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致癌物。作者手稿；PMC 2010年8月25日发布。
以最终编辑形式发布为：
致癌物。2008年2月28日；27(10): 1366–1375.
2007年9月17日在线发布。 数字对象标识：10.1038/sj.onc.110783
预防性维修识别码：PMC2928058型
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院227909
PMID：17873911

BH3-only蛋白BIK诱导具有自噬特征的caspase-independent细胞死亡Bcl-2型空单元格

R拉什米,1,三 SG皮莱,1,三 S维贾亚林加姆,1 J莱尔斯,2和G钦纳杜赖1
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补充资料

摘要

BH3-only蛋白BIK通常诱导凋亡细胞死亡。在这里，我们使用以下方法研究了BCL-2在BIK诱导的细胞死亡中的作用Bcl-2型+/+和Bcl-2型−/−小鼠胚胎成纤维细胞。BIK的异位表达Bcl-2型−/−细胞导致的细胞死亡比Bcl-2型+/+细胞。在这些细胞中，虽然caspase-8被激活，但caspase-9和3没有显著激活。没有检测到线粒体到胞质的细胞色素c释放。然而，AIF从线粒体到细胞核有显著的再分配。用胰蛋白酶抑制剂zVAD-fmk治疗后，BIK诱导的细胞死亡程度增加。这个Bcl-2型表达BIK的空细胞表现出自噬特征，如胞浆空泡、LC3点状分布和Beclin-1表达增强。表达BIK的存活率Bcl-2型−/−细胞在PI3激酶抑制剂3-甲基腺嘌呤和沃特曼的存在下以及通过消耗Atg5和Beclin-1而增强。表达BIK的死亡Bcl-2型−/−用zVAD-fmk处理的细胞在胱天蛋白酶-8缺失的情况下增加。我们的结果表明BIK在Bcl-2型细胞缺陷导致具有自噬特征的细胞死亡，抑制caspases可增加这种细胞死亡的程度。

关键词：自行车，Bcl-2型，自噬，Beclin-1，LC3

介绍

程序性细胞死亡是一个正常的生理过程，在发育过程中维持组织内环境稳定。细胞凋亡是广泛研究的细胞程序性死亡形式。BCL-2家族蛋白通过促进动物细胞存活和死亡，在调节细胞凋亡方面发挥着重要作用。BCL-2及其近亲如BCL-xL促进细胞存活。BCL-2家族蛋白的第二个亚家族成员（称为BH123蛋白）与BCL-2共享三个保守结构域，并促进细胞死亡。促凋亡蛋白BAX和BAK是这个家族中众所周知的成员。第三个亚家族成员仅与其他BCL-2家族蛋白共享BH3结构域。BH3-only蛋白促进BAX和BAK上游的细胞死亡和功能(世界环境学会等人。, 2001;宗等人。, 2001). BH3-only蛋白通过BAX和BAK诱导细胞死亡的分子机制仍然是一个备受争议的问题。

最近，对其他形式的调节性细胞死亡（如自噬死亡和坏死）的研究受到了应有的关注(津本和清水，2005年;戈尔斯坦和克罗默，2007年). 尽管自噬被认为是营养缺乏时的一种生存机制，但现在人们普遍认为，自噬过程最终导致细胞死亡，而细胞死亡在形态上与坏死相似。某些已知的通常诱导细胞凋亡的细胞毒药物已被证明在由于缺乏BAX和BAK而缺乏凋亡的细胞中诱导自噬死亡(清水等人。, 2004;勒姆等人。, 2005). 因此，凋亡不足似乎会使细胞转向自噬性细胞死亡。PI3激酶途径的化学抑制剂(清水等人。, 2004)以及BCL-2和vBCL-2等前体蛋白的异位表达(帕廷格等人。, 2005)已经证明可以抑制自噬细胞死亡。

BIK是BH3-only家族蛋白的创始成员(博伊德等人。, 1995). 许多报道表明，BIK的异位过表达会导致细胞凋亡。然而，也有报道称BIK会导致人类恶性胶质瘤中的非凋亡细胞死亡(诺曼等人。, 2003)和黑色素瘤细胞(奥普曼等人。, 2005). 在研究BCL-2对BIK活性的调节作用时，我们发现Bcl-2型空白小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）对BIK诱导的死亡高度敏感。在这些细胞中，BIK诱导具有自噬特征的caspase非依赖性细胞死亡。这种形式的BIK诱导的细胞死亡通过抑制半胱天冬酶而增强。

结果

异位BIK过度表达对Bcl-2的影响+/+和Bcl-2−/−MEF公司

研究BCL-2在调节永生化BIK活性中的作用Bcl-2型+/+和Bcl-2型−/−MEF感染表达BIK（Ad-BIK）或LacZ（Ad-LacZ）的腺病毒载体，每细胞500 PFU。使用MTS测定法测定BIK表达对细胞活力的影响(图1a). 在Bcl-2型+/+细胞的存活率略有下降，从感染24小时时的约90%下降到72小时后的约70%Bcl-2型−/−细胞的存活率从感染24小时时的70%到72小时后的45%不等。两种细胞类型中BIK（包括磷酸化形式）的表达水平具有可比性(图1b). DAPI染色的细胞核可视化显示，细胞核基本完整，无明显凝集Bcl-2型+/+感染Ad-BIK或Ad-LacZ的细胞。在Bcl-2型−/−观察到细胞、非典型核形态和一些核凝聚(图1c). 这些结果表明，BCL-2可防止BIK诱导的细胞死亡（在观察到的异位BIK表达水平下），而BCL-2缺乏可增强MEF中BIK诱导细胞死亡。

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的影响Bcl-2型BIK介导的细胞死亡。(一)的可行性Bcl-2型+/+和Bcl-2−/−感染Ad-LacZ或Ad-BIK的细胞。将细胞接种在96周的平板中，并使用MTS分析（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）进行细胞活力分析；n个= 3. (b条)BIK非磷酸化和磷酸化形式的Western-blot分析。(c（c）)DAPI—感染细胞的训练模式。感染48小时后对细胞进行染色，并在60倍放大镜下拍照。

BIK诱导Bcl-2缺失细胞的非凋亡细胞死亡

我们检测了BIK是否在Bcl-2型null细胞表现出与凋亡细胞死亡相关的常见生化特征。BIK的表达诱导两种细胞中caspase-8的显著激活Bcl-2型+/+和Bcl-2型−/−单元格(图2a). 相反，两者中均未检测到caspases-9或-3的激活Bcl-2型+/+和Bcl-2基因−/−Ad-BIK感染的细胞。同样，BIK的表达也不会导致细胞色素c在胞浆中的可检测积累。与此结果一致，线粒体细胞色素c水平没有显著变化(图2b，左侧面板）。使用针对细胞色素c的抗体进行的间接免疫荧光分析也显示了两种细胞类型中清晰的核周点状线粒体荧光(图2b，右侧面板）。与细胞色素-c的结果相反，线粒体凋亡诱导因子（AIF）显著缺失，同时表达BIK的细胞核积聚增加Bcl-2型−/−细胞与表达LacZ的细胞的比较(图2c). 在Bcl-2型+/+BIK或LacZ的表达并没有导致线粒体AIF的显著丢失。免疫荧光分析也显示AIF在大鼠脑组织的细胞核中有显著的积累，这与西方的脑区数据一致Bcl-2型−/−Ad-BIK感染的细胞Bcl-2型+/+单元格(图2c，右侧面板）。这些结果表明BIK诱导的细胞死亡Bcl-2型零MEF不符合caspases hyp9和hyp3的激活以及细胞色素c从线粒体动员到胞浆等特征，这些特征通常与细胞凋亡有关。然而，AIF在这些细胞中有显著的核蓄积。这些数据与BIK诱导非凋亡型细胞死亡的解释一致Bcl-2型在MEF中。

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BIK对凋亡标记物表达的影响。(一)半胱天冬酶的Western-blot分析。用识别胱天蛋白酶8、9和3的原酶和加工形式的抗体探测印迹。显示了72小时Ad-LacZ感染细胞和24、48和72小时Ad-BIK感染细胞的状态。β-肌动蛋白作为负荷对照。(b条)细胞色素c的线粒体和细胞质分布(c（c）)凋亡诱导因子（AIF）的线粒体和核分布。亚细胞组分的western blot分析和间接免疫荧光分析均显示。面板内(c（c）)，PCNA显示为核分数的控制。

zVAD-fmk对BIK诱导的细胞死亡的影响

已知BIK在人类黑色素瘤细胞中以非胱天蛋白酶依赖的方式诱导细胞死亡(奥普曼等人。, 2005). 结果显示于图2上述报告促使我们研究广谱半胱天冬酶抑制剂zVAD-fmk在BIK诱导的小鼠死亡中的作用Bcl-2型无MEF。治疗Bcl-2基因+/+Ad-BIK或Ad-LacZ感染zVAD-fmk的细胞可适度提高细胞活力(图3a). 令我们惊讶的是，我们观察到表达BIK的人的死亡呈剂量依赖性增加Bcl-2型−/−用10或25μM浓度的zVAD-fmk处理的细胞(图3b). DAPI染色Bcl-2型−/−经Ad-BIK感染和zVAD-fmk处理的细胞在细胞核内出现亮点，细胞核高度浓缩。Ad-LacZ感染和zVAD-fmk处理的细胞显示出完整的核形态(图3c). 这些结果表明，在没有BCL-2的情况下抑制caspases（通过zVAD-fmk治疗）会增强BIK诱导的MEF细胞死亡，而这种治疗会抑制BCL-2存在时的细胞死亡。

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zVAD-fmk对BIK诱导的细胞死亡的影响。的可行性Bcl-2型+/+(一)和Bcl-2型−/−(b条)在存在或不存在zVAD-fmk的情况下，感染Ad-LacZ或Ad-BIK的细胞；n个= 4. (c（c）)DAPI染色细胞表达LacZ或BIK的模式（±zVAD-fmk，10μM）。

此外，我们还检查了Bcl-2型−/−western blot和免疫荧光分析zVAD-fmk对线粒体死亡因子、细胞色素c和AIF的动员作用(补充图S2). 用zVAD-fmk处理的细胞显示出与未处理细胞相似的模式（如图2b和c)表明zVAD-fmk诱导的细胞死亡增强Bcl-2型−/−细胞可能不归因于线粒体细胞色素c的动员。然而，在zVAD-fmk的缺乏或存在下，线粒体AIF选择性动员到细胞核。

BIK诱导Bcl-2阴性细胞死亡的自噬特征

由于BIK诱导了一种非典型形式的细胞死亡，我们通过透射电子显微镜（EM）检查了表达BIK的MEF的超微结构(图4). 在Bcl-2型感染了Ad-BIK的空细胞，在大约三分之一的受检细胞中可以清楚地看到类似于自噬空泡的细胞溶质空泡(图4，下部面板，中间图像）。然而，当用zVAD-fmk处理表达BIK的细胞时，在超过一半的检测细胞中看到更广泛的胞浆液泡。相反，Bcl-2型+/+表达BIK的细胞，无论是否经过zVAD-fmk处理，都不容易检测到此类空泡。

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电子显微照片Bcl-2基因+/+和Bcl-2型−/−表达LacZ或BIK的细胞。通过扫描电镜分析感染Ad载体（±zVAD-fmk）的细胞薄片。下面板中的箭头指向细胞溶质空泡。

证实在Bcl-2型空细胞是自噬的结果，我们检测了自噬标记物LC3的细胞溶质再分布。细胞溶质蛋白LC3是酵母基因Atg8的哺乳动物同源物，该基因在自噬过程中被补充到自噬体膜(卡贝亚等人。2000年). 嵌合LC3-EGFP报告子广泛用于检测自噬。Bcl-2型精通和Bcl-2型用表达LC3-EGFP和BIK的质粒瞬时转染无效MEF细胞，并测定EGFP荧光的分布。在Bcl-2型大多数EGFP阳性细胞在整个细胞中都显示出扩散的荧光(图5a，上部面板）。相比之下，约四分之一的EGFP阳性Bcl-2型空细胞显示点状荧光(图5a，下部面板）。这个Bcl-2基因用BIK和LC3-GFP共同转染空白细胞，然后用zVAD-fmk处理，可以看到LC3蛋白的大点状颗粒。在大约25-30%的Bcl-2型−/−Ad-BIK感染细胞和z-VAD-fmk治疗后，约65-70%的细胞显示出这种荧光(图5c). 相反，在转染BIKΔBH3的细胞中，LC3的点状分布水平显著降低，表明BH3结构域可能至少部分导致非凋亡细胞死亡。我们还通过免疫荧光分析检测了内源性LC3的分布。与瞬时转染研究一致Bcl-2型在点状结构中观察到感染Ad-BIK的无效细胞、LC3特异性荧光(图5d，下部面板）。这些结果表明LC3可能与自噬体有关Bcl-2型−/−作为BIK表达的结果，用zVAD-fmk治疗可能会增强这种关联。

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BIK诱导细胞死亡的自噬特征。(一)LC3在转染BIK的细胞中的分布（±zVAD-fmk）。(b条)BIK BH3结构域在细胞死亡中的作用。用Ad-LacZ或Ad-BIK或Ad-BIKΔBH3（±zVAD-fmk）感染细胞，48h后测定细胞活力；n个= 3. (c）细胞定量显示LC3点状分布；n个= 3. 每个样本至少随机检查150个细胞。(d日)LC3分布的免疫荧光分析。(e（电子）)Beclin-1在BIK表达中的表达Bcl-2型−/−用zVAD-fmk处理的细胞。

Beclin-1表达水平的增加通常与自噬有关(莱文和克林斯基，2004年). 我们检测了BIK对Beclin-1表达的影响(图5e).Bcl-2型用Ad-LacZ或Ad-BIK感染空白细胞，并在感染48或72小时后测定Beclin-1的水平。与感染Ad-LacZ的细胞相比，感染Ad-BIK的细胞中Beclin-1的表达水平明显增加(图5e，左侧面板）。同样，用zVAD-fmk处理的BIK表达细胞中Beclin-1水平增加(图5e，右侧面板）。因此，这些结果进一步支持了以下结论：Bcl-2型无效的MEFs可能诱导自噬，并且zVAD-fmk可能增强这种作用。

自噬抑制剂对BIK诱导的细胞死亡的影响

由于自噬和自噬死亡受PI3激酶调节(津本和清水，2005年)通常使用3-甲基腺嘌呤（3-MA）和沃特曼（WM）等抑制剂来抑制这些激酶。我们测定了3-MA和WM对BIK诱导的死亡的影响Bcl-2型−/−MEF公司。BIK的表达是通过转染pcDNA-BIK或感染Ad-BIK介导的。测定了在存在或不存在3-MA或WM的情况下，模拟处理或用zVAD-fmk处理的BIK表达细胞的活性。3-MA治疗(图6a)或WM(图6b)通过或不通过zVAD-fmk治疗提高BIK表达细胞的生存能力。zVAD-fmk对细胞的抑制程度更大。我们的结果表明BIK诱导的自噬样死亡Bcl-2基因−/−细胞受到PI3激酶的调节。

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PI3激酶抑制剂对BIK诱导的细胞死亡的影响。(一)3-甲基腺嘌呤（3-MA）的作用。(b条)沃特曼的影响。Bcl-2型−/−细胞要么转染pcDNA3-BIK或空载体（左面板），要么感染Ad-LacZ或Ad-BIK（右面板）。用1mM 3-甲基腺嘌呤或0.2μml处理这些细胞（±zVAD-fmk）−1Wortmannin及其活性测定；n个= 4.

Atg5和Beclin-1在BIK介导细胞中的作用

死亡除了激酶抑制剂外，我们还测定了敲除两种自噬效应器Atg5和Beclin-1对BIK诱导的细胞死亡的影响。MEF细胞转染(Bcl-2型−/−)与转染对照siRNA的细胞相比，使用抗Atg5或Beclin-1的siRNA可显著降低相应的蛋白质(图7a). 转染细胞感染Ad-LacZ或Ad-BIK。感染的细胞要么进行模拟治疗，要么用zVAD-fmk治疗，如图6感染48小时后测定细胞活力(图7b). 敲除Atg5和Beclin-1提高了用zVAD-fmk处理的表达BIK的细胞（20-30%）的生存能力（与最左边的三个条相比图7b). 在敲除Atg5和Beclin-1之间，敲除Atg 5导致生存能力增强。在缺乏zVAD-fmk的情况下，表达BIK的细胞中也观察到生存能力的适度增强。因此，敲除研究的结果为我们的结论提供了额外的支持，即BIK在BCL-2无效细胞中诱导具有自噬特征的细胞死亡。

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Atg5和Beclin-1对BIK诱导的细胞死亡的影响。(一)siRNA-介导的Atg5和Beclin-1耗竭的Western blot分析。Bcl-2型−/−用siRNAs转染细胞，通过western-blot分析测定Atg5和Beclin-1的表达水平。(b条). siRNA-转染细胞的细胞活力。去除Atg5或Beclin-1的细胞感染Ad-LacZ或Ad-BIK（±zVAD-fmk），测定细胞活力；n个=3。

讨论

这里的结果表明，BH3-only蛋白BIK诱导一种细胞死亡，其特征归因于自噬和自噬细胞死亡Bcl-2型−/−MEF细胞。zVAD-fmk治疗会加剧这种类型的细胞死亡。BIK诱导的细胞死亡（±zVAD-fmk）被3-MA和WM（自噬的一般抑制剂）抑制(Tsujimoto和Shimizu，2005年). 以前的报告表明，某些其他BH3-唯一蛋白与自噬细胞死亡有关。神经酰胺治疗胶质瘤细胞(大岛等人。, 2004)或三氧化二砷(Kanzawa县等人。, 2005)表达BH3-only蛋白BNIP3的水平升高，并经历非凋亡细胞死亡，具有某些自噬特征（LC3和细胞溶质空泡点状分布）。据报道，另一种BH3-only蛋白HSpin1的异位表达可诱导具有自噬（细胞溶质空泡）特征的caspase非依赖性细胞死亡(鹿岛鹿角等人。, 2003).

尽管自噬被认为是抵抗细胞死亡的防御机制(莱文和克林斯基，2004年)，有确凿证据表明它最终导致细胞死亡(清水等人。, 2004;于等人。, 2004). BIK诱导的细胞死亡似乎符合鉴别自噬死亡的关键标准(津本和清水，2005年). 这些标准包括死亡细胞中存在细胞质空泡、LC3（Atg8）的点状分布、对已知自噬效应物的依赖性以及PI3激酶抑制剂对细胞死亡的抑制。BIK诱导非凋亡细胞加速死亡的机制Bcl-2型−/−细胞尚待完全阐明。我们观察到Beclin-1上调，这是自噬和自噬死亡的效应器。据报道，各种诱导自噬死亡的细胞毒性刺激通过未知机制增强自噬基因Atg5和Beclin-1的表达。然而，人们普遍认为这些刺激可能激活各种信号通路。据报道，BIK的表达可引起内质网（ER）中钙的动员(马泰等人。, 2005). 胞浆Ca升高2+据报道可诱导BCL-2抑制的自噬(霍耶·汉森等人。, 2007). BIK在非凋亡细胞死亡过程中激活钙依赖性信号通路的可能性仍有待探索。

我们观察到BIK介导的细胞死亡增强，在Bcl-2型空单元格。此前的一份报告显示Bcl-2型在HL-60细胞中引发自噬样死亡(赛基等人。2000年). BCL-2和vBCL-2的异位表达也抑制了Beclin-1诱导的自噬性死亡(帕廷格等人。, 2005). 因此，缺乏Bcl-2型在KO中，MEF可能使细胞对BIK引起的Beclin-1依赖性自噬死亡敏感。虽然都是BIK(博伊德等人。, 1995)和Beclin-1(伊达尔-奥伯施泰因等人。, 2007)BIK是BH3-唯一的蛋白质，可能作为上游启动刺激物发挥作用。我们的结果显示于图5b和c，表明BIK的BH3结构域可能至少部分地促进LC3的点状分布和增强细胞死亡Bcl-2型−/−用z-VAD-fmk处理的细胞。由于BIK除了BH3结构域外，还包含其他决定因素，这些决定因素对其整体细胞死亡活性有贡献(Elangovan和Chinnadurai，1997年)BIK的其他区域可能与BH3结构域合作诱导具有自噬特征的细胞死亡。

我们还观察到，在经历BIK介导的非凋亡性死亡的细胞中，AIF的动员增强。目前尚不清楚AIF的动员是否与BIK介导的细胞死亡直接相关或是死亡的结果。在坏死型细胞死亡的细胞中观察到AIF从线粒体到核的重新分布(戈尔斯坦和克罗默，2007年). 以前的一项研究报道了BIK诱导人黑色素瘤细胞caspase-independent细胞死亡过程中，在线粒体未释放细胞色素c的情况下，染色质凝集(奥普曼等人。, 2005). 根据我们目前的结果，研究BIK在黑色素瘤细胞中诱导的非凋亡细胞死亡是否具有自噬特征将很有意义。

zVAD-fmk加速了BIK诱导的细胞死亡。zVAD-fmk对L929小鼠成纤维细胞的治疗导致具有自噬特征的细胞死亡，自噬依赖于caspase-8和自噬基因Atg6和Atg7(于等人。, 2004). LPS和zVAD-fmk处理的巨噬细胞发生自噬样细胞死亡，3-MA和WM以及Atg6的下调可抑制自噬类细胞死亡(徐等人。, 2006). zVAD-fmk在触发自噬细胞死亡中的作用模式仍有待阐明。由于zVAD-fmk是caspase-8的强抑制剂，其作用方式可能是通过抑制。我们观察到，在存在zVAD-fmk的情况下，BIK表达细胞中caspase-8激活，BIK诱导的细胞死亡增强。这些结果表明，zVAD-fmk对caspase-8的抑制可能有助于BIK导致自噬样细胞死亡。该结果与已发布的报告一致(于等人。, 2006). 我们观察到siRNA-介导的caspase-8耗竭(补充图S1)增强BIK和zVAD-fmk诱导的细胞死亡。这些结果也支持caspase-8和zVAD-fmk之间的联系。

我们的研究结果建议对某些人类癌症采取抗癌策略。一般认为自行车由于它在某些癌症中被删除，因此具有抑癌作用(Sturm公司等人。, 2006)在许多不同的人类癌症中其表达受到抑制(戴等人。, 2006). 矛盾的是，自行车表达也与非小细胞肺癌（NSCLC）的不良预后有关(卢等人。, 2006). 在与高危非小细胞肺癌相关的8个预后标志物中，有3个(案例8,Bcl公司-2和自行车)似乎与我们的结果有关。提升的表达自行车在散发性乳腺癌中也观察到(加西亚等人。, 2005). 在这里，我们已经表明zVAD-fmk介导的自噬细胞死亡敏化可能与这些基因有关。可以设想，模拟zVAD-fmk作用的小分子可能有助于高危非小细胞肺癌的治疗。操纵自噬过程被认为是癌症的一种治疗方式(近藤等人。, 2005). 抗癌药，三氧化二砷(Kanzawa县等人。, 2005)和神经酰胺(大岛等人。, 2004)已证明通过上调恶性胶质瘤细胞中BNIP3的表达来介导细胞死亡。研究这种药物来对抗过度表达的癌症是很有意思的自行车.

材料和方法

质粒、重组体、细胞和试剂

质粒EGFP-LC3来自吉森T。已描述了Ad-BIK和Ad-LacZ(塞奥佐拉基斯等人。2002年). 不朽的Bcl-2基因+/+和Bcl-2型−/−MEF是Stanley Korsmeyer博士的礼物(巴斯克语等人。, 2004). 细胞在补充有10%胎牛血清的DMEM中培养。抗细胞色素c、AIF、PCNA、MAPLC3、β-actin、Atg5和BIK的抗体购自SantaCruz Biotechnology（Santa Cruz，CA，USA）。抗Beclin-1和细胞色素-c的小鼠单克隆抗体购自BD Biosciences（美国加利福尼亚州圣何塞）。抗caspases-8、-9和-3的抗体来自细胞信号技术（美国马萨诸塞州丹弗斯）。针对caspase-8、Beclin-1和Atg5的siRNA从Dharmacon（美国伊利诺伊州芝加哥）的智能池siRNA试剂处购买。WM和3-MA购自Calbiochem（美国加利福尼亚州圣地亚哥）和Sigma（美国密苏里州圣路易斯）。

蛋白质印迹、免疫荧光和EM分析

收集细胞并在添加蛋白酶抑制剂混合物（Sigma）的RIPA缓冲液中进行裂解。亚细胞分离是使用标准协议进行的。总蛋白质含量使用双钦酸（BCA）蛋白质估算试剂盒进行估算（皮尔斯生物技术公司，伊利诺伊州罗克福德，美国）。通过十二烷基硫酸钠-聚吖啶酰胺凝胶电泳分离细胞裂解物，并通过western blotting进行分析，并使用ECL试剂（美国印第安纳波利斯州罗氏市）显示条带。为了进行免疫荧光分析，将细胞接种到盖玻片上，并按照所述进行检查(拉希米等人。, 2005).

补充材料

补充

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致谢

这项工作得到了国家癌症研究所的研究拨款CA-73803、CA-116262和CA-33616的支持。MEF细胞由已故的Stanley Korsmeyer提供。

工具书类

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