浸润肿瘤的肿瘤抗原特异性CD8 T细胞表达高水平的PD-1，功能受损

摘要

介绍

程序性死亡1受体（PD-1，也称为CD279）是一种免疫抑制受体，在T细胞激活后由慢性刺激的CD4和CD8 T细胞表达。^1–三PD-1基因敲除小鼠表现出多种自身免疫性疾病，这取决于小鼠的菌株，^4,5表明这种抑制性受体在淋巴细胞稳态中起着关键作用。⁶此外，据报道，PD-1在病毒特异性CD8 T细胞上的高表达与慢性HIV患者病毒血症的增加有关^7,8和丙型肝炎病毒感染⁹在小鼠慢性感染模型中。¹⁰这些PD-1⁺CD8 T细胞增殖和产生效应细胞因子的能力降低，因此术语“功能衰竭”归因于表达PD-1的T细胞。小鼠研究表明，阻断PD-1与其配体的相互作用可以通过恢复“衰竭”T细胞中的效应器功能来逆转感染过程。¹⁰这些临床前研究表明，病毒特异性CD8 T细胞上PD-1的表达可以抑制控制病毒感染所需的免疫反应的有效性，因此，他们鼓励在慢性病毒感染患者中进行抗PD-1单克隆抗体的临床试验。⁶

抗原特异性T细胞上PD-1的诱导和表达被认为可以调节对外来和自身抗原的免疫反应。^三,6尽管存在肿瘤抗原特异性T细胞浸润到肿瘤基质中，但许多肿瘤仍在继续生长。这种肿瘤特异性T细胞功能障碍的潜在机制尚不清楚。据推测，肿瘤微环境可能导致抗肿瘤免疫反应减弱。^11,12PD-1的配体之一是PDL-1（也称为B7-H1），它由非淋巴组织和活化的抗原呈递细胞（APC）表达。¹³PD-1与PDL-1的结合抑制TCR介导的增殖和细胞因子的产生。¹³有趣的是，PDL-1在包括黑色素瘤在内的多种人类肿瘤中的表达已有报道。¹⁴除肿瘤外，肿瘤相关的髓样树突状细胞也可以上调PDL-1，其阻断可以增强T细胞在体外的活化。¹⁵尽管肿瘤上PDL-1的表达与许多人类肿瘤的不良预后相关，^6,16对于PD-1在肿瘤浸润性T淋巴细胞（TIL）上的模式表达及其表型和功能特征知之甚少。

为了解决这个问题，我们检测了转移性黑色素瘤病灶中TIL上PD-1的表达，并将其表型和功能特征与正常组织和外周血中的T细胞进行了对比。我们发现，与同一患者和健康献血者的正常组织和外周血中的T细胞相比，CD4和CD8 TIL上PD-1的表达频率和表达水平显著升高。与同一患者外周血中的MART特异性T细胞相比，绝大多数肿瘤分化抗原MART-1/Melan-A特异性CD8 T细胞（以下简称MART-1）在肿瘤中高水平表达PD-1。产品开发-1⁺TIL也表达CTLA-4和HLA-DR，缺乏CD127的表达，CD127是“衰竭”T细胞的表型特征。此外，PD-1⁺与PD-1相比，TIL的效应器功能受损⁻同一患者的TIL和外周血T淋巴细胞（PBL）。我们的研究结果表明，肿瘤微环境可能在肿瘤反应性T细胞PD-1表达的诱导和维持中发挥作用，并且TIL上PD-1的表达会损害人类的抗肿瘤免疫反应。

方法

结果

CD4和CD8 T细胞浸润肿瘤后PD-1的表达

虽然黑色素瘤病变通常含有肿瘤反应性T细胞，当在高剂量IL-2中培养时具有增殖能力，并在过继细胞移植时产生客观的临床反应，^19,20尽管存在肿瘤反应性T细胞，肿瘤还是可以生长。²¹为了阐明肿瘤内T细胞功能障碍的潜在机制，我们决定评估抑制性受体PD-1的表达，以及正常组织和外周血中TIL与T细胞的表型和功能对比。直接在体外分析酶消化肿瘤的单细胞悬浮液。如所示图1A、 PD-1在浸润转移性黑色素瘤病灶的CD4和CD8 T细胞中均能检测到表达。PD-1的表达频率在患者（n=28）和T细胞亚群之间存在差异；CD4 T细胞的表达频率为9.8%至71.8%，平均38.0%，CD8 T细胞的平均表达频率为12.9%至91.2%，平均53.2%(图1B） ●●●●。有趣的是，PD-1的频率⁺CD8中的细胞明显高于CD4 TIL(P（P）<.001，n=28，图1B） ●●●●。相反，CD4和CD8 TIL之间PD-1表达水平（MFI）没有显著差异(P（P）<0.07，n=28；数据未显示）。

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图1

CD4和CD8 T细胞浸润肿瘤后PD-1的表达。将转移性黑色素瘤（Pt）患者的冷冻肿瘤消化液解冻，并立即用CD3、CD8和PD-1单克隆抗体染色。（A） 点图在CD3上选通⁺淋巴细胞。根据同型对照单克隆抗体设置象限。百分比表示PD-1的分数⁺CD8 T细胞中的T细胞（右上角）或CD4 T细胞（左上角）。CD3（CD3）⁺CD8（CD8）⁻在整个研究中，T细胞被视为CD4 T细胞。（B） PD-1的百分比⁺CD4 T细胞占CD4 T淋巴细胞总数和PD-1⁺显示了28例转移性黑色素瘤患者肿瘤消化液中CD8 T细胞占CD8 T总细胞数的比例。P（P）使用成对的t吨测试。

肿瘤中MART-1特异性CD8 T细胞PD-1的表达

接下来，我们使用MART-1四聚体检测了肿瘤抗原特异性CD8 T细胞对黑色素瘤共享抗原MART-1的PD-1表达。我们发现PD-1由绝大多数MART-1四聚体表达⁺肿瘤中的CD8 T细胞(图2). 3名患者的典型荧光激活细胞分选（FACS）图和6名患者的总结如所示图2分别为A和B。PD-1在MART-1四聚体上的表达显著增高⁺与MART-1四聚体阴性（范围：29%-92.7%，平均：51.6%）相比（范围：78%-95.5%，平均：89.2%），CD8 T细胞出现在相同患者的转移性黑色素瘤病灶中(P（P）= .008;图2B） ●●●●。PD-1在MART-1四聚体上的高表达⁺CD8 T细胞增加了在肿瘤和/或肿瘤微环境中的抗原呈递细胞上识别肿瘤抗原后，在肿瘤反应性T细胞上诱导PD-1表达的可能性。

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图2

肿瘤抗原特异性CD8 T细胞在肿瘤中表达PD-1。将患者的肿瘤消化液解冻，并立即用抗CD3、抗CD8、抗PD-1 mAb和MART-1四聚体染色。（A） 显示了三个具有代表性的患者。点图在CD3上选通⁺CD8（CD8）⁺淋巴细胞。数字代表CD3的百分比⁺CD8（CD8）⁺每个象限的T细胞，百分比值表示PD-1的分数⁺MART-1四聚体中的T细胞⁺CD8 T细胞（右上）和MART-1四聚体⁻CD8 T细胞（左下）。（B） PD-1的总频率⁺MART-1四聚体中的T细胞⁻（3月1日⁻)和MART-1四聚体⁺（3月1日⁺)6例患者显示肿瘤浸润性CD8 T细胞。P（P）使用成对的t吨测试。

与外周血T细胞相比，PD-1主要由肿瘤浸润性T细胞表达

到目前为止，我们发现有很大一部分TIL表达PD-1。随后，我们比较了同一患者循环外周血T细胞与TIL上PD-1表达的比例和水平。与TIL相比，循环外周血T细胞的PD-1表达水平最低，与健康献血者外周血T细胞的表达水平相当(图3A） ●●●●。PD-1的频率⁺CD8 T细胞显著(P（P）<.001）在同一患者中，肿瘤内（范围：12.4%-71.6%，平均47.4%，n=14）高于外周血（范围：0.5%-32.2%，平均9.5%，n=14%；图3B） 或健康献血者（范围：3.0%-19.5%，平均值9.1%，n=7；数据未显示）。同样，PD-1的频率⁺CD4 T细胞显著(P（P）<.001）同一患者肿瘤内（范围：23.0%～56.2%，平均40.5%，n=14）高于外周血（范围：0.4%～23.2%，平均6.0%，n=14%；图3C） 或健康献血者（范围：3.8%-13.1%，平均值：6.7%，n=7；数据未显示）。此外，PD-1在MART-1四聚体上的表达频率和水平都较高⁺转移性黑色素瘤肿瘤中的CD8 T细胞比循环MART-1四聚体中的CD8 T细胞⁺外周血CD8 T细胞(图3D） 。虽然循环MART-1四聚体的比例相对较高⁺CD8 T细胞为PD-1⁺与其他2例患者（pt4，9%和pt7，3%）相比，1例患者（pt 6，76%）在MART-1四聚体上PD-1的表达频率（92%）和表达水平较高⁺该患者肿瘤中的CD8 T（pt6）与其他2例患者（pt4，87%和pt7，89%；图3D） 。肿瘤中MART-1特异性CD8 T细胞与外周血中PD-1的差异表达表明肿瘤微环境介导PD-1对浸润肿瘤的T细胞的诱导。

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图3

与外周血T细胞相比，PD-1主要由肿瘤浸润性T细胞表达。将来自转移性黑色素瘤（Pt）患者和来自相同患者和健康供体的PBL患者的冷冻肿瘤消化液解冻，并立即用CD3、CD8和PD-1单克隆抗体染色。（A） CD3上的点图选通⁺淋巴细胞。每个象限的百分比表示PD-1的分数⁺CD8 T细胞中的T细胞（右上象限）或CD4 T细胞中（左上象限”）。这些是14名患者和7名健康献血者的代表。（B） PD-1的百分比⁺CD8 T细胞占CD8 T淋巴细胞总数的百分比和（C）PD-1的百分比⁺在相同患者的PBL和肿瘤消化液中，对CD4 T细胞总数中的CD4 T淋巴细胞进行定量（n=14）。P（P）使用成对的t吨测试。（D） 在3例外周血中检测到循环MART-1四聚体CD8 T细胞的患者中，我们比较了MART-1四聚体上PD-1的表达⁺肿瘤消化液样本中的CD8 T细胞与上述患者外周血中的CD8T细胞比较图2.

与正常组织相比，浸润到肿瘤中的T细胞PD-1表达显著增高

我们询问PD-1的表达是浸润到肿瘤中的T细胞所特有的，还是浸润到任何组织（包括无肿瘤的正常组织）的T细胞的固有特征。为了解决这个问题，我们比较了同一患者肿瘤切除后浸润到肿瘤转移和正常组织（肝、肺和脾）的T细胞上PD-1的表达。我们发现不仅PD-1的频率⁺与正常组织中的T细胞浸润相比，TIL上的T细胞更高，但在相同患者中其表达水平也更高(图4). 在所检查的所有3个器官（肝，n=3；肺，n=6；脾，n=2）中检测到TIL上PD-1与正常组织T细胞浸润的差异表达。此外，在CD4和CD8 T细胞亚群中观察到PD-1的差异表达；PD-1的频率⁺CD8 T细胞显著(P（P）=0.004）在相同患者中，CD8 TIL（范围：12.4%-84.0%，平均：51.4%）高于正常组织浸润（范围：9.0%-55.7%，平均：23.2%）（n=11；图4B） ●●●●。同样，PD-1的频率⁺CD4 T细胞显著(P（P）<.001）CD4 TIL（范围：24.3%～66.1%，平均值：45.3%）高于相同患者（n=11；图4C） ●●●●。这些数据共同表明，肿瘤微环境增强了TIL上PD-1的表达，T细胞上PD-1表达的组织层次在肿瘤中的表达高于正常组织，在循环外周血T细胞中表达最少。

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图4

PD-1的频率⁺肿瘤中的T细胞明显高于邻近正常组织。将从同一患者分离的冷冻保存的肿瘤消化液（肿瘤）和正常组织消化液（正常）解冻，并立即用CD3、CD8和PD-1单克隆抗体染色。（A） 点图在CD3上选通⁺淋巴细胞。基于同种型对照mAb设置象限。数字表示每个象限中T细胞的百分比，百分比值表示PD-1的分数⁺CD8 T细胞中的T细胞（右上象限）和CD4 T细胞（左上象限）。PD-1的百分比⁺CD8 T细胞占CD8 T淋巴细胞总数（B）和PD-1⁺显示了11名转移性黑色素瘤患者肿瘤和正常组织中CD4 T细胞占CD4 T淋巴细胞总数（C）的比例。P（P）使用成对的t吨测试。

CD8和CD4 T细胞浸润肿瘤、正常组织和外周血的表型比较

浸润肿瘤的CD8 T细胞与正常组织和循环血的CD8细胞表型的比较表明，与T细胞衰竭相关的标志物总体上调(图5A） ●●●●。与主要缺乏CTLA-4表达的正常组织和外周血中的CD8 T细胞相比，大部分CD8 TIL为CTLA-4⁺，主要由PD-1表达⁺CD8倾斜。尽管CTLA-4上调，PD-1的绝大多数⁺CD8 T细胞缺乏CD25表达，主要是CD27⁺有趣的是，PD-1⁺CD8 TIL主要缺乏IL-7受体α链（CD127）的表达，这是一种与体内慢性病毒感染中T细胞不能增殖和产生效应细胞因子有关的表型^22–24以及人类FOXP3⁺CD4 T调节细胞（T_规则).^25,26除了CTLA-4、PD-1的共表达外⁺CD8 TIL也表达高水平的HLA-DR，这是T细胞活化的标志。虽然HLA-DR仅在极少数外周血CD8 T细胞中检测到表达，但大量正常组织CD8 T淋巴细胞浸润也表达此标记。然而，HLA-DR的表达与正常组织中CD8 T细胞上PD-1的表达无关，就像在肿瘤中一样(图5A） ●●●●。与CTLA-4表达类似，Ki-67是一种由分裂细胞表达的蛋白质，也由PD-1的一部分独家表达⁺CD8 T细胞存在于肿瘤中，而非正常组织或外周血中的T细胞。总之，这些结果揭示了PD-1之间的显著表型差异⁺正常组织和外周血中的CD8 TIL和T细胞具有衰竭表型的特征，进一步表明其效应器功能可能受损。

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图5

同一患者CD8和CD4 T细胞浸润肿瘤、正常组织和外周血的表型比较。将转移至肺（肿瘤）、正常肺组织（正常）和同一患者外周血淋巴细胞（PBL）的肿瘤消化液进行冷冻保存，然后立即用CD3、CD8、PD-1单克隆抗体和“流式细胞术分析”中所述的适当标记物进行染色。对于CD8 T细胞，在CD3上对点图进行门控⁺CD8（CD8）⁺CD3上的淋巴细胞（A）和CD4 T细胞斑点图被选通⁺CD8（CD8）⁻淋巴细胞（B）。这些数字表示每个象限中CD8或CD4 T细胞的百分比。这是从转移性黑色素瘤患者和从肺部（n=6）、肝脏（n=1）和脾脏（n=1）分离的正常组织中进行的8项独立实验的代表性结果。

浸润不同组织隔室的CD4 T细胞的表型比较与CD8 T细胞的特征相似(图5B） ●●●●。产品开发-1⁺肿瘤中的CD4 T细胞通常缺乏CD25表达，而外周血和正常组织中的CD4T细胞表达CD25而不表达PD-1。与PD-1类似⁺CD8 TIL，PD-1的大多数⁺CD4 TIL也表达HLA-DR和CTLA-4。与CD8 TIL一致，Ki-67的表达主要在PD-1中检测到⁺CD4 TIL。与PD-1相比⁺CD8 TIL，主要是CD127⁻和CD27⁺，PD-1⁺CD4 TIL在一些患者中的这两个标记物的表达是异质的。

产品开发-1⁺TIL显示效应器功能受损

病毒特异性人CD8 T细胞上PD-1的表达与体外效应器功能降低相关。^7–9为了确定TIL上PD-1的表达是否会损害其效应器功能，我们用强刺激物佛波酯-肉豆蔻酸酯（PMA）和离子霉素（I）刺激未培养的新鲜解冻TIL，并在离体单细胞水平上用细胞内染色评估IL-2和IFN-γ的产生。如所示图6A、 PMA/I激活导致大量PD-1产生IL-2和IFN-γ⁻TIL（IFN-γ，37.7%；IL－2，17%）。相反，不仅PD-1的一小部分⁺T细胞产生这些细胞因子（IFN-γ，12.6%；IL-2，1.6%），但根据平均荧光强度（MFI；PD-1，440⁺与PD-1的1878相比⁻T细胞亚群；图6A） ●●●●。在多个患者的肿瘤病灶中检测到类似结果（n=6）；百分比(图6B、，P（P）=0.01）和细胞因子产生量（MFI；图6C、，P（P）=0.04）在PD-1中减少⁺CD8 T细胞与PD-1的比较⁻CD8 T细胞。这些结果表明，产生IFN-γ的能力与CD8 TIL表达PD-1呈负相关。我们还发现PD-1中CD8 TIL产生IL-2的比例降低⁺与PD-1相比⁻3名患者的亚组（1.6%对17%；1%对8.3%；3.7%对9.7%；PD-1⁺与PD-1相比⁻CD8 TIL，分别，图6D） 。然而，我们在其他3名患者中没有发现显著差异。值得注意的是，PD-1中产生IL-2的CD8 TIL的频率过低⁻这些晚期患者的亚群（≤4%）(图6D） ，提供了一个似是而非的解释，即在这些患者的PD-1亚群之间没有发现IL-2产生的显著差异。

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图6

肿瘤浸润性T细胞上PD-1的表达与效应器功能受损相关。对转移性黑色素瘤患者的肿瘤消化液和外周血样本进行解冻，并在莫能菌素的存在下立即用PMA/I刺激6至8小时。随后用抗CD3、抗CD8和抗PD-1单克隆抗体以及抗IL-2和抗IFN-γ单克隆抗体对细胞进行染色。（A） CD3上的点图被选通⁺T细胞。数字表示每个象限中T细胞的百分比，括号中的值表示每个象限的MFI。（B） CD3的百分比⁺CD8（CD8）⁺IFN-γ的T细胞⁺描述了PD-1⁺和PD-1⁻CD8 TIL。（C） IFN-γ的MFI⁺CD3（CD3）⁺CD8（CD8）⁺PD-1的T细胞图⁺和PD-1⁻CD8 TIL。（D） CD3的百分比⁺CD8（CD8）⁺IL-2型T细胞⁺描述了PD-1⁺和PD-1⁻6名患者的CD8 TIL。P（P）值是根据配对的t吨测试。（E） MART-1四聚体产生IFN-γ⁺肿瘤中的CD8 T细胞消化与来自同一患者的外周血（PBL）的对比。百分比值代表MART-1四聚体的分数⁺产生IFN-γ的CD8 T细胞。

除了与CD8 TIL上PD-1表达呈负相关的IFN-γ产生差异外，我们还能够直接比较肿瘤Ag特异性MART-1四聚体的效应功能⁺肿瘤中的CD8 T细胞与同一患者外周血中的CD8T细胞相同。我们发现MART-1四聚体的较小部分⁺与同一患者外周血循环中的CD8 T细胞（32.4%）相比，转移性黑色素瘤病灶中的CD8T细胞（12.5%）在PMA/I刺激下产生IFN-γ(图6E） ●●●●。MART-1四聚体产生IFN-γ的能力降低⁺与MART-1四聚体上PD-1表达细胞的低百分比相比，CD8 TIL与PD-1高百分比表达细胞（86%）相关⁺外周血中的CD8 T细胞（16%；数据未显示）。由于循环MART-1四聚体患者数量稀少，对其他患者的评估受到限制⁺他们外周血中的CD8 T。循环肿瘤抗原特异性MART-1四聚体上PD-1的高功能性和低表达⁺外周血CD8 T细胞与肿瘤中CD8 T淋巴细胞的比较强烈表明肿瘤浸润的MART-1四聚体诱导PD-1表达⁺CD8 T细胞破坏了这些细胞产生IFN-γ的能力，即使是在对诸如PMA/I这样的强大刺激作出反应时，也会绕过T细胞受体（TCR）的刺激。

讨论

在本研究中，我们报告了与同一患者和健康献血者的正常组织和外周血中的T细胞相比，浸润到肿瘤中的大部分T细胞上PD-1的高水平表达。这一新发现揭示了T细胞PD-1表达的组织层次（肿瘤>正常组织>外周血），表明肿瘤微环境在诱导和维持TIL PD-1表达中起着关键作用。我们还证明，TIL上PD-1的表达与衰竭表型和效应器功能受损相关。这些结果表明，尽管存在肿瘤反应性T细胞浸润到肿瘤基质中，但TIL上PD-1的诱导破坏了其建立有效抗肿瘤免疫反应的能力，并为肿瘤生长提供了合理的解释。然而，我们无法评估PD-1频率之间是否存在任何相关性⁺肿瘤中的T细胞与患者的临床结局，因为患者在肿瘤切除后接受了各种治疗。

虽然大部分TIL表达PD-1，但PD-1的表达水平和百分比⁺T细胞在患者中是可变的。导致TIL上PD-1表达的机制和因素尚不清楚。因为我们的发现也反映了较高比例的MART-1四聚体⁺表达PD-1的CD8 T细胞与其他CD8 TIL相比，肿瘤内的Ag可能导致TIL上PD-1的表达。因此，肿瘤内肿瘤Ag特异性T细胞的频率和识别可以决定这种抑制性受体在T细胞上的表达频率和水平。因为T细胞上PD-1的表达水平可能调节T细胞的激活阈值及其细胞因子的产生，^三TIL的功能衰竭程度在患者中也可能不同，并取决于PD-1的表达水平。

尽管非小细胞肺癌的免疫组化分析²⁷和肾细胞癌²⁸已经检测到PD-1在单核免疫细胞上的表达，我们的研究是首次证明PD-1在转移性黑色素瘤病变的TIL上的表达。此外，我们报告了不同组织隔室中T细胞的表型和功能的显著差异，这是以前没有报道过的。

CD8 TIL与正常组织和循环血液中的表型比较表明，通常与T细胞衰竭相关的标记物总体上调。另一种抑制性受体CTLA-4的选择性高表达，⁶PD-1上⁺CD8 TIL而不是PD-1⁻CD8 TIL、正常组织浸润和PBL提示肿瘤及其微环境可能介导这些抑制性受体对T细胞的诱导。与CTLA-4类似，PD-1也选择性表达Ki-67⁺CD8 TIL，提示T细胞激活导致肿瘤内细胞分裂可能是PD-1上调TIL的先决条件。或者，数据也可能表明PD-1的一部分⁺尽管PD-1的表达通常与不能增殖有关，但TIL能够进行细胞分裂。^22,29虽然HLA-DR在正常组织中由CD8 T细胞表达，但这些细胞不像TIL那样高水平表达PD-1，这表明T细胞激活和HLA-DR上调不一定导致PD-1表达。在抑制性微环境下，如肿瘤中，T细胞激活可能会诱导T细胞上PD-1的表达。

我们以前曾报道过IL-2在体外激活过程中导致CD8 T细胞上CD27的下调。³⁰这种细胞因子也可以上调自身受体CD25的表达。因为PD-1⁺CD8 TIL通常表达CD27，但缺乏CD25表达，这表明这些细胞可能在微环境中被激活，而微环境可能没有提供足够的IL-2来上调CD25和下调CD27表达。事实上，即使在PD-1中，IL-2产生TIL的频率也很低⁻PMA/I刺激后的子集(图6D） 间接地支持了这一假设。

我们的研究还表明，与PD-1相比⁻CD8 TIL和PBL，PD-1的绝大多数⁺CD8 TIL缺乏CD127表达。虽然T细胞激活可以在体外下调效应T细胞上的CD127，^31,32CD127的低表达与体内记忆T细胞分化受损有关。^22–24,33除了体内慢性刺激病毒特异性CD8 T细胞外，^22,23,34,35人类FOXP3⁺CD4 T_规则^25,26也表达低水平的CD127。虽然其在CD4 T中的功能意义尚不明确_规则据报道，抗原特异性CD8 T细胞上CD127的低表达与T细胞在慢性病毒感染环境中不能增殖和产生效应细胞因子有关。^22–24CD127在PD-1上的差异表达⁺与PD-1相比⁻TIL与PD-1中IFN-γ产生受损间接相关⁺CD8倾斜(图6). 目前尚不清楚CD127的低表达是否会导致T细胞效应器损伤，或者它是否只是作为一种表型标记物来在体内鉴定这些细胞。³³

尽管PD-1⁺TIL与CD4 T具有相似的表型标记_规则在肿瘤中，如CTLA-4的高表达和CD127的缺乏，有明显的表型差异，可以清楚地区分CD4 T_规则来自PD-1⁺T细胞。与CD4 T不同_规则，PD-1⁺CD8 TIL主要缺乏CD25(图5A） 和FOXP3表达（数据未显示），这是一种与正常组织CD8 T细胞浸润和外周血CD8 T淋巴细胞共有的表型。这与我们最近的研究一致，该研究发现FOXP3在转移性黑色素瘤病变中主要由CD4而非CD8 TIL表达。¹⁸

据报道，PD-1连接可以通过TCR信号中间产物如CD3ζ、ZAP70和PKCθ的去磷酸化来抑制抗原受体信号³⁶抑制PI3K和Akt的激活。⁶这些发现解释了表达PD-1的病毒特异性CD8 T细胞在体外对Ag再刺激反应时无法产生效应细胞因子。^7,8我们的研究表明PD-1⁺TIL对PMA/离子霉素（PMA/I）的反应表现为细胞因子生成减少，PMA/I是一种有效的T细胞刺激，绕过TCR信号激活DAG和开放钙通道。³⁷对从外周血分离的原代人类T细胞的研究表明，PD-1的参与必须接近TCR复合物或CD28分子才能抑制T细胞激活。³⁸尽管TIL（当前研究）与PBL之间存在固有差异，³⁸我们的结果并不直接质疑这些结果。事实上，我们认为PD-1减少效应细胞因子的产生⁺与PD-1相比，TIL即使对强力刺激作出反应，也反映了其受抑制的效应器功能⁻TIL公司。因此，我们推测Ag刺激PD-1⁺TIL将无法产生任何可检测到的IFN-γ，因为PD-1的表达不仅会抑制细胞因子生成的诱导，而且会抑制TCR信号中间产物的激活。我们还证明MART-1四聚体对细胞因子产生的损害⁺与外周血循环中的CD8 T细胞相比，肿瘤中的CD8T细胞与大多数MART-1四聚体上PD-1的高表达相关⁺TIL公司。MART-1反应性TIL降低的效应器功能与之前的研究一致，尽管它尚未检测PD-1对这些细胞的作用。³⁹这些数据进一步表明，PBL与TIL没有相似的表型和功能特征，正如我们最近报道的CD4 T选择性积累_规则在肿瘤中。¹⁸

鉴于PD-1⁺TIL表现出产生IFN-γ的能力受损，IFN-γ是有效抗肿瘤免疫反应所需的基本细胞因子，⁴⁰它们破坏肿瘤细胞的能力被破坏，可能导致肿瘤免疫逃逸。PD-1的表达是直接导致这种功能衰竭，还是仅仅作为表现出受抑制效应器功能的T细胞的表型标记尚不清楚。虽然在体外向Ag刺激的T细胞添加抗PD-1阻断抗体之前已经证明PD-1在T细胞功能中的抑制作用，^7,8,34,41,42这些功能测定依赖于数天的TCR刺激。通过使用PMA/I，我们绕过了TCR信号传导，避免了长期刺激，使我们能够在不进行长期培养的情况下，在体外测定TIL的功能状态。在PMA/I刺激下添加抗PD-1阻断抗体可能不会显示出由于试验持续时间短（5-8小时）而导致的任何显著功能变化。此外，TIL的体外激活和扩增依赖于高剂量IL-2的添加。¹⁷事实上，我们的初步结果表明，在高剂量IL-2中培养2周后，从肿瘤消化样品中扩增的TIL上PD-1的表达降低（M.A.和S.A.R.，未发表的数据，2008年1月）。虽然我们不能完全确定IL-2是否导致PD-1下调或PD-1扩张⁻在培养的T细胞中，它表明，添加外源性细胞因子（如IL-2）可能会在群体水平上改变细胞的表型和功能。

总之，我们报告在同一患者和健康献血者的正常组织和外周血中，PD-1表达的T细胞浸润转移性黑色素瘤病灶的数量多于T细胞。PD-1⁺与PD-1相比，TIL表现出衰竭表型和效应器功能受损⁻TIL和PBL，支持PD-1通路抑制T细胞效应器功能的关键作用。这些临床前发现对调节癌症患者的抗肿瘤免疫反应具有重要意义。这些结果也为我们开展临床研究提供了理论依据，以评估抗PDL-1单克隆抗体在转移性黑色素瘤患者临床试验中的潜在影响。

致谢

脚注

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