心肌梗死（MI）导致缺血心肌组织死亡，随后出现炎症反应，收缩组织替换为纤维瘢痕1心肌梗死引起的瘢痕形成主要由肌成纤维细胞介导，肌成纤维是一种独特的收缩细胞类型，具有成纤维细胞和平滑肌细胞（SMC）的特征2细胞外信号、机械力或组织损伤触发肌成纤维细胞激活和含有平滑肌α肌动蛋白（SMA）的应力纤维的产生，这有助于伤口愈合所需的力的产生和收缩2–6肌成纤维细胞还分泌细胞外基质（ECM）成分，包括胶原1a1（Col1a1）、胶原1a2（Col1a2）、胶原3a1（Col3a1）和基质金属蛋白酶，导致肉芽组织和纤维化瘢痕的形成2,7。
血清反应因子（SRF）通过与序列[CC（a/T）结合在几乎所有已知平滑肌特异性基因的调节中起主要作用6GG]，称为CArG盒或血清反应元件（SRE）8,9SRF的转录活性通过与共激活物心肌蛋白和心肌蛋白相关转录因子（MRTF-A/MAL/MKL1和MRTF-B/MKL2）的结合而增强8,10–12.肌卡蛋白仅限于心肌和平滑肌，需要且足以与SRF一起激活平滑肌基因表达10,13–16MRTF-A和MRTF-B广泛表达，并通过与肌动蛋白细胞骨架的相互作用在亚细胞分布水平上受到调节11,17–19MRTF-A和MRTF-B具有独特的N末端RPEL结构域，介导与G-actin的结合和细胞质隔离20应激信号、机械力和细胞形状的变化导致Rho–Rho激酶（ROCK）信号的激活、肌动蛋白细胞骨架的重组和MRTF-A的核移位，从而将肌动蛋白动力学与依赖SRF的基因转录联系起来17,21–26。
在纤维化病理模型中，ROCK依赖性信号通过肌纤维母细胞样细胞增强编码ECM成分和SMA的基因转录27–30ROCK单倍体不足或药物抑制ROCK可减少心肌梗死、缺血再灌注或压力过载引起的心脏纤维化31–35ROCK激活有助于MRTFs的核积累和体外SMA转录的激活28,36含有SRF的复合物与肌成纤维细胞表型的诱导有关37,38但SRF是否参与体内纤维化尚不清楚。
在本研究中，我们证明，小鼠MRTF-A基因缺失导致MI或血管紧张素（Ang）II治疗后瘢痕形成减少。MI后MRTF-A缺失小鼠的瘢痕形成减少与SMA阳性肌成纤维细胞数量减少和梗死边界区（BZ）纤维化相关基因表达减少有关。我们确定了一组MRTF-a调节的基因，这些基因编码肌成纤维细胞和纤维化标记物，包括那些编码平滑肌肉瘤和结构蛋白以及ECM成分的标记物。我们发现，MRTF-A对心脏成纤维细胞（CFs）中的TGFβ-1有反应，并通过直接激活胶原分泌型SMA丰富的肌纤维母细胞样表型，促进其诱导第1a2列启动子通过保守的CArG元件。这些结果揭示了MRTF-A是心脏重塑的关键调节因子，并为ROCK抑制减少病理性纤维化的机制提供了深入的见解。
方法
细胞培养和转染
10T1/2细胞在6孔板MEM Eagles培养基中生长，并在RNA分离前瞬时转染500 ng空白pcDNA3.1对照或pcDNA3.1-MRTF-A质粒48小时。在DMEM中生长的CF按照正文中的说明处理24–48小时，然后分离RNA或蛋白质。CF增殖采用CellTiter 96水溶液细胞增殖测定法（Promega），使用制造商的方案进行测定。
对于荧光素酶分析，使用FuGENE6（Roche）转染24孔板中培养的CFs或COS，共转染300ng质粒DNA。使用20ng pCMV-lacZ作为内部对照，使用空pcDNA3.1保持质粒总量恒定。转染48小时后，使用荧光素酶检测试剂盒（Promega）进行荧光素素酶和β-半乳糖苷酶检测。
Col1a2报告器结构
420 bp小鼠第1a2列使用高保真Taq聚合酶（TAKARA）和以下含有5′KpnI和3′XhoI连接子的寡核苷酸扩增启动子：Col1a2-For:5′-GGTACGAGCTCCTCTTTTCATC–3′；Col1a2版次：5′–CTCGAGTAAAAAAAAAGCCCAGACC–3′。将得到的PCR产物克隆到pGL3-碱性荧光素酶载体（Invitrogen）的KpnI和XhoI位点。使用QuickChangeII定点突变试剂盒和制造商的方案（Stratagene）完成CArG元件的突变。用于PCR扩增的寡核苷酸如下：Col1a2 mutCArG for：5′–CCTAAAGTGCTTACACAGTGCAAGCGCGCGCG–3′；和Col1a2 mutCArG版次：5′–CGCCCTTGCCACGTGAGCACTTTAGG–3′。所有构造都经过了序列验证。
免疫细胞化学
CFs在MOI为10时感染带有标记的MRTF-a腺病毒，并在用冷甲醇固定前24小时用TGFβ-1（10 ng/ml）和/或Y-27632（10μM）治疗。用小鼠单克隆Flag M2抗体（Sigma）或Cy3-结合抗SMA抗体（Simma，克隆1A4，1:200）进行间接免疫荧光。使用蔡司LSM-510显微镜拍摄共聚焦图像。
蛋白质印迹
使用针对SMA（Sigma）、SM22（Abcam）、胶原蛋白I（Abcan）和微管蛋白（Sigma-）的抗体通过Western blot测定蛋白质水平。采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Non-denturing PAGE），通过Western blot检测胶原I蛋白。
组织学和免疫组织化学
组织用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，并每隔5μm进行切片。使用标准程序进行苏木精、伊红和Masson三色染色。使用Cy3缀合的抗SMA抗体（Sigma，克隆1A4，1:200）在石蜡包埋的切片上进行SMA染色。使用Dapi在vectashield安装介质中对细胞核进行可视化（Vector实验室）。在三个WT和三个MRTF-A的BZ中计数SMA阳性血管和肌成纤维细胞−/−动物和表示为平均+/−SEM。分别使用磷酸化H istone-H3抗体或原位细胞死亡检测试剂盒（Roche）和制造商的方案检测增殖和细胞死亡。
RNA分析
根据制造商的方案，使用Trizol试剂（Invitrogen）分离总RNA。使用Superscript III（Invitrogen）按照制造商的方案使用2μg RNA产生cDNA，并使用Taqman引物和探针进行检测。
胶原蛋白合成分析
[三H] -进行脯氨酸掺入，以确定MRTF-A过度表达对胶原合成的影响。在标准培养条件下，将第2代或第3代的CFs在24孔组织培养皿中在补充有10%FBS的DMEM中培养48小时，或直到融合。然后通过血清饥饿24小时使CFs静止，感染介导MRTF-A或对照β-半乳糖苷酶表达的10MOI腺病毒，并在SF条件下额外培养24小时。然后添加2.5%FBS、TGFβ-1（10 ng/ml）、Y-27632（10μM）、，或TGFβ-1和Y-27632联合用药48小时[三H] -脯氨酸（1μCi/ml，PerkinElmer生命科学公司）。然后用Dulbelcco的PBS洗涤CFs三次，并用冰凉的5%TCA沉淀蛋白质1小时。然后用400μl 0.2 M NaOH在37°C下溶解沉淀30分钟。通过液体闪烁计数测定放射性。每种条件一式四份，并在三个独立实验中重复。
染色体免疫沉淀分析法
按照制造商的说明，使用EZ-ChIP试剂盒（Millipore）进行染色质免疫沉淀。简单地说，10T1/2的天然染色质与针对SRF（Santa Cruz）、RNA PolII（Millipore）或小鼠IgG（Millipore）的抗体交联并免疫沉淀。用PCR扩增检测Col1a2启动子序列或GAPDH。染色质与2μg抗内源性SRF（Santa Cruz）、RNA PolII（Millipore）或小鼠IgG（Millipore）的免疫沉淀抗体孵育，然后在4°C下用蛋白g珠（Millibore）免疫沉淀过夜。
电泳迁移率变化分析
使用与Col1a2 CArG序列对应的双链寡核苷酸进行EMSA。将来自标记SRF或空pcDNA3.1转染COS细胞的4μl蛋白裂解物与32P标记的寡核苷酸探针在1μl聚dIdC（1.0μg/μl）存在下在室温下放置20分钟。通过添加2μl抗Flag M2抗体（Sigma）检测超位移形成。
心肌梗死
使用男性MRTF-A生成心肌梗死−/−12周龄（25-30g）的WT小鼠通过外科结扎左冠状动脉前降支（LAD）。假手术小鼠进行了相同的手术，但未阻断LAD。为了确定梗死面积，将每个心脏至少四个三色染色切片的图像导入OpenLab 3.1，测量三色染色面积，并将其作为每个切片中左室总面积的百分比。在设计用于测量梗死AAR的研究中，在确认心肌缺血后立即使用直接LV给药在动物全身灌注0.3%亚甲基蓝染料。进行灌注，直到心脏组织出现明显染色，且染色面积在1分钟内没有进一步增加。然后用4%多聚甲醛在盐水中进一步灌注小鼠，以确保组织和活性染料的正确固定。然后收集心脏并进行AAR分析。心脏被整座拍摄下来，以记录染色（灌注）区域与未染色（未灌注）区域的大小。然后从结扎处开始，向心尖方向进行组织学解剖，将心脏分成3个大小相等的横切面。将染色LV组织与未染色组织分离，并称重。基于干重的未染色组织与染色组织的比例决定了AAR。
血管紧张素II输注
将Ang II（溶于0.01 mol/l乙酸中）以0.6 mg/kg/天的速率皮下注射2周，使用植入每只小鼠的渗透微型泵（Alzet型号2002；URECT Corp.，Cupertino，USA）。输注血管紧张素II 2周后，将左心室固定在10%甲醛中。为了确定胶原纤维积聚的程度，我们随机选择了一些区域，并使用显微镜BIOREVO BZ-9000（日本大阪基恩斯）测量了Masson’s Trichrom染色的间质纤维化面积与左心室总面积的关系。本研究不包括血管周围纤维化区域。
数据和统计分析
除非另有说明，否则结果以平均值+/-SEM表示。组间差异的统计分析采用Student双尾t检验，方差不等，FS%组间的显著性采用多指标双因素方差分析。显著性为P<0.05。
小鼠突变体和动物护理
所有使用动物的实验之前都得到了UT西南医学中心动物护理和使用委员会的批准。MRTF-A−/−本研究中使用的小鼠系此前已有报道19使用先前描述的PCR策略对小鼠进行基因分型。
结果
MRTF-A型−/−心肌梗死后小鼠心肌纤维化减轻
ROCK信号与过度纤维化相关疾病中的肌成纤维细胞激活有关，包括心肌梗死后的心脏重塑32,33鉴于MRTF-A在培养细胞中作为ROCK信号传导和压力依赖性基因表达的介质的作用21,22通过外科结扎野生型（WT）左前降支和MRTF-A，我们研究了MRTF-A在心肌梗死反应中的潜在作用−/−老鼠。结扎两周后，WT小鼠出现广泛的纤维化瘢痕，横跨左心室游离壁的大部分()组织切片的Masson三色染色显示。梗死区典型地表现为与纤维化相关的显著变薄和扩张。相反，我们观察到MRTF-a的梗死面积明显缩小−/−通过纤维瘢痕大小评估心脏(). 根据三色染色/LV比率定量，MRTF-A缺失导致瘢痕大小减少约50%(). WT和MRTF-A的MI后致死率几乎相同−/−小鼠（数据未显示）暗示有足够的初始瘢痕形成，以允许伤口愈合并防止心脏破裂。基线检查时以及心肌梗死后3、7和14天的心功能评估显示，尽管MRTF-A−/−与WT小鼠相比，小鼠趋向于缩短分数（FS%）的改善，这种改善没有达到统计学意义(在线图一).
MRTF-A缺失导致MI后瘢痕形成减少（A）心肌梗死后14天代表性心脏的整体图像和两个代表性心脏切片的Masson三色染色。箭头表示结扎点，剖面用水平线表示。Masson三色染色显示右心室右心室梗死区瘢痕缩小且更致密（对比a1和a2与b1和b2）；左心室。比例尺=1 mm。
（B）梗死面积的量化以Masson三色染色阳性的左室面积百分比表示。n=8只体重和8只KO动物。
（C）通过亚甲基蓝灌注确定危险区域（AAR）。AAR无染色。箭头表示左前降支上的结扎点。
（D）AAR的量化表示为心肌梗死后10分钟和1天未染色LV质量的百分比。n=4 WT和4 MRTF-A−/−动物在10 min、3 WT和3 MRTF-A时−/−MI后1天的动物。
（E）心肌梗死后1天，在每个心脏梗死区内至少4个独立的区域对TUNEL阳性细胞进行定量，并从2个WT和3个MRTF-A中取平均值−/−动物。数据表示为TUNEL阳性Dapi染色细胞核的百分比。
（F）心肌梗死后14天，在每个心脏BZ的至少7个独立区域内对磷酸化氢istone H3阳性细胞进行定量，并从3个WT和4个MRTF-A中取平均值−/−动物。误差条表示SEM。
MRTF-A中梗死面积的缩小−/−一般来说，小鼠的梗死倾向降低或健康心肌组织的愈合和再生能力增强都可能是其原因。为了解决这些可能性，我们首先确定了WT和MRTF-A中梗死风险区域（AAR）的大小−/−用亚甲蓝给动物灌胃。结扎后立即对心脏进行大体检查，发现WT和MRTF-a的灌注面积相似−/−老鼠(). 定量非灌注心肌组织与灌注心肌组织的质量证实，MRTF-A的缺失并未导致AAR的降低(). MRTF-A中的AAR也没有改变−/−小鼠心肌梗死后24小时(). 这些结果表明，MRTF-A的缺失对侧支血管结构没有显著影响。
接下来，我们确定MRTF-A缺失是否影响心肌梗死后24小时梗死区的细胞死亡。TUNEL组织切片染色显示整个梗死区都有显著的细胞死亡，尽管WT和MRTF-A-之间TUNEL阳性细胞核的百分比几乎相同−/−动物(和在线图二). 最后，检查MRTF-A心脏的可能性−/−小鼠可能表现出更强的再生倾向，我们确定MRTF-A−/−CMC再次进入细胞周期。WT或MRTF-A心脏的免疫染色−/−小鼠心肌梗死后14天服用磷酸氢istone H3和CMC标记物α-肌动蛋白后，CMC增殖没有明显改变(和在线图三). 然而，MRTF-a心脏中非CMC的增殖有减少的趋势−/−动物(和在线图三). 我们得出结论，MRTF-A中观察到的梗死面积减小−/−小鼠不是AAR、细胞活性或再生能力改变的结果，可能反映了其在重塑和瘢痕形成中的直接作用。
MRTF-A调节心肌梗死后胶原表达
我们在心肌梗死后14天从梗死边缘区（BZ）和远端健康组织中分离组织进行实时定量PCR。假手术小鼠作为对照。正如预期的那样，野生型动物的BZ中ECM和纤维化重塑的多种标志物升高(). 野生型小鼠BZ中Col1a1、Col1a2、Col3a1和弹性蛋白（Eln）的上调在MRTF-A的BZ中减弱−/−实时RT-PCR显示的小鼠(). MRTF-A中这些标记物的显著减少−/−老鼠()与减少这些动物的伤害是一致的(). 心肌梗死后纤维化的减轻并未伴随着BZ中TGFβ-1、-2和-3的表达显著降低，表明细胞因子激活正常(). 心房利钠素（ANF）在MRTF-A的BZ中的表达降低−/−小鼠，进一步表明病理重塑减少()尽管心肌梗死后心脏修复的标志物Tenascin C（TnC）在WT和MRTF-a的BZ中也有类似的诱导作用−/−老鼠(). MI后胶原基因表达的诱导与MRTF-A基因型之间的密切相关性表明MRTF-A在MI后瘢痕形成的促进中。
MRTF-A影响心肌梗死后14天ECM基因表达（A）实时PCR检测假心脏（S）和梗死边缘区（BZ）或远端（R）区域的各种ECM成分，显示MRTF-A的BZ胶原基因表达减弱−/−红心。
（B）细胞因子TGFβ-1、-2和-3在WT和MRTF-A之间的BZ表达无明显变化−/−红心。
（C）应激反应性ANF基因在MRTF-A中表达降低−/−红心。WT和MRTF-A的BZ中的TnC水平升高到类似水平−/−动物。n=4 WT和4 MRTF-A−/−心脏梗死组和2个shams。误差条代表SEM。
MRTF-A调节心肌梗死后肌成纤维细胞SMC标记物的表达
由于肌成纤维细胞是心肌梗死后ECM沉积和瘢痕形成的主要因素1，我们检测了心肌梗死后14天心脏中肌成纤维细胞活化的平滑肌标记物的表达。SM22和SMA在MRTF-A的BZ和远端组织中的表达减弱−/−通过定量RT-PCR评估心肌梗死后14天的动物(). 接下来，我们确定了SMA在WT和MRTF-A中的定位−/−心肌梗死后14天心脏的免疫组织化学研究(). SMA组织切片的免疫染色显示，WT小鼠的BZ含有大量纺锤形SMA阳性细胞，或与血管无关的SMA阳性的细胞聚集物，这表明存在肌纤维母细胞样细胞(). 相反，MRTF-A的BZ−/−小鼠SMA阳性肌成纤维细胞明显少于WT动物(). BZ中SMA阳性肌成纤维细胞的定量显示，WT的密度比MRTF-a高（约3倍）−/−动物(). SMA也在浸润梗死区BZ的小动脉中高表达。WT和MRTF-A BZ中SMA阳性小动脉数量的定量−/−心脏显示MRTF-a中微动脉数量略有增加，但不明显−/−动物().
MRTF-A缺失导致心肌梗死后14天平滑肌基因表达改变（A）实时PCR显示在MRTF-a的BZ和远端区域SM22和SMA诱导显著减少−/−心脏（*表示p值<0.01，†表示p值<0.05）。n=4 WT和4 MRTF-A−/−每个梗死组和2个假手术组的心脏数。
（B）WT和MRTF-A心脏组织切片−/−显示心肌梗死后14天的小鼠。与用于免疫组织化学的心脏相邻的代表性心脏的H&E染色（a，b）切片显示了缺血性损伤，并突出了梗死的BZ。（a’和b’）a和b中装箱区域的放大。（a“和b”）对应于代表性WT和MRTF-a装箱区域的SMA免疫染色−/−梗死的心脏。箭头标记SMA阳性纺锤形肌成纤维细胞。a的比例尺，b=1mm。a'、a“和b'、b”的比例尺=40μm。
（C）每个视野中SMA阳性肌成纤维细胞的数量。
（D）每个视野BZ内SMA阳性小动脉的数量。n=3 WT和3 MRTF-A−/−红心。误差线代表SEM。在每个心脏BZ内至少3个视野放大40倍进行量化，并取3个WT和3个MRTF-A的平均值−/−心脏（*表示p值<0.05）。误差条代表SEM。
MRTF-A型−/−小鼠对AngII的反应显示出减少的纤维化
自MRTF-A−/−小鼠在心肌梗死后可避免过度瘢痕形成，肾素-血管紧张素系统是心肌梗死后纤维化的主要介质，我们询问MRTF-a是否也在血管紧张素II介导的纤维化中发挥作用。注射AngII 14天后（0.6 mg/kg/天），WT小鼠表现出严重的间质纤维化，通过LV组织切片的Masson三色染色进行评估(). 相反，MRTF-A−/−输注血管紧张素II可保护窝友免受纤维化().
MRTF-A缺失减轻慢性AngII给药后的纤维化（A）WT（a，b）或MRTF-a给药14天后，对代表性组织切片进行Masson三色染色−/−（c，d）小鼠。
（B）左心室三色染色定量。误差条代表SEM（*表示p值<0.05）。
（C）胶原基因和平滑肌分化标记物的定量RT-PCR显示AngII给予MRTF-A后Col1a、Col3a、SMA和SM22的诱导减弱−/−动物。误差条代表SEM（*表示p值<0.05）。
AngII治疗后Masson’s三色染色LV面积百分比的量化显示，MRTF-a缺失后几乎可以完全防止纤维化(). 对AngII治疗14天后胶原基因表达的量化显示，AngII处理的WT小鼠中Col1a2和Col3a1表达增加，MRTF-A显著减弱−/−老鼠()证实了在这些动物中观察到的纤维化减少。同样，在MRTF-A中未观察到在WT动物中刺激SMA和SM22表达−/−老鼠(). 这些结果进一步表明MRTF-a在促进心脏中的肌成纤维细胞表型和纤维化重塑中的作用。
MRTF-a对肌成纤维细胞表型的调节
测试MRTF-A是否足以诱导肌纤维母细胞相关基因表达下调−/−我们通过腺病毒介导的表达增强了MRTF-A在培养的原发性心室新生CFs中的表达。与心肌蛋白（在心脏的CMC中特异表达）相反，MRTF-A在CMC和CF中都表达(). 如所示，MRTF-A在CFs中的过度表达导致SMA和SM22的表达显著增加(). 与β-gal感染的CFs相比，MRTF-A对培养的CFs中SMA的免疫细胞化学检测证实了SMA的富集(). MRTF-A在CFs中的过度表达导致SMA积聚成高度组织化的应激纤维，这是肌成纤维细胞活化的标志，而对照细胞中主要局限于皮质肌动蛋白().
MRTF-A调节CF平滑肌标志物的表达（A）定量实时PCR显示心肌蛋白仅在CMC中表达，而MRTF-A在CMC和CF中的表达水平相似。
（B）定量实时RT-PCR显示，相对于β-半乳糖感染的对照CF，SMA和SM22在过度表达MRTF-A的CF中显著富集。误差条代表SEM。
（C）CFs的间接免疫荧光显示，MRTF-A过度表达导致SMA富集成组织应激纤维，而Ad-β-gal感染的CFs主要表现为皮质肌动蛋白SMA染色。比例尺=25μm。
TGFβ-1以ROCK依赖的方式促进MRTF-A的核移位
TGFβ-1促进包括心脏、肾脏、肝脏和皮肤在内的多个器官的收缩性肌成纤维细胞表型。TGFβ-1诱导CFs中SMA免疫染色显著升高，主要定位于应激纤维(). ROCK抑制剂Y-27632主要阻断TGFβ-1和MRTF-A对SMA的诱导，而在基线时适度抑制SMA染色(). 因为MRTF-A在肾上皮细胞中对TGFβ-1和ROCK信号的反应中发生核移位36,39，我们检测了TGFβ-1和ROCK是否会影响CFs中MRTF-A的活性。MRTF-A在无血清培养基或Y-27632存在下培养的CFs中主要显示细胞质定位（约10-20%细胞核；). TGFβ-1治疗CFs导致MRTF-a向细胞核转移；显示MRTF-A细胞质限制的细胞数量显著减少，更多的细胞显示核和细胞质染色或核富集（约50%核；). Y-27632部分减弱了MRTF-A对TGFβ-1的核累积反应，表明TGFβ1依赖性核移位也受ROCK活性的影响（约40%核；).
TGFβ-1和ROCK抑制剂Y-27632对CFs中MRTF-A核定位和活性的调节（A）在无血清（SF）培养基或补充TGFβ-1（10ng/ml）、Y-27632（10μM）或TGFβ-1和Y-27632。使用相同的曝光设置拍摄所有图像。比例尺=25μm。
（B）CFs在SF培养基或补充TGFβ-1、Y-27632或TGFβ-1和Y-27633的培养基中生长24小时后，对标记的MRTF-A进行免疫细胞化学检测。比例尺=100μm。
（C）不同培养条件下Flag-MRTF-A亚细胞定位的量化。对每种情况下大约20个随机视野对Flag-MRTF-A的亚细胞定位进行评分。误差线代表SEM（*表示p值<0.01；†表示p值<0.05）。
Col1a2是MRTF-a的直接目标
由于MRTF-A诱导了SMC标记物的表达，表明肌成纤维细胞表型，我们接下来评估了MRTF-A影响CFs胶原沉积的能力，CFs主要介导心肌梗死后的纤维化反应[三H] -脯氨酸掺入，以量化CF在各种刺激下的胶原蛋白合成。重要的是，MRTF-A过度表达不会刺激CF增殖(在线图四)与SRF和心肌蛋白在CMC中促进分化和抑制增殖的报道一致40用血清或TGFβ-1治疗CFs导致胶原蛋白生成增加(). CFs中MRTF-A的过度表达也导致胶原合成显著增加，血清或TGFβ-1进一步刺激了这种增加(). 相反，Y-27632对Rho信号的抑制导致MRTF-A依赖性胶原合成的减少(). 我们还检测到过表达MRTF-A的CF中Col1a2、SMA和SM22蛋白水平增加(在线图五). 定量实时RT-PCR显示，随着MRTF-A过度表达，Col1a2 mRNA水平也增加().
MRTF-A调节Col1a2表达（A）[三H] CFs中的脯氨酸掺入表明MRTF-A显著丰富胶原蛋白合成。CFs血清饥饿48小时，然后感染10 MOI Ad-MRTF-A或Ad-β-gal，并在SF培养基或补充2.5%FBS、TGFβ-1（10 ng/ml）、Y-27632（10μM）或TGFβ-1和Y-27631的培养基中培养48小时。误差条代表SEM。
（B）定量实时RT-PCR显示用空载体对照或MRTF-A表达载体转染的10T1/2细胞中Col1a2、Col3a1、SMA和SM22的表达。
（C）显示了瞬时转染分析和EMSA中使用的区域的描述。蓝色峰值表示哺乳动物调控序列的进化保守性和一致性位于底部，突出了保守的CArG、SP1和Smad位点。EMSA和瞬时转染分析中使用的CArG突变与WT CArG一致。
（D）使用针对内源性SRF的抗体对Col1a2或GAPDH启动子序列进行染色质免疫沉淀。针对PolII或IgG的抗体作为阳性和阴性对照。输入为总染色质的1%。
（E）电泳迁移率分析表明SRF与保守的CArG盒结合。标记抗体超转移SRF/DNA复合物，而WT未标记的竞争物寡核苷酸消除转移的复合物。突变寡核苷酸（m）无法结合SRF，未标记的突变竞争物（m）未能消除SRF/CArG相互作用。
（F）用WT或CArG突变体Col1a2-luciferase构建物瞬时转染COS细胞显示出对MRTF-a的剂量依赖性反应。误差条代表SD。
（G）MRTF-A诱导瞬时转染CFs中Col1a2-luc的表达，并在10%FBS的存在下显示活性增加。误差条代表SD。
（H）TGFβ-1治疗可刺激MRTF-A依赖的Col1a2启动子活性。CArG盒的突变消除了启动子对MRTF-A或TGFβ-1治疗的反应性。误差条代表SD。
进化上保守的CArG盒存在于先前特征化的Smad3和Sp1依赖的启动子区第1a2列基因41(). 一种针对内源性SRF蛋白沉淀染色质的抗体，含有第1a2列CArG盒以TGFβ-1独立方式(). SRF还有效地绑定到第1a2列凝胶迁移率变化分析中的CArG盒(). 420基点第1a2列MRTF-a以剂量依赖性的方式激活了与荧光素酶报告子相关的启动子片段，CArG盒的突变减弱了MRTF-a的反应性(). 此外第1a2列启动子在原发性CFs中显示MRTF-a的剂量依赖性诱导()CArG盒的突变完全消除了TGF-β-1对MRTF-A活性的刺激(). 我们得出的结论是，MRTF-A直接调节Col1a2基因的表达，以促进MI后的纤维化和瘢痕形成。
讨论
我们的研究结果揭示了MRTF-a在促进MI和AngII输注的转录反应中的新作用。我们证明TGFβ-1和ROCK调节了MRTF-A在CFs中的亚细胞定位和活性，MRTF-A诱导了与肌纤维母细胞样细胞类型一致的基因子集，从而在体内外合成胶原(). 此外，小鼠中MRTF-A的基因缺失消除了对MI的纤维化反应，并导致肌成纤维细胞诱导和瘢痕形成的减少。这些结果表明，MRTF-A活性的减弱可能有助于ROCK抑制对纤维化疾病的治疗作用。
MI应激反应期间MRTF-A活性的拟议机制TGFβ-1水平的增加导致MRTF-A以Rho-ROCK依赖的方式在核内积聚。核MRTF-A以含有基因的CArG盒为靶点，诱导平滑肌和ECM分子的表达，表明肌成纤维细胞类型。
MRTF-A对胶原蛋白的应激反应调节
在MRTF-A中，包括Col1a1、Col1a2、Col3a1和弹性蛋白在内的多种ECM标记物的上调显著减弱−/−MI或AngII治疗后的小鼠。我们确定第1a2列启动子作为MRTF-a/SRF的新靶点。我们还鉴定了一个进化上保守的CArG盒，位于第3a1列基因，与先前特征化的调节元件相邻42这些发现表明，MRTF-a除了先前定义的与肌动蛋白细胞骨架或平滑肌肉瘤组织相关的靶点外，还可能在直接调节一系列纤维素酶相关基因中发挥作用。
有趣的是第1a2列启动子包含一个保守的CArG盒，在富含a/T的核心含有G/C取代。这种类型的CArG退化降低了自由SRF的结合亲和力，导致低水平的基础表达43我们的研究结果支持这样一个假设，即CArG简并性可能对SRF辅因子（如MRTF-A）的核积累引起的基因表达的应激反应激活很重要。
MRTF-A激活和TGFβ-1
TGFβ-1-Smad信号通路是肌成纤维细胞活化和纤维化的最具特征的促因44–47心肌梗死后TGFβ-1及其转录介质Smad2、3和4被激活46–48TGFβ-1-Smad3通路是心肌梗死后重塑的主要介质，包括SMA和富含SM22的肌成纤维细胞的诱导以及向纤维化的过渡44,45Smad3基因缺失小鼠显示梗死后间质纤维化和心脏重塑减少49以及肌成纤维细胞系TGFβ-1–Smad依赖性异常激活可导致过度纤维化，从而导致慢性纤维化疾病45,50.含有SRF/肌钙蛋白的复合物可以激活SM22型转化生长因子β-1刺激10T1/2细胞后的启动子37最近的研究也记录了MRTF-A在肾上皮细胞中对TGFβ-1信号转导的亚细胞定位和活性的调节36,39我们的研究结果扩展了这些发现，并揭示了MRTF-a在促进肌成纤维细胞活化和ECM沉积方面的新功能，以响应TGFβ-1刺激CFs。
在某些情况下，转化生长因子β-1诱导的肌成纤维细胞活化和纤维化被ROCK抑制阻断，表明这些信号通路之间存在协同作用。Rho-ROCK信号传导在感知环境和产生细胞对损伤或应激的反应方面发挥着重要作用。机械力或受体介导的Rho信号级联刺激已被证明激活ROCK和MLC激酶，促进平滑肌样肌成纤维细胞表型。ROCK和MLC激酶还刺激肌动蛋白细胞骨架重排和MRTF-A的核移位，这有助于SMC特异性基因表达，从而将细胞应激与SRF/MRTF-A介导的转录激活联系起来17,20–23.Rho信号也参与多组织的病理性纤维化27–30,35因此，MRTF-A可能有助于ROCK介导的肌成纤维细胞活化和纤维化重塑，这似乎是合理的。
最近，缺血再灌注和肾损伤后肌成纤维细胞的激活被认为来源于循环炎症细胞35,51,52单核细胞/巨噬细胞缺失显著减轻单侧输尿管梗阻后的肾纤维化51此外，在宿主小鼠纤维化心脏的肌成纤维细胞群中检测到来自供体小鼠的骨髓源性细胞，而ROCK-1基因缺失小鼠表现出这种纤维化反应的减弱52虽然对我们的结果最直接的解释是，MRTF-A在MI和AngII治疗后的心肌纤维化期间介导心肌肌成纤维细胞中的ROCK-1信号，但从形式上讲，另一个MRTF-A-依赖性细胞群体可能会促成这种反应。CMC或SMC中的MRTF-A活性也可能有助于MI或AngII给药后纤维化的发展。虽然MRTF-A在CF中强烈表达，并且MRTF-A的过度表达会刺激培养CF的ECM沉积，但需要进行组织特异性消融或骨髓移植，以明确确定MRTF-A活性是主要发生在常驻心脏成纤维细胞中，还是可能在其他细胞类型中发挥作用。
ROCK抑制剂与病理性纤维化的治疗
血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂和血管紧张素受体阻滞剂是预防心肌梗死后心脏重塑和充血性心力衰竭的最有效治疗方法之一53Rho-ROCK信号通路已开始引起人们的注意，它是治疗各种病理状况的潜在治疗靶点，包括血管痉挛、动脉硬化、缺血/再灌注损伤和肾脏疾病等32,33,35,54在临床研究中，ROCK抑制剂fasudil对血管痉挛和高血压有疗效55–57我们的研究结果表明，MRTF-A参与了心肌梗死后纤维化重塑过程中TGFβ-1、AngII和ROCK信号的潜在转录介质−/−小鼠没有表现出心脏破裂或心肌梗死后死亡率增加，这意味着它们最初形成了足够的疤痕组织来进行伤口愈合。MRTF-A可能在促进间质纤维化和不良心脏重塑中发挥特殊作用。表征MRTF-A激活的精确机制将增强我们对纤维化病理的理解，并加速MRTF-A-抑制剂的开发，该抑制剂可能被证明对治疗纤维化或心血管疾病有用，从而绕过了普通Rho抑制剂的明显局限性，后者会大大改变细胞骨架动力学。
新颖性和意义
已知的是什么？
损伤后，心脏成纤维细胞产生肌成纤维细胞，导致瘢痕形成和病理性纤维化。
心肌梗死（MI）后活化的肌成纤维细胞高度表达平滑肌收缩基因和胶原蛋白。
肌球蛋白相关转录因子（MRTF）-A被心脏应激激活，是平滑肌基因的有效诱导剂。
这篇文章提供了哪些新信息？
在西方世界，冠状动脉闭塞引起的心肌梗死是导致死亡和发病的主要原因。受损的心肌和邻近的健康心肌被瘢痕组织所取代，瘢痕组织起着血管重建的屏障作用，增加了心律失常的易感性，并导致进行性心脏扩张和收缩功能丧失。了解心脏纤维化的分子基础可能会促进预防和治疗心力衰竭的新疗法的发展。在这里，我们证明MRTF-A控制心脏成纤维细胞中平滑肌和纤维化基因程序的表达，从而促进肌成纤维细胞表型。小鼠中MRTF-A的缺失导致心肌梗死后肌成纤维细胞活化减弱，纤维化程度显著降低。MRTF-A的缺失所提供的保护作用与纤维化相关基因的低表达水平有关，包括胶原蛋白1a2（MRTF-A的一种新的直接转录靶点）。这些发现表明MRTF-A是病理性纤维化的关键介质，也是治疗心血管疾病的潜在靶点。
