¹⁷因此，我们使用了三聚体Glt_酸碱度模型由TM-s 2、4和5组成，负责所有子单元间的联系(图1a)，以寻找分子替代解决方案。初始相在TM2中与半胱氨酸55相邻位置的汞原子对应的反常差傅里叶图中产生了明显的峰。经过几轮人工构建和精制，得到了一个在氨基和羧基末端分别缺少5个和8个残基的蛋白质模型，其中包括98%的侧链。为了验证模型，我们结晶了硒代蛋氨酸取代的Glt_酸碱度-55摄氏度/364摄氏度_汞异常差异傅里叶图中的硒峰与蛋白质模型中17种蛋氨酸的位置完全一致(补充图3a). 模拟的半胱氨酸55和364的Cα原子之间的距离为7.4º，异常差异傅里叶图中的汞峰位于这些残基之间，硫到汞的距离估计为2–2.3º(补充图3b)与在小分子化合物中观察到的类似²⁰和肽^21,22.

向内状态的结构

Glt最显著的结构特征_酸碱度-K55C/364C型_汞与WT-Glt相比_酸碱度是底物结合位点从细胞外碗底部的细胞外溶液附近向细胞质附近的ca18？运动(图2a、b). 使用三聚化TM-s 2、4和5以及外围TM1的结构叠加表明，这些片段基本上保持不变，原子位置的均方根偏差（RMSD）为1.2º。蛋白质的其余部分，包括TMs 3和6、HP1、TM7、HP2和TM8，没有对齐，并且发生了大量运动(图2a). 值得注意的是，当这些区域单独叠加时，它们的结构基本相同，RMSD为0.6º。这些结果表明Glt_酸碱度可以划分为两个结构域，我们称之为三聚化域和输运域(图2c). 输运畴相对于三聚化畴的刚体运动控制了底层WT-Glt之间的结构变化_酸碱度和Glt_酸碱度-55摄氏度/364摄氏度_汞(图2a，b和补充电影). 离子和底物结合位点的结构环境被保留下来，它们完全位于输运域内。Fo-Fc差分傅里叶图揭示了这些位置的过剩电子密度(补充图4)这意味着运输商仍然必须L（左）-asp和双Na⁺离子。一致无基质Glt_酸碱度-55摄氏度/364摄氏度_汞溶液中结合L（左）-具有高亲和力和钠依赖性的asp(图2d). 在Glt的结构中_酸碱度-55摄氏度/364摄氏度_汞底物结合位点位于HP1和转运结构域TM7的细胞质部分以及三聚化结构域TMs 2和TMs 5之间每个原聚体内形成的深裂缝的底部附近(图2b). 绑定L（左）-asp和Na1被HP1和HP2的尖端从溶液中完全封闭，而Na2部分暴露于溶剂中(图2a、b). 由于底物和离子结合位点靠近细胞内溶液，我们认为Glt的构象_酸碱度-55摄氏度/364摄氏度_汞对应于运输装置的向内状态。

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图2

Glt公司_酸碱度-55摄氏度/364摄氏度_汞处于向内的基态

单个原生质体的卡通表示(一)和通过结合位点切下的三聚体的表面表现(b条). WT总重_酸碱度和Glt_酸碱度-55摄氏度/364摄氏度_汞分别显示在左侧和右侧。在(一)TMs 1、2、4和5为有色小麦，其余原聚体为淡蓝色。纳⁺显示为紫色球体。c、，Glt的细胞外视图_酸碱度-55摄氏度/364摄氏度_汞用直线和曲线分别描绘单个原体和运输域。三聚化域（小麦）和转运域（蓝色）由短细胞质（实心箭头）和细胞外（开放箭头）环连接，以红色突出显示。长TM3-4环（简单箭头）跨越转运域。d日，等温滴定量热分析L（左）-asp绑定到Glt_酸碱度-55摄氏度/364摄氏度_汞所示为10 mM NaCl中的结合热。线性相关性（斜率=−2.6±0.7）日志表观离解常数K_d日，在上日志Na的⁺浓度如插图所示。Glt公司_酸碱度-55摄氏度/364摄氏度_汞被换成了Na⁺/L（左）-无阿斯匹林缓冲液，在Microcal ITC200的反应池中稀释至15–20μM，补充指定浓度的钠⁺，并用滴定剂滴定L（左）-asp在25°C时。结合焓和结合位点表观数量分别为23.6±0.8 kcal/mol和0.4±0.03（n=6）。

由于三聚化域几乎没有发生构象转变，因此它不太可能改变其相对于膜平面的位置。因此，我们估计脂双层的~25μl厚非极区，在WT-Glt中_酸碱度与TM1的疏水部分大致对齐，同样位于Glt中_酸碱度-55立方厘米/364立方厘米_汞这样的双层放置表明，脂代谢TMs 3和6细胞外端的几个极性残基移动到膜的疏水区域。晶体中缺乏脂质双层可能会消除重要的限制，导致转运域的非天然定位。然而，Glt中残留物55C和364C的交联_酸碱度EAAT1中的相应残基有效地出现在脂质膜中，这表明允许转运域有足够的运动范围。运输结构域向细胞质的移动也显著增加了其与细胞内溶剂的接触。引人注目的是，尽管WT中暴露的细胞质总表面积从约1300增加到约4200²在Glt中_酸碱度-55摄氏度/364摄氏度_汞非极区的比例仅从57%适度变化到63%。这两个值都在可溶性蛋白质溶剂暴露面积的报告范围内²³.

域交互接口

两个WT-Glt_酸碱度和Glt_酸碱度-55摄氏度/364摄氏度_汞埋置约等于~2500°的表面积²三聚化域和输运域之间的界面。此外，在这两种结构中，三聚化结构域的基本上是相同的残基，形成了一个光滑的相对无特征的相互作用表面，其疏水性超过80%(图3a、b). 虽然TM1和TM4有助于接触面积，但TM2和TM5彼此平行并以倾斜角度穿过膜，提供了大部分相互作用，分别占WT和Glt中相互作用表面的77%和67%_酸碱度-K55C/A364C_汞分别是。相反，两种结构中的输运畴呈现出相互作用界面，几乎没有重叠，但面积相似（1250²)疏水性（70%）。它们以HP1和WT-Glt中TM7的细胞质部分为主_酸碱度(图3a)以及HP2和Glt中TM8的胞外部分_酸碱度-55立方厘米/364立方厘米_汞(图3b)分别占总埋藏面积的92%和88%。进化保守性分析表明，三聚化结构域内以及运输结构域的两个可选界面内的相互作用残基都是高度保守性的(图3c、d). HP2表面残基的高度保守性和哺乳动物EAAT对HP2半胱氨酸化学修饰的转运抑制^24–28与Glt中观察到的参与特定蛋白质接触的该区域一致_酸碱度-55摄氏度/364摄氏度_汞HP1和TM7的氨基末端部分的脱离以及它们向转运蛋白的细胞质表面的转变也与先前报道的相关原核和哺乳动物转运蛋白中这些区域的胞内溶剂可及性一致^29–32.

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图3

域交互曲面

WT-Glt的三聚化域_酸碱度(一)和Glt_酸碱度-55摄氏度/364摄氏度_汞(b条)以表面表示和彩色小麦表示。由ProFace服务器识别的域联系人中涉及的残留物⁴⁷，分别为蓝色（TM1和2）和绿色（TM4和5）。传输域的相互作用结构元素如带状表示所示：WT-Glt中的HP1（黄色）和TM7（橙色）_酸碱度和Glt中的HP2（红色）和TM8（粉红色）_酸碱度-55摄氏度/364摄氏度_汞三聚体的表面表示(c（c）)和运输(d日)根据进化保守性着色的区域。深蓝色和红色分别对应高度保守和可变残基。相互作用的表面面向观众，白色箭头标记着HP1中高度保守的富含丝氨酸的签名图案。使用Consurf服务器计算保护得分⁴⁸以及从Pfam数据库中获得的212个SLC1序列，其同源性小于60%⁴⁹并在ClustalW2中对齐⁵⁰.

之前已经注意到Glt的羧基末端核心_酸碱度包含结构对称的元素⁸具体而言，HP1和TM7的氨基末端半部分可以叠加在HP2和TM8的氨基末端部分上，RMSD为2.5º。正是这些螺旋的三联体构成了传输域的两个可选交互界面(图3a、b). 值得注意的是，尽管缺乏可检测的序列保守性，但由前6个TM组成的转运体氨基末端部分也表现出伪双重结构对称性。TMs 4到6可以叠加在TMs 1到3上，WT和突变体的RMSD分别为~6和4.3º(图4a、b). 因此，与其他特征二级转运蛋白不同^33–35，谷氨酸转运体不包含一个，而是包含两个反向结构重复(图4d). 由于氨基末端对称性，三聚化结构域的相互作用界面可以划分为结构相关的细胞外和细胞质部分(图4c)约占总埋表面积的一半。

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图4

氨基末端反向结构重复序列

Glt中TMs 1-3（蓝色）和TMs 4-6（绿色）的卡通表示_酸碱度-55摄氏度/364摄氏度_汞在薄膜平原上观察(一)及其结构叠加(b条).c（c）对称螺旋TMs 1–2和TMs 4–5在转运域内形成相互作用表面，转运域被分为细胞内和细胞外两部分，用虚线表示。(d日)Glt示意图_酸碱度三聚（橙色）和转运（浅蓝色）域。蓝色和绿色、黄色和红色梯形强调两个倒置结构重复。WT-Glt中TM2–3和TM5–6回路的结构_酸碱度(e（电子）)和Glt_酸碱度-55摄氏度/364摄氏度_汞(（f）). TMs 2至6以卡通形式显示，为了清晰起见，省略了4。转运体核心以透明表面表示。绑定L（左）-asp和高度保守的甘氨酸显示为球形。

铰链运动

在转运域内，结构对称的TM3和TM6充当两个臂，支撑着转运核心并从三聚化域延伸，前者来自细胞质，后者来自细胞外溶液(图4e、f). 连接这些跨膜节段和三聚体化域的环使其能够向内运动。TMs 3和4之间的长柔性回路在L（左）-asp-bound WT总重_酸碱度晶体和Glt_酸碱度-55摄氏度/364摄氏度_汞其结构在很大程度上取决于晶体接触。相比之下，TMs 2和TMs 3之间以及TMs 5和TMs 6之间的结构对称环路较短，并且经历了明确的过渡，以适应运输域的运动(图4e、f和补充电影). 在Glt中_酸碱度-55摄氏度/364摄氏度_汞TM3α-螺旋的解旋大约一圈，将TM2–3环延长4个残基，并允许TM3向细胞质下降。相比之下，TM5–6环缩短了2个残基，这是因为TM5同时展开半圈，TM6延伸一圈螺旋。这两个环都含有保守的甘氨酸，TM2-3环中的G69、G79和G82，以及TM5-6环中的G221，这可能有助于螺旋的折叠/展开，并用作铰链。事实上，运输结构域的运动可以分解为向细胞质的16度下降，然后围绕同时通过运输结构域质心和TM2–3和TM5–6环的轴旋转37°。与环区结构重排的重要性一致，EAAT3 TM5-6环中半胱氨酸的化学修饰抑制了摄取³⁶.

运输机制

在WT Glt的结构中_酸碱度,L（左）-asp在HP2封闭的细胞外碗表面以下结合~5μl。相反，在Glt的结构中_酸碱度-55摄氏度/364摄氏度_汞,L（左）-asp在HP1封闭的细胞内表面下结合~5μl。因此，我们建议L（左）-asp-bound Glt公司_酸碱度结构对应于细胞外基质结合后的状态，外表面闭塞，和Glt_酸碱度-55摄氏度/364摄氏度_汞结构-底物释放到细胞质之前的状态，内表面闭塞(图5). 这些状态之间的异构化涉及跨膜运动和转运结构域的旋转的组合，转运结构域由底物结合转运蛋白核心和外周TM3和6组成。在这个运动过程中，脂溶性疏水性TMs 3和6直接穿过双层，向细胞质移动约12μl。相反，相对极性的HP1和HP2的通过，其尖端跨越脂质双层的20°，是由三聚化结构域提供的蛋白内轨道促进的。转运域预计会在每个原单体内随机独立地移动，因此，当所有三个转运域都位于向内方向时，晶体结构表现出统计上罕见的情况。刚性三聚体结构域锚定在膜中，为大块转运结构域的运动提供了平衡，这说明SLC1转运蛋白家族的必需寡聚体组装。

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图5

运输机构示意图

图中显示的是单个转运蛋白原聚体。与外向和内向状态结合的底物和钠分别与细胞外和细胞内闸门HP2（红色）和HP1（黄色）的关闭相耦合。当传输域（蓝色）相对于三聚化域（灰色）移动时，外向和内向闭塞状态之间发生异构化。向内开放状态尚未在结构上进行描述，只是一种假设。

膜两侧的底物结合/解离与额外的构象变化或闸门开口有关。晶体数据和分子动力学模拟^9,37,38提示细胞外侧的底物和离子解离与HP2的开放有关，将其定义为细胞外门。我们假设HP1以功能对称的方式运动，允许底物和离子从内向状态分离，将其定义为真诚地细胞内闸门。严格保持细胞外和细胞内闸门的交替打开：在外向状态下，当HP2打开以将底物和离子结合位点暴露于细胞外溶液中时，HP1被固定在闭合状态下，与TMs 2和TMs 5相抗衡。相反，在向内状态下，HP2（细胞外闸门）在取代HP1后被锁定关闭。

如前所述³⁹底物运输与离子梯度能量的耦合是通过底物和钠离子在膜的细胞外和细胞内侧的协同结合建立的，耦合到相应的门关闭。在WT-Glt中观察到底物结合对钠的陡峭依赖性_酸碱度⁹和Glt_酸碱度-55摄氏度/364摄氏度_汞(图2d)钠离子浓度高的细胞外侧和钠离子浓度低的细胞内侧的底物亲和力不同。我们进一步提出，外向态和内向态之间的异构化是钠无关的，可能仅仅由热能驱动。观察到汞²⁺-在膜和洗涤剂中，K55C/A364C突变体的介导交联在几秒钟内完成，这表明这种转变很快，不会限制Glt的转运速度_酸碱度，在环境温度下的周转时间约为3分钟⁴⁰最后，我们假设在载脂蛋白转运蛋白中也可能发生类似的异构化反应来完成转运循环。转运域内的结构重排，允许在没有结合底物和离子的情况下关闭细胞外和细胞内的门，尚待阐明。

方法

补充材料

致谢

脚注

参考文献