基因标记未检测到小鼠肝纤维化中胆管细胞的上皮-间充质转化（EMT）

摘要

简介

肝硬化是慢性肝损伤的结果，其特征是细胞外基质蛋白（ECM）过度积累，主要是I型胶原¹肝星状细胞（HSC）被认为是ECM的主要来源¹但不是损伤肝脏中肌成纤维细胞的唯一来源²肝肌成纤维细胞也可能来源于门静脉成纤维细胞、间期（间隔）肌成纤维纤维细胞，以及在较小程度上来源于骨髓的间充质细胞^三另一种与实质器官纤维化有关的机制是上皮-间充质转化（EMT），即上皮细胞获得间充质细胞的特征⁴在此过程中，上皮细胞从上皮层分离，失去极性，上皮标记物（如细胞角蛋白-19（K19）、CK7、e-cadherin）和紧密连接蛋白（闭塞带-1、ZO-1）的表达，增加其运动性，获得（肌）成纤维细胞表型⁵上皮细胞转化为（肌）成纤维细胞后上调成纤维细胞特异性蛋白-1（FSP-1，a Ca²⁺-结合S100蛋白），已成为纤维生成和癌症过程中EMT的通用标记^5,6.

EMT在胚胎发育过程中的器官发生中起着重要作用⁵在成人组织中，EMT是一种促进转移和癌症发展的机制⁷此外，几项研究表明，EMT发生在对损伤和慢性炎症的反应中，并促进纤维化⁵慢性损伤中的EMT最典型的特征是肾脏纤维化⁸Iwano等人利用gGT-LacZ转基因小鼠（可识别纤维化肾脏中的肾小管上皮细胞）证明，超过三分之一的肾间质成纤维细胞是通过EMT获得的⁶.其他研究将EMT与肺纤维化、类风湿关节炎和视网膜病变联系起来⁸同时，EMT衍生细胞对纤维化肝脏中肝肌成纤维细胞群的作用尚不清楚⁴典型的肌成纤维细胞，不依赖其来源或定位，通过特定的形态（产生应力纤维）、分泌ECM的能力（纤维连接蛋白和I型和III型胶原）以及α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达来鉴定²肝纤维化患者和小鼠肝细胞EMT的报告⁹.使用白蛋白的基因命运标记⁺肝细胞，Zeisberg等人报道了肝FSP-1的群体⁺成纤维细胞来源于成熟肝细胞以应对肝损伤¹⁰然而，在这些FSP-1中仅观察到α-SMA的最小表达⁺细胞（<10%）¹⁰与此数据一致，白蛋白-Cre与Rosa-LacZ小鼠和胶原α1（I）-GFP报告小鼠的遗传杂交，其中LacZ的转变⁺监测肝细胞转化成胶原表达的肌成纤维细胞体内，在纤维化肝中未检测到EMT衍生的肌成纤维细胞¹¹.

在患者、大鼠和小鼠中，胆管细胞的EMT与原发性胆道纤维化（PCB）和NAFLD有关^12,13这些研究，特别是在人类中的研究，主要依赖于免疫组织化学分析，并基于上皮和肌成纤维细胞标志物在相同细胞中的共同定位得出结论。胆管细胞特异性小鼠的产生（在诱导性细胞角蛋白-19启动子的控制下表达Cre¹⁴)和EMT特异性小鼠（在FSP-1启动子下表达Cre¹⁵)现在可以追踪胆管细胞的命运并研究其可能的EMT对损伤的反应。

由于EMT反映了固有的细胞可塑性，它与另一个过程密切相关，即间质-上皮转换（MET）⁴，其特征在于间充质细胞向上皮细胞的（反式）分化。有人认为，作为对慢性损伤的反应，肝星状细胞（HSC）可以经历MET，并在某些情况下获得上皮表型¹⁶在肝纤维化过程中，HSC通过从静止表型到肌成纤维细胞表型的激活表现出独特的可塑性。在静止状态下，HSC驻留在Diss空间并储存维生素A¹它们表达神经标记物，如胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、联丝素和突触素，以及间充质/中胚层标记物，例如结蛋白和波形蛋白¹为应对慢性肝损伤，静止的HSC激活，失去维生素A滴并转化为肌成纤维细胞。激活后，HSC改变其形态，迁移到损伤部位，下调神经标记物并上调间充质标记物，例如胶原α1（I）、α-SMA和纤维连接蛋白。HSC前体可能起源于胚胎EMT⁴由于GFAP在静止的HSC中表达，因此可以在GFAP杂交产生的遗传标记HSC中研究MET^Cre公司老鼠和报告老鼠。此外，新的单克隆抗体能够识别小鼠体内的多种肝上皮祖细胞，为研究MET和纤维化肝再生机制提供了新的试剂¹⁷.

材料和方法

结果

研究设计

本研究旨在确定慢性肝损伤是否通过EMT诱导1）胆管细胞参与肌成纤维细胞群；和2）HSC接受MET以促进上皮细胞（肝细胞和胆管细胞）的再生，并作为肝祖细胞的兼性来源。基于Cre-loxP系统的遗传方法被用于在细胞命运改变之前标记感兴趣的细胞。研究EMT在肝纤维化、胆管细胞特异性K19中的作用^CreERT公司老鼠¹⁴将他莫昔芬诱导的CreERT敲入内源性细胞角蛋白-19基因座，与ROSA26杂交^f/f-YFP型报告鼠(图1A). 双转基因K19^YFP公司Cre和YFP纯合的后代用三苯氧胺（5 mg/小鼠，图1C)最大标记K19⁺胆管细胞伴YFP。为了鉴定通过EMT、FSP-1过渡到新表型的细胞^Cre公司小鼠与ROSA26杂交^f/f-YFP型报告小鼠产生FSP-1^YFP公司小鼠，其中表达FSP-1的细胞被YFP表达永久标记(图1B). 反过来，为了研究MET，通过交叉GFAP标记静止的HSC^Cre公司ROSA26小鼠^f/f-mT/GFP小鼠（产生GFAP^GFP公司小鼠），而活化的HSC通过交叉胶原蛋白-α2（I）标记^Cre公司ROSA26小鼠^f/f-YFP型小鼠（产生Col2（I）^YFP公司老鼠；图1B).

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图1

利用遗传细胞命运图对小鼠肝损伤反应中的EMT和MET进行了研究

A） K19的生成^GFP公司研究K19中EMT的小鼠⁺胆管细胞。三苯氧胺给药后，K19胆管细胞的基因标记得以实现^GFP公司老鼠。

B） 小鼠遗传杂交总结。在K19中研究了EMT^GFP公司和FSP-1^YFP公司老鼠。在GFAP中研究了MET^GFP公司和第2（I）列^YFP公司.

C） 研究设计：K19^YFP公司在损伤之前和整个损伤过程中，用三苯氧胺（5mg/只）、BDL（3w）或CCl治疗小鼠₄-（0.5µl/g/玉米油；6 w）。显示了三苯氧胺给药方案（蓝色箭头）和肝损伤诱导方案（红色箭头）。

诱导肝纤维化研究胆管细胞EMT

研究EMT在肝纤维化、胆管细胞特异性K19中的作用^YFP公司用BDL或CCl对小鼠造成21天的肝损伤₄（0.5µl/g×16次）持续2个月(图1C). 同样，FSP-1^YFP公司小鼠，GFAP^GFP公司和第2（I）列^YFP公司小鼠受到BDL或CCl₄使用相同的治疗方案。

所有小鼠均出现肝纤维化(图2A). BDL-operated K19的肝脏中羟脯氨酸含量增加了约3倍^YFP公司老鼠，与假手术的室友相比。BDL肝脏中天狼星红染色达到9%，而非手术K19中为1.4%^YFP公司老鼠。BDL与假手术小鼠的肝脏中检测到胶原蛋白α1（I）（↑6.8倍）、α-SMA（↑5.3倍）和FSP-1蛋白（↑6倍）mRNA表达水平升高(图2A和B). CCl中也获得了类似的结果₄-处理过的K19^YFP公司小鼠，如羟脯氨酸含量（↑是对照组小鼠的4倍）、天狼星红染色（↑11%对1.4%）、免疫组织化学和RT-PCR所示(图2A和C). 因此，我们认为BDL或CCl引起的肝损伤₄导致纤维化，因此可以在这些小鼠中诱导EMT或MET。

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图2

K19诱导肝纤维化^YFP公司老鼠

A） 评估肝脏形态和纤维化K19^YFP公司通过H&E、天狼星红染色、免疫组化检测小鼠α-SMA和FSP-1的表达。代表性图像以20倍和40倍的放大倍数显示。

B） ●●●●。通过羟脯氨酸、天狼星红和胶原α1（I）、α-SMA和FSP-1 mRNA表达定量胶原沉积，以应对BDL。（*p<0.05，n=10）

C） CCl导致胶原沉积和纤维生成基因表达增加₄治疗（*p<0.05，n=10）。

诱导小鼠Cre/LoxP重组以研究EMT/MET

在K19中分析了他莫昔芬诱导的Cre-loxP重组^YFP公司在肝损伤之前或之后的小鼠，并与未经治疗的小鼠（无他莫昔芬）进行比较。如预期，只有K19^YFP公司接受三苯氧胺的小鼠表达YFP，用抗GFP抗体进行特异性免疫染色检测(图3A和补充图1S). 接下来，在对照组或肝损伤K19中评估Cre-loxP重组的效率^YFP公司老鼠。如预期，K19^YFP公司抗胰细胞角蛋白抗体对胆管细胞染色阳性(图3A)特异性定位于胆管，通过H&E或Troma III抗体免疫染色鉴定(补充图2S和3S). 计算标记胆管细胞的百分比，并与全胰细胞角蛋白（Pan-CK）阳性胆管细胞（100%）进行比较，在假手术K19中占32±2%^YFP公司老鼠(图3A和C). 总胆管梗阻导致胆管上皮细胞增殖，在BDL K19中YFP标记的胆管百分比增加到46±7%^YFP公司老鼠。YFP的类似数量⁺用CCl处理的小鼠中检测到胆管细胞₄（41±5%）或玉米油（27±6%）。在FSP-1中量化基因标记细胞的数量^YFP公司、GFAP^GFP公司和第2（I）列^YFP公司在诱导肝损伤前后表达组成性Cre的小鼠。YFP的数量⁺BDL FSP-1的肝脏细胞显著增加^YFP公司与假对照组相比，小鼠肝细胞总数（100%）为31±3%至3±1%。CCl中也获得了类似的结果₄-处理过的FSP-1^YFP公司小鼠（24±2%对2±0.6%），表明FSP-1的诱导是肝纤维化的一般特征。

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图3

K19肝损伤的诱导^YFP公司老鼠

A） 他莫昔芬诱导K19细胞Cre-loxP重组^Cre公司如YFP的免疫组织化学（上图）和泛细胞角蛋白（Pan-CK）和YFP的免疫荧光（下图）所示。显示胆管（bd）、肝动脉（ha）和门静脉（pv）。

B） 在K19中定量Cre-loxP重组^Cre公司老鼠。条形图显示与Pan-CK相比YFP标记的胆管细胞数量⁺胆管细胞（100%）（p<0.05，n=10）。

C） 评估三苯氧胺处理的K19中Cre-loxP重组的效率^YFP公司小鼠与总Pan-CK的比较⁺胆管细胞（100%）；在GFAP中^GFP公司或第2（I）列^YFP公司根据基因标记GFP的数量，小鼠处于分离的肌成纤维细胞组分（100%）中⁺或YFP⁺单元格。

D） 肝损伤增加K19的数量⁺、FSP-1和GFAP⁺细胞。比较BDL和半手术小鼠或CCl中标记细胞的数量₄-和玉米油处理的小鼠，并表示为各组计算的比率。

CCl公司₄损伤还诱导HSC激活，YFP数量增加就表明了这一点⁺在从Col2（I）分离的肌成纤维细胞（100%）的制剂中检测到的细胞^YFP公司老鼠(图3C). 针对CCl₄诱导损伤，Col2（I）中基因标记的HSC数量从21±4%到95±3%不等^YFP公司小鼠，GFAP从82±7%增加到84±4%^GFP公司老鼠。总之，在所有转基因小鼠中都实现了Cre-loxP重组，并导致K19的特异性标记⁺胆管细胞，FSP-1⁺细胞和静止GFAP⁺并激活Col2（I）⁺HSC。基因标记K19的数量⁺胆管细胞，FSP-1⁺细胞和GFAP⁺HSC因受伤而增加(图3D)与对照组小鼠比较。

肝纤维化中胆管细胞的EMT与肌成纤维细胞群无关

在K19中研究了EMT在肝纤维化发病机制中的作用^YFP公司小鼠，其中K19⁺胆管细胞及其子代被YFP表达永久标记。除了现有的胆管细胞外，重复使用三苯氧胺还可诱导新胆管细胞中YFP的表达，以应对损伤。YFP公司⁺胆管细胞位于门脉区(图4A). YFP中的EMT⁺在K19中评估胆管细胞^YFP公司并通过在有K19表达史的细胞中共同表达间充质标志物（α-SMA，结蛋白）来确定。在YFP中未检测到HSC标记GFAP的表达⁺胆管细胞。用检测肌成纤维细胞的抗α-SMA和抗结蛋白抗体进行免疫染色，发现α-SMA或结蛋白在YFP中没有共同定位⁺BDL-operated K19的肝脏细胞^YFP公司老鼠。同样，双阳性YFP⁺α-SMA⁺或YFP⁺结蛋白⁺CCl中未观察到细胞₄-处理过的K19^YFP公司这表明胆管细胞的EMT对实验性肝纤维化不会产生肌成纤维细胞。为了证实这些结果，使用梯度离心法从BDL损伤的K19的纤维化肝脏中纯化肌成纤维细胞群^YFP公司或第2（I）列^YFP公司老鼠。在K19的培养物中未检测到YFP阳性细胞^YFP公司在对照实验中，小鼠97±3%的肌成纤维细胞来源于Col2（I）^YFP公司小鼠，表达YFP。因此，我们的结果表明，基因标记胆管细胞的EMT对HSC或肌成纤维细胞没有贡献，正如使用两种实验性肝纤维化模型所证明的那样。

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图4

胆管细胞中的EMT对肝损伤反应中的肌成纤维细胞群没有作用

A） 在BDL-或CCl中₄-受伤的K19^YFP公司小鼠，基因标记的YFP⁺400倍放大后显示，胆管细胞未共同表达肌成纤维细胞标记物（α-SMA、Desmin或GFAP）。

B） 从BDL-operated K19中分离的肌成纤维细胞部分^YFP公司小鼠缺乏EMT-衍生YFP⁺细胞，用抗GFP抗体固定检测。作为对照，从CCl分离的97%的电镀细胞肌成纤维细胞中检测到YFP的表达₄-处理后的Col2（I）^YFP公司小鼠（p<0.05）。

C） ●●●●。K19肝组织^YFP公司小鼠用抗FSP-1抗体染色。FSP-1-GFP报告小鼠（n=7）的肝脏切片用抗GFP和抗Pan-CK抗体染色。同样，FSP-1^YFP公司用抗GFP和抗Pan-CK抗体对小鼠（n＝8）进行染色。代表性图像以40倍和400倍的放大倍数显示。

肝星状细胞的细胞命运定位研究MET在肝纤维化中的作用

MET是一个与EMT相反的过程，肌成纤维细胞在此过程中分化为上皮样细胞⁴为了跟踪成年小鼠肝星状细胞对肝纤维化的反应，GFAP^Cre公司小鼠与Rosa26杂交^f/f-mT/GFP小鼠产生GFAP^GFP公司老鼠(图5A和​和3C）。3厘米). 这些小鼠通过GFAP中GFP的表达证明了成功的Cre-loxP重组⁺细胞，但不是番茄红⁺肝细胞。诱导肝损伤^GFP公司用CCl处理小鼠₄通过抗α-SMA、抗结蛋白、抗Pan-CK和E-cadherin抗体的免疫染色来评估HSC在急性损伤反应或恢复期间接受MET的能力。正如预期的那样，活化的HSC增殖，迁移到纤维间隔，并表达成肌纤维细胞标记物α-SMA和结蛋白(图5B). 双正α-SMA⁺GFP公司⁺和结蛋白⁺GFP公司⁺细胞被膜标记的GFP信号包围，通过伪红色胞浆染色观察细胞。虽然在GFAP的纤维化区域检测到上皮标记物E-钙粘蛋白^GFP公司肝脏，它没有与GFAP共同定位^GFP公司+高速列车(图5B). Pan-CK也获得了类似的结果⁺胆管细胞虽然位于HSC附近，但与GFAP没有共同定位^{绿色荧光粉+}电池（图B和C）。

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图5

基因标记的静止或激活HSC对CCl不进行MET反应₄受伤或恢复期间

A） GFAP肝组织形态学研究^GFP公司小鼠在受伤前（上面板）和CCl后出现₄管理（下部面板）。静止和激活的HSC用膜结合GFP表达标记（绿色箭头），肝细胞保留mTRed表达（白色箭头；放大200倍）。

B） 基因标记GFAP⁺静止的HSC对CCl不表达MET标记₄或在GFAP恢复期间^Cre公司小鼠（n=10）。图像显示了具有抗α-SMA、抗Desmin、E-cadherin（E-cad）或Pan-CK抗体的同一组织切片的形态学（上面板）和共染色（下面板），并使用Alexa-Ffluor-633结合的α-SMA二级抗体、Desmin二级抗体（以伪红色显示）、E-cadtherin和Pan-CK二级抗体进行可视化（伪蓝色；600倍放大）.

C） GFAP的连续肝脏切片^GFP公司小鼠表现出基因标记GFAP的差异定位⁺HSC和Pan CK⁺胆道细胞对CCl的反应₄.

D） 基因标记的活化HSC在CCl中不进行MET₄-处理后的Col2（1）^YFP公司小鼠（n=10）。第2列（1）^YFP公司小鼠上调所有活化HSC中的YFP，并共同表达α-SMA和结蛋白，但缺乏Pan-CK表达（放大200倍）。

作为评估MET的替代方法，胶原蛋白α2（I）-Cre小鼠与Rosa26杂交^f/f-YFP型分析小鼠和胶原蛋白表达激活的HSC（以及任何其他肌成纤维细胞）对CCl的反应中MET标记的表达₄-诱导性肝损伤(图5D). 然而，与GFAP类似^GFP公司小鼠，Col^YFP公司+细胞与Pan-CK没有共同定位⁺胆管细胞。

为了进一步分析星状细胞可塑性的概念，来自CCl的肝脏₄-处理过的GFAP^GFP公司用小鼠卵圆细胞特异性标记物对小鼠进行染色¹⁷最近产生了几种抗体，可识别DDC诱导小鼠的祖细胞。尽管这些抗体识别CCl中的少量祖细胞₄-我们没有发现任何GFAP^GFP公司+这些标记物的标记HSC染色(图6).

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图6

肝干细胞在CCl反应中不表达肝祖细胞标记物₄

GFAP中未同时表达祖细胞标记^GFP公司+HSC。CCl的生命₄-处理过的GFAP^GFP公司用识别导管区和导管周区肝祖细胞的抗体对小鼠进行染色。每个免疫染色（伪红色）显示了组织结构（左）和联合染色（右）。代表性图像以600倍的放大倍数显示。

讨论

慢性炎症和持续性肝损伤可能导致具有固有细胞可塑性的正常生理失调，导致EMT和/或MET。尽管这两个过程都可能促进再生，但它们也可能加速肝纤维化的进展。使用两种肝纤维化模型BDL和CCl₄，我们已经确定基因标记的K19⁺胆管细胞不接受EMT。而FSP-1⁺细胞广泛存在于纤维化肝脏中，该标记物在Pan-CK中没有上调⁺胆管细胞。此外，纤维化肝损伤并没有促使肝星状细胞表达上皮细胞标记物，如全细胞角蛋白或E-cadherin。HSC也缺乏肝祖细胞标记物。综上所述，目前的研究提供了证据表明，胆管细胞中的EMT和HSC中的MET对实验性肝纤维化或肝再生没有帮助。

最近的研究报道，EMT在人类、大鼠和小鼠的胆道纤维化中起作用¹²主要采用免疫组织化学分析，通过EMT特异性标记物FSP-1在CK-7中的共同定位来鉴定胆管细胞中的EMT⁺细胞^{12,13 20}虽然这些研究表明CK-7中存在共染色⁺EMT对细胞外基质沉积和纤维化的作用没有文献记载。此外，EMT完全基于FSP-1和CK-7的共同表达，或检测EMT激活的信号转导通路对损伤的反应⁹未经胆管细胞分化为间充质表型的细胞。总之，在人类和啮齿动物中检测EMT提供了几个困难：1）免疫组织化学抗体的特异性，如CK-7，可能识别与K19稍有不同的人群⁺或平移CK⁺胆管细胞；2） 早期EMT典型的FSP-1和上皮标记物（CK-7、Pan-CK或K19）的共同表达可能是暂时的。因此，发现这些标记物没有共同表达并不排除EMT的发生；3） 共定标研究可能通过荧光探针漏出或通过重叠表达不同标记的细胞被误解为单个细胞而产生假阳性。为了克服这些障碍体内相关细胞K19的标记⁺在本研究中，胆管细胞和监测其在整个肝损伤期间的表型变化被认为是一种选择方法。

我们用基因标记K19⁺成年小鼠胆管细胞研究EMT对纤维化肝损伤的反应。他莫昔芬诱导K19^CreERT公司选择小鼠有以下几个原因：1）为了避免K19的基因标记⁺在胚胎发育期间发生的细胞中，三苯氧胺诱导的Cre-ERT基因被敲入K19启动子的遗传位点¹⁴; 2） 经抗K19和Pan-CK抗体免疫染色证实，K19启动子对肝内胆管细胞高度特异；3） 在整个肝损伤过程中，监测K19标记的胆管细胞中间充质标志物（FSP-1、α-SMA和结蛋白）的上调，追踪单个细胞的初始（上皮）和最终（间充质）表型；4） BDL对胆道上皮的损伤最大，伴随着胆道的增生，这种情况被认为是诱发EMT的条件。因此，使用K19^YFP公司小鼠（K19^CreERT公司小鼠×Rosa26^f/f-YFP型小鼠），我们已经证明具有K19表达史的细胞不表达α-SMA或结蛋白，这是肌成纤维细胞典型表达的间充质标记物。此外，K19标记的胆管细胞没有共同表达FSP-1，这是一种与EMT相关的标记物，表明纤维肝损伤不会诱导胆管细胞发生EMT。

我们的结果与Omenetti等人报告的结果不同¹²和Roderfeld等人²⁰在CK-7阳性胆道细胞中显示FSP-1的共同表达。有几个因素可以解释这种差异。第一，诱导型K19^Cre公司小鼠在损伤时标记出高度特异性的成熟胆管细胞群。而且，与之前报道的CK-7不同⁺单元格，此K19⁺胆管细胞亚群可能与EMT无关。与此假设一致，K19的种群⁺/CK7型⁻在成年大鼠体内鉴定出胆管细胞。这些K19⁺/CK7（CK7）⁻给予2-乙酰氨基芴（AAF）后，胆管细胞增殖，位于胆管树的较小分支，包括Hering管²¹第二，尽管我们已经证明K19⁺胆管细胞在BDL肝损伤后增殖，胆管细胞是异质性的。这一事实不仅得到K19的鉴定支持⁺/CK-7公司⁻胆管细胞，但也通过Hering管中存在的卵圆细胞和其他肝祖细胞¹⁷第三，肝纤维化的发展往往取决于损伤模型和转基因/敲除小鼠的选择。因此，例如，Omenetti等人研究了Ptc缺乏小鼠，而Roderfeld等人使用Abcb4^−/−老鼠。我们当前的研究重点是K19中的EMT⁺实验性纤维化野生型小鼠的胆管细胞。为了加强我们的发现，我们分析了可能经历过EMT的细胞，并在某些时候上调FSP-1以应对损伤。然而，基因标记的FSP-1⁺这些细胞不表达胆管细胞标记物（Pan-CK），这证明胆管细胞不表达FSP-1，也不会对实验性肝纤维化进行EMT反应。当然，与患者肝纤维化进展的年份相比，所有这些基因小鼠实验都受到研究持续时间短（通常为2-8周）的限制。因此，患者胆管细胞的EMT最初由上皮细胞和肌纤维母细胞样标记物的共同表达定义^22–24，无法排除。

不幸的是，使用Cre-LoxP系统对纤维化EMT的遗传学研究有其自身的局限性。特定细胞群体的遗传标记是通过将在细胞特异性启动子控制下表达Cre的小鼠与报告小鼠杂交来实现的，报告小鼠普遍表达β-女孩或yfp公司转录被阻断的基因用鞭子抽打停止磁带²⁵报告小鼠的选择至关重要，并且Rosa26^f/f-YFP型小鼠优于Rosa26^{f/f-β-加仑}随着年龄的增长，非特异性β-gal在组织中的积累增加。小鼠细胞命运定位存在两个问题：Cre的特异性和Cre-lox重组的效率。由于Cre表达的特异性可以通过免疫染色证实，Cre-lox重组的效率仅取决于Cre浓度。因此，在小鼠中很少能实现100%的Cre-lox重组。在ER-Cre小鼠中尤其困难，其中Cre的表达受他莫昔芬给药的调节，并且受给药剂量、途径和频率的强烈影响²⁶许多成熟的Cre-或ER-Cre小鼠的Cre-Lox重组不完全，这给小鼠的条件性基因消融带来了问题²⁷然而，Cre-lox系统仍然是监测小鼠特定细胞群及其后代的最可靠工具。因此，使用白蛋白-Cre小鼠，肝细胞中没有实现完全的Cre-LoxP重组，但仍显示缺乏EMT对损伤的反应¹¹通过每次实验检查大量小鼠和每只小鼠的细胞，可以在细胞命运定位研究中克服Cre-LoxP重组效率低下的问题。这样可以获得具有统计意义的结果。由于我们无法在1000多个K19中确定任何共表达EMT标记的基因标记细胞^YFP公司+细胞，（例如α-SMA和K19^YFP公司，或desmin和K19^YFP公司)，当计算100%胆管细胞时，这个数字没有增加。

我们目前的研究还研究了肝星状细胞（HSCs）MET在肝损伤反应中的作用。再次，使用遗传方法，我们发现静止的GFAP⁺-标记非活化胶原蛋白-α2（I）⁺-CCl后标记的HSC表达上皮细胞或胆管细胞标记物₄-激活或恢复。我们的发现与Yang等人不同，他们认为静止的HSC可能分化为肝细胞，因此属于卵圆细胞家族²⁸由于神经标记物的表达，HSC被认为起源于胚胎发育过程中与脑星形胶质细胞相同的共同前体。此外，有人建议成人骨髓可以作为HSC补充的来源，以应对损伤²⁹最近对大鼠的研究表明，除了上皮细胞外，Thy-1.1⁺卵圆形细胞也可能产生具有肌纤维母细胞表型的细胞³⁰此外，祖细胞标记物CD133的表达增加了HSC可能来自成人肝脏中常见的肝前体细胞（或肝干细胞）的可能性²⁸使用最近生成的单克隆抗体进行免疫染色，以检测导管和导管周围区域的卵圆细胞反应¹⁷，我们证明了来自CCl的GFP标记的HSC₄-处理过的GFAP^GFP公司小鼠缺乏卵圆细胞标记物。虽然我们的研究没有提供关于HSC、肝细胞和胆管细胞是否存在共同的肝前体细胞的信息，但它确实证明HSC和肌成纤维细胞没有经过MET变成上皮细胞。

补充材料

致谢

缩写

脚注

参考文献