临床癌症研究。作者手稿；PMC 2011年7月15日发布。
以最终编辑形式发布为：
预防性维修识别码：PMC2920733型
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院210658
非小细胞肺癌中Nrf2和Keap1异常及其与临床病理特征的关系
,1 ,2 ,三 ,2 ,2 ,1 ,1,2 ,8 ,4 ,三 ,5,6,7 ,2和1,2
路易莎·索利斯
1德克萨斯大学安德森癌症中心病理学系，德克萨斯州休斯顿
卡门·贝伦斯
2德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心胸颈部肿瘤医学系
Wenli Dong公司
三德克萨斯大学安德森癌症中心生物统计学系，德克萨斯州休斯顿
米林德·苏拉奥卡尔
2德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心胸颈部肿瘤医学系，德克萨斯州休斯顿
娜塔莉·奥斯本
2德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心胸颈部肿瘤医学系，德克萨斯州休斯顿
塞萨尔·莫兰
1德克萨斯大学安德森癌症中心病理学系，德克萨斯州休斯顿
亚历杭德罗·科尔瓦兰
1德克萨斯大学安德森癌症中心病理学系，德克萨斯州休斯顿
2德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心胸颈部肿瘤医学系，德克萨斯州休斯顿
希亚姆·比斯瓦尔
8马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学彭博公共卫生学院环境健康科学系
斯蒂芬·G·斯威舍
4德克萨斯大学安德森癌症中心胸外科，德克萨斯州休斯顿
B.内比尤·贝克勒
三德克萨斯大学安德森癌症中心生物统计学系，德克萨斯州休斯顿
约翰·D·明纳
5德克萨斯大学西南医学中心哈蒙肿瘤治疗研究中心，德克萨斯州达拉斯
6德克萨斯州达拉斯德克萨斯大学西南医学中心内科
7德克萨斯大学西南医学中心药理学系，德克萨斯州达拉斯
大卫·J·斯图尔特
2德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心胸颈部肿瘤医学系，德克萨斯州休斯顿
伊格纳西奥·维斯图巴
1德克萨斯大学安德森癌症中心病理学系，德克萨斯州休斯顿
2得克萨斯州休斯顿得克萨斯大学安德森癌症中心胸/头颈医学肿瘤系
1德克萨斯大学安德森癌症中心病理学系，德克萨斯州休斯顿
2德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心胸颈部肿瘤医学系，德克萨斯州休斯顿
三得克萨斯州休斯顿得克萨斯大学安德森癌症中心生物统计学系
4德克萨斯大学安德森癌症中心胸外科，德克萨斯州休斯顿
5德克萨斯大学西南医学中心哈蒙肿瘤治疗研究中心，德克萨斯州达拉斯
6德克萨斯州达拉斯德克萨斯大学西南医学中心内科
7德克萨斯大学西南医学中心药理学系，德克萨斯州达拉斯
8马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学彭博公共卫生学院环境健康科学系
转载请求：Ignacio I.Wistuba，病理学和胸科/头颈肿瘤医学系，德克萨斯大学安德森癌症中心85单元，德克萨斯州休斯顿霍尔科姆大道1515号，邮编77030；电话：713-563-9184；传真：713-792-0309；gro.nosrednadm@abtsiwii - 补充资料
1:补充图1通过Western blot分析Nrf2和Keap1蛋白表达(A类)NSCLC细胞系和永生化支气管上皮BEAS2B细胞的免疫组化分析(B类).A类在Western blot分析中，Nrf2阳性的NSCLC细胞系在细胞核（N）中的表达高于细胞质（C）。聚ADP-核糖聚合酶表达（PARP）表明核蛋白裂解物。B类：显示核Nrf2表达的显微照片（放大倍数，x400）(蓝色箭头)在2个细胞系（H460和A549）中；其他2个细胞系（H1933和BEAS2B）仅表现为细胞质表达。显示细胞质Keap1的显微照片（放大x400）(红色箭头)在2个细胞系（H1933和BEAS2B）中表达；其他2个细胞系（H460和A549）的细胞质Keap1表达较低。
GUID:50A6F49A-858B-4D54-AEFF-F976FA245741
2:补充图2A、，五年操作系统和B类腺癌患者核Nrf2蛋白表达对RFS评分。C类、五年操作系统和D、，鳞状细胞癌患者核Nrf2蛋白表达的RFS率。(E类、事件；和N个，案例总数）。
GUID:FAEFAF23-A38D-4F53-817D-5730463849D4
三。
GUID:BFCC696C-A107-4A03-A6E0-9465C4481D16
4:补充图3A、，五年操作系统和B类根据所有非小细胞肺癌患者的细胞质Keap1蛋白表达对RFS进行评级。C类、五年操作系统和D、，腺癌患者细胞质Keap1蛋白表达的RFS发生率。(E类、事件；和N个，案例总数）。
GUID:BA7D6EDA-1AA1-4306-BB33-E32D6C8B5BD8
5:补充图4A、，核Nrf2蛋白表达鳞癌患者接受辅助治疗后五年RFS评分。B类，F未接受辅助治疗的核Nrf2蛋白表达鳞癌患者五年RFS评分。(E类、事件；和N个，案例总数）。
GUID:AC777717-FC10-4ED8-B1D4-A1A4BA877631
摘要
目的
为了了解Nrf2和Keap1在非小细胞肺癌中的作用，我们利用注释的临床病理数据研究了它们在一系列肿瘤中的表达，包括对基于铂的辅助化疗的反应。
实验设计
我们检测了304例非小细胞肺癌细胞核Nrf2和细胞质Keap1的免疫组化表达及其与患者临床病理特征的关系，并检测了89例接受新辅助化疗（n=26）或辅助铂类化疗（n=63）患者的肿瘤。我们进行了评估NFE2L2型和KEAP1公司31例肿瘤标本的突变。
结果
我们在26%的非小细胞肺癌中检测到核Nrf2的表达；鳞状细胞癌（38%）明显高于腺癌（18%）；P（P）<0.0001). 56%的非小细胞肺癌中检测到Keap1低表达或缺失；腺癌（62%）明显高于鳞癌（46%）；P（P）=0.0057). 在非小细胞肺癌中NFE2L2型和KEAP1公司非常罕见（分别为29例中的2例和31例中的1例）。在多变量分析中，Nrf2表达与较差的总体生存率相关(P（P）=0.0139; HR=1.75）在非小细胞肺癌患者中，Keap1表达低或缺失与总体生存率较差相关(P（P）=0.0181; HR=2.09）。在单变量分析中，接受辅助治疗的鳞癌患者中，核Nrf2表达与无复发生存率较差相关(P（P）=0.0410; HR=3.37）。
结论
Nrf2表达增加和Keap1表达减少是非小细胞肺癌常见的异常，与不良预后相关。恶性肺癌细胞中Nrf2的核表达可能在鳞状细胞癌对基于铂的治疗产生耐药性中起作用。
关键词：Nrf2、Keap1、NSCLC
翻译相关性
核因子红细胞2型相关因子2（Nrf2）是一种与化疗耐药性和肿瘤生长相关的转录因子，被Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）抑制。我们验证了这两种蛋白的异常表达与非小细胞肺癌（NSCLC）患者的预后和辅助化疗反应相关的假设。我们证明，Nrf2表达增加和Keap1表达降低是非小细胞肺癌常见的异常，并与临床结果相关。在我们的研究中，Nrf2和Keap1蛋白的异常表达比相应的基因突变更常见，这表明NFE2L2的激活和Keap1的失活涉及其他机制。Nrf2的表达可能在鳞状细胞癌患者对以铂为基础的辅助化疗的反应中发挥作用。识别Nrf2异常表达的患者可能对非小细胞肺癌的化疗选择很重要。
简介
肺癌是世界上最常见的癌症相关死亡原因(1). 非小细胞肺癌（NSCLC）、腺癌和鳞癌是最常见的组织学类型（85%）(2). 尽管进行了深入的研究，肺癌患者的预后仍然很差，5年总生存率（OS）为15%(1). 对于早期疾病患者，手术是标准治疗(2). 研究发现，辅助化疗对一些II–IIIA期非小细胞肺癌患者有益(三)而对于IIIB和IV期疾病的患者，化疗是标准的一线治疗(三,4). 包括铂类药物的联合用药是非小细胞肺癌最常见的治疗方案(三,4). 然而，大多数肿瘤要么因固有耐药性而无反应，要么在治疗初期出现耐药性(三).
核因子红细胞-2-相关因子2（Nrf2）是一种转录因子，被认为与癌症的发展和进展有关，包括在非小细胞肺癌中(5–8). Nrf2能够使正常细胞适应有害外源因子产生的氧化剂和电泳物以及活性氧及其次级代谢产物(9). 在稳态条件下，Nrf2主要被Kelch-like ECH-associated protein 1（Keap1）抑制，Keap1作为细胞内氧化还原传感器，靶向Nrf2进行蛋白质体降解。在氧化剂或外源性应激下，Keap1释放Nrf2，Nrf2易位到细胞核并激活抗氧化反应元件和外源性元件基因（包括NAD（P）H脱氢酶醌1，NQO1），导致生长因子和受体、药物外排泵、药物代谢酶的蛋白表达，热休克蛋白和各种转录因子(5,9,10).
非小细胞肺癌的发病机制之一是Nrf2的核转位，这是由于Keap1基因的双等位基因失活（突变和杂合性丢失或启动子甲基化）导致Keap1表达缺失所致(5,8,11–13). Nrf2激活的另一种机制是基因突变NFE2L2型影响编码Nrf2的Keap1-结合位点的外显子2的区域(12); 这些突变在8-11%的非小细胞肺癌中检测到，主要是鳞状细胞癌肿瘤(12,14). 已有研究表明，导致肿瘤核Nrf2表达的Nrf2/Keap1通路异常是通过促进肿瘤细胞存活和增殖而诱导基于铂的化疗耐药的重要机制(5–8). 最近，研究表明，在非小细胞肺癌异种移植小鼠模型中，使用siRNA抑制Nrf2表达可增强卡铂诱导的肿瘤生长抑制(8).
迄今为止，尚未对非小细胞肺癌中Nrf2和Keap1的表达及相关遗传异常进行全面分析，也没有研究确定Nrf2的表达与以铂为基础的辅助化疗治疗后的临床结局之间的关系。因此，在这项回顾性研究中，我们在一系列具有注释性临床病理特征（包括结果）的非小细胞肺癌组织标本中表征了这两种蛋白的表达，确定了外显子2的频率NFE2L2型和外显子2-5KEAP1公司突变并评估以铂为基础的辅助化疗患者核Nrf2表达与预后的关系。因为在NSCLC中表皮生长因子受体和KRAS公司突变与肿瘤对化疗的反应有关(15)我们还研究了腺癌中基因突变状态与Nrf2和Keap1表达之间的关系。
材料和方法
细胞系中Nrf2和Keap1蛋白印迹分析
人类非小细胞肺癌细胞系A549和H460（已知Keap1蛋白下调）(5)通过Western blot分析评估了Nrf2和Keap1蛋白的核和细胞质表达。使用NE-PER核提取试剂（Pierce，Rockford，IL）获得这些细胞系的核蛋白和细胞质蛋白提取物。肺癌细胞系由John Minna博士的实验室（德克萨斯州达拉斯）提供，并通过PowerPlex测试进行了鉴定对2.1系统（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）。使用Bradford测定法（Bio-Rad，Hercules，CA）估计蛋白质浓度。对于Western blot分析，在每条通道中装载25μg来自细胞核和细胞质提取物的细胞系蛋白，在NuPAGE 4%–12%Bis-Tris凝胶（Invitrogen，Carlsbad，CA）上运行，并转移到硝化纤维膜上。用5%的非脂肪乳封闭后，将斑点暴露于兔抗Nrf2的一级抗体（稀释1:500，克隆H300；Santa Cruz Biotechnologies，加州Santa Cru）和Keap1（稀释1:600；Proteintech，伊利诺伊州芝加哥），然后是抗兔二级抗体。使用SuperSignal West Pico化学发光基质（伊利诺伊州罗克福德皮尔斯市）检测信号。β-肌动蛋白和聚（ADP-核糖）聚合酶（稀释度1:100，Cell Signaling Technologies，Danver，MA）用作对照。Western blot分析一式三份。
免疫组化分析病例选择
为了确定Nrf2和Keap1在原发性非小细胞肺癌中的表达，我们从德克萨斯大学M.D.安德森癌症中心（德克萨斯州休斯顿）肺癌研究卓越组织库的肺癌手术切除标本中选择存档的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤组织样本。这项研究得到了安德森癌症中心机构审查委员会的批准。使用2004年世界卫生组织分类系统对肿瘤组织进行组织学分析和分类(16). 这些样本用于评估组织芯片（TMA）和整个组织切片中Nrf2和Keap1的免疫组织化学表达。
对于TMA，我们使用了1997年至2003年间收集的304个肿瘤组织样本，包括190个腺癌和114个鳞状细胞癌。这些病例是根据具有足够肿瘤组织用于TMA构建的FFPE组织块的可用性来选择的。如前所述，这些样本放置在TMA中，使用三个直径为1 mm的核心，其中包括来自肿瘤中心、中间和外围区域的组织(17). 详细的临床病理信息，包括人口统计学、表现状态（基于东方合作肿瘤组、ECOG、量表）、吸烟史（从未、以前或现在）、病理TNM分期（I–IV）()无复发生存期（RFS）和总生存期（OS）持续时间适用于大多数病例。为了确定核Nrf2在非小细胞肺癌组织中表达的异质性，我们评估了36例肿瘤的全肿瘤组织切片，包括18例腺癌和18例鳞癌；其中19例表达核Nrf2。其中30例还检测了NQO1的表达。整个肿瘤组织学切片由直径1至2厘米的肿瘤标本和邻近的正常肺组织组成。为了确定化疗后非小细胞肺癌中Nrf2和Keap1蛋白的表达，我们评估了26例接受新辅助铂类化疗患者的肿瘤组织。化疗方案包括卡铂联合紫杉醇（n=21）或顺铂联合足叶乙甙（n=4）或多西紫杉醇（n=1）。我们还确定了Nrf2和Keap1表达与肿瘤组织中化疗效果相关的组织学参数之间的关系，包括肿瘤坏死、纤维化和活的恶性细胞的百分比。
表1
非小细胞肺癌的临床病理特征评估TMA中Nrf2和Keap1的表达
| 特性# | 总计（n=304） | 腺癌（n=190） | 鳞状细胞癌（n=114） |
|---|
| 平均年龄（年） | 66 | 65 | 68 |
| 性别 |
| 女性 | 157 | 113 | 44 |
| 男性 | 147 | 77 | 70 |
| 病理分期 |
| 我 | 191 | 127 | 64 |
| 二 | 58 | 24 | 34 |
| 三 | 46 | 32 | 14 |
| 四、 | 9 | 7 | 2 |
| 吸烟史† |
| 当前/以前 | 253 | 144 | 109 |
| 从未 | 50 | 46 | 4 |
为了确定核Nrf2表达与辅助化疗后结果之间的关系，我们选择了122例非小细胞肺癌肿瘤，63例接受了基于铂的辅助化疗的患者，以及同样数量的未接受任何辅助治疗的患者（n=59）(补充表1). 化疗方案包括卡铂联合多西他赛（n=9）、吉西他滨（n=8）、紫杉醇（n=32）或顺铂（n=1），要么单独使用，要么联合培美曲塞（n=4）、多西他赛尔（n=7）、足叶乙甙（n=1）。
细胞系和组织标本的免疫组织化学分析
使用市售抗Nrf2（稀释1:200，克隆H300；Santa Cruz Biotechnologies）、Keap1（稀释1:25；Proteintech）和NQO1（稀释1:1000，克隆A180；Novus Biological，Littleton，CO）的抗体进行免疫组化分析。使用自动化染色器（Dako，Inc.，Carpindia，CA）对FFPE组织的5μM厚切片进行免疫组织化学染色。将组织切片脱蜡并水合，在pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液中在脱蜡室（121℃×30秒，90℃×10秒）中进行抗原提取，并在Tris缓冲液上清洗。在环境温度下用3%H进行30分钟的过氧化物封闭2哦2用于Nrf2的蒸馏水和用于Keap1和NQO1的甲醇。在室温下用一级抗体培养载玻片，并用Tris缓冲液清洗，然后用生物素标记的二级抗体培养15分钟，用链霉亲和素过氧化物酶培养15分钟（LSAB系统，Dako）培养Nrf2，用Envision Dual-Link系统-辣根过氧化物酶培养30分钟（Keap1和NQO1）。用0.5%的3,3′-二氨基联苯胺进行染色，用咪唑-HCl缓冲液（pH 7.5）新鲜制备，含有过氧化氢和抗菌剂（Dako）5分钟，然后用苏木精复染，脱水，贴装。
为了在Western blot和免疫组织化学分析中确定Nrf2和Keap1表达之间的关联，我们从4个细胞系（A549、H460、H1993和BEAS2B）制备了FFPE细胞颗粒。在免疫组化分析中，使用颗粒作为阳性对照。作为阴性对照，我们使用阳性对照切片，用通用阴性对照抗兔抗体（Dako）代替一级抗体。
免疫组织化学表达由两名病理学家（L.S.和I.W.）联合量化。使用4值强度评分（0、1+、2+或3+）和反应程度百分比（0%–100%）量化核Nrf2、细胞质Keap1和细胞质NQO1的表达。通过乘以强度和反应性延伸值（范围0-300）获得免疫组织化学表达分数，并使用这些表达分数确定表达水平。核Nrf2阳性表达被定义为得分>0。细胞质Keap1表达低或缺失被定义为得分<150，这表示所有非小细胞肺癌TMA病例的平均表达。高细胞质NQO1表达被定义为得分>130，这表示使用全组织切片评估的非小细胞肺癌的中位数表达。
表皮生长因子受体和KRAS公司突变分析
第18–21外显子表皮生长因子受体和第1外显子KRAS公司如前所述，使用基于内含子的引物进行聚合酶链反应（PCR）扩增(18,19)从显微解剖的FFPE组织中提取DNA样本。所有PCR产物均采用PRISM染料终止环测序法直接测序（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）。如前所述，所有序列变异均通过至少两个独立显微解剖的独立PCR扩增得到确认，并在两个方向上进行测序(18,19).
NFE2L2型和KEAP1公司肿瘤标本的突变分析
为了确定NFE2L2型（外显子2）和KEAP1公司（外显子2至5）基因，我们从TMA组中选择了31个非小细胞肺癌肿瘤，从新鲜肿瘤组织中提取的DNA可用。免疫组化分析显示，20例肿瘤（9例腺癌和11例鳞状细胞癌）有核Nrf2表达，11例（8例腺癌、3例鳞癌）无核Nrf表达。在PCR扩增后使用直接测序法进行突变分析NFE2L2型和KEAP1公司基因。对于NFE2L2型，利用Primer3软件设计了外显子2的基于内含子的PCR引物（正向5′-CACACATACAGTGCATA-3′；反向5′-AGGCAAAGCTGAACTCAAA-3′）(网址：http://frodo.wi.mit.edu/)由Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）合成。PCR循环条件为94°C（15分钟），共1个循环；94°C（30秒）、58°C（45秒）和72°C（1分钟），循环45次；并最终延长72°C（5分钟）。对于KEAP1公司如前所述，我们使用基于内含子的PCR引物序列分析了外显子2–5(5). 所有PCR产物均使用Applied Biosystems PRISM Aldrich（密苏里州圣路易斯）染料终止剂循环测序方法直接测序。所有序列变异均通过独立PCR扩增进行确认，并在两个方向上进行测序。
统计分析
使用描述性统计和频率表总结临床病理数据。采用Wilcoxon秩和检验和Kruskal-Wallis检验比较不同预后因子水平之间的生物标志物表达。我们确定了未接受辅助或新辅助化疗的I期或II期非小细胞肺癌患者以及已接受或未接受基于铂的辅助治疗的I–IIIB期疾病患者的5年RFS和OS率以及Nrf2和Keap1表达之间的关系。RFS被定义为从手术到复发或研究结束的时间，OS被定义为手术到死亡或研究结束。核Nrf2表达的截止值为得分>0，定义为阳性染色；细胞质Keap1的截止值为150，代表平均得分。使用Kaplan-Meier方法估计生存曲线。使用单变量和多变量Cox比例风险模型评估协变量对RFS和OS率的影响。双面P（P）值<0.05被认为具有统计学意义。所有分析均使用SAS（9.1版，北卡罗来纳州Cary）和S-plus（8.0版，西雅图，华盛顿州）软件进行。
结果
通过Western blot分析和免疫组化结果验证Nrf2和Keap1蛋白在细胞系中的表达
我们在Western blot分析中发现，NSCLC细胞系A549和H460细胞核中的Nrf2蛋白水平高于细胞质(补充图1). BEAS2B支气管上皮细胞系在细胞核和细胞质中的Nrf2表达水平均显著低于恶性细胞系。这些发现与之前报告的数据一致(5). 相比之下，BEAS2B细胞在细胞核和细胞质中的Keap1表达水平显著高于所评估的NSCLC细胞系，并且在所有细胞中，Keap1主要在细胞质中表达(补充图1). 在Western blot分析中，H1993细胞株与BEAS2B的Nrf2和Keap1表达模式相似，这与H1993的杂合性一致KEAP1公司突变(5). 我们评估了FFPE细胞颗粒中Nrf2和Keap1的免疫组织化学表达，发现其表达模式与Western blot分析相似(补充图1). 在FFPE肿瘤标本中，在恶性肿瘤细胞中，我们发现Nrf2的核和细胞质表达以及Keap1的细胞质表达(). 为了研究这些标记物在非小细胞肺癌TMA和整个切片组织标本中的表达，我们重点关注核Nrf2的表达，因为这是被认为具有生物活性的亚细胞位置(5)和细胞质Keap1的表达，因为它是FFPE组织标本中在恶性肿瘤细胞中检测到的唯一表达。
照片显示为阳性(蓝色箭头)核Nrf2表达阴性；非小细胞肺癌组织标本中缺少、低和高细胞质Keap1表达：鳞状细胞癌(A类,C类到E类)和腺癌(B类和F类)（放大倍数，x100，除C类x200）。
非小细胞肺癌TMA中Nrf2和Keap1的免疫组织化学表达及其与临床病理和遗传特征的关系
我们使用表达水平和评分测定了304例TMA肿瘤中细胞核Nrf2和细胞质Keap1蛋白的表达。在26%的非小细胞肺癌中检测到核Nrf2阳性表达（得分>0），阳性病例的频率显著(P（P）<0.001）鳞状细胞癌（38%）高于腺癌（18%）(). 在大多数阳性肿瘤中（49/77，64%），Nrf2的核表达是轻微的，在其余的病例中是中度到重度的。另一方面，在56%的非小细胞肺癌中观察到细胞质Keap1表达为阴性或低水平（得分<150）。腺癌中Keap1低表达或阴性表达的频率（62%）显著高于鳞癌（46%）(P（P）= 0.0057). 总的来说，核Nrf2的表达在统计学上是相关的(P（P）= 0.0041;第页=0.17）在所有非小细胞肺癌中细胞质Keap1表达较高。然而，我们发现了Nrf2阳性且Keap1表达低或缺失的肿瘤亚群（295例中的39例[13%]），包括鳞状细胞癌（111例中的19例[17%]）和腺癌（184例中的20例[11%]）。Nrf2和Keap1的表达与性别、吸烟史或病理肿瘤分期（分期I或II vs.III或IV；数据未显示）无关。
表2
根据非小细胞肺癌组织学类型和化疗治疗的核Nrf2表达
| 样品类型 | 腺癌 | 鳞状细胞癌 | 非小细胞肺癌 | P（P）价值# |
|---|
| 正Nrf2†/合计（%） | 正Nrf2†/合计（%） | 正Nrf2†/合计（%） |
|---|
| 组织芯片 | 34/188 (18%) | 43/112 (38%) | 77/300 (26%) | <0.0001 |
| 整个部分 |
| 新佐剂治疗 | 4/20 (20%) | 3/6 (50%) | 7/26 (27%) | 0.2929 |
| 佐剂治疗 | 13/35 (37%) | 14/28 (50%) | 第27页（43%） | 0.3055 |
| 未处理佐剂 | 10/27 (37%) | 10/32 (31%) | 20/59 (34%) | 0.6399 |
在腺癌中，表皮生长因子受体和KRAS公司172例中23例（13%）和171例中28例（16%）分别检测到突变。有趣的是，没有表皮生长因子受体突变型腺癌表达Nrf2，而表皮生长因子受体野生型肿瘤表达核Nrf2；这种差异具有统计学意义(P（P）=0.009). 尽管表皮生长因子受体非吸烟者肿瘤中的突变（13/40，33%）明显高于吸烟者（10/130，8%），23例吸烟患者的吸烟状态分布表皮生长因子受体突变和Nrf2表达缺失相似：10名吸烟者（43%）和13名非吸烟者的（57%）。细胞质Keap1表达与表皮生长因子受体突变状态。这2个标记物的表达与肿瘤之间没有相关性KRAS公司突变。
NFE2L2型和KEAP1公司突变分析
在NSCLC肿瘤中，我们研究了这两个基因在位点的突变状态(NFE2L2型外显子2；和，KEAP1公司，外显子2至5）之前报告为肺癌突变(5,12,13). 为了将这两个基因的突变状态与Nrf2的激活联系起来，我们选择了20个肿瘤，它们具有从新鲜组织中提取的DNA，以及核Nrf2免疫组织化学表达；作为对照，我们使用了11个缺乏核Nrf2表达的肿瘤。NFE2L2型29例成功检测的肿瘤中有2例发生突变。这两个突变均位于外显子2的密码子28（ACA到ATA；苏氨酸替代异亮氨酸）和密码子79（GAG到CAG；谷氨酸替代谷氨酰胺）。这2例对应于核Nrf2表达和细胞质Keap1高表达的鳞状细胞癌。KEAP1公司31例肿瘤中仅1例检测到突变（外显子2～5）。这是一例核Nrf2表达和低细胞质Keap1表达的鳞状细胞癌中密码子537（外显子5）中的一个非义突变（TAC到TAA；酪氨酸替代终止密码子）。
全组织切片分析非小细胞肺癌肿瘤及相应正常邻近组织中Nrf2、Keap1和NQO1的免疫组织化学表达
为了确定肿瘤组织中核Nrf2和细胞质Keap1表达的异质性，我们使用从TMA中包括的36个非小细胞肺癌（18个腺癌和18个鳞状细胞癌）获得的全组织切片来评估这两种标记物的表达，其中19个Nrf2阳性，17个阴性。在整个阳性肿瘤中，核Nrf2的表达是高度异质的，有14个（78%）在5%-30%的恶性细胞中表达核Nrf2。有趣的是，在TMA分析中Nrf2阴性的17个肿瘤中，只有1个在整个组织切片检查中呈阳性。
为了确定非小细胞肺癌恶性细胞中Nrf2表达的生物学效应，我们研究了核Nrf2的表达与NQO1免疫组织化学蛋白表达的相关性，Nrf2是一种受Nrf2转录调控的基因(5,10)，使用具有可用的全组织切片的子集（n＝30）NSCLC。有趣的是，16例核Nrf2阳性病例中有12例（75%）表达了高水平的细胞质NQO1，而12例核Nrf2阴性肿瘤中只有3例高水平表达了该蛋白。同样，表达核Nrf2的肿瘤也有显著的(P（P）=0.0211）与Nrf2阴性肿瘤相比，NQO1表达得分较高（平均176.3）（平均92.9）。
另一方面，我们发现无论表达强度如何，细胞质Keap1在整个肿瘤中都是均匀表达的。36例肿瘤中只有4例（11%）表现出明显的小范围恶性细胞（定义为肿瘤切片的10%-30%）缺乏细胞质Keap1表达。
127例（5%）化疗初治非小细胞肺癌全组织切片中，有6例在癌旁正常支气管上皮细胞核中检测到Nrf2表达，其中19例为Nrf2阳性肿瘤。正常上皮细胞核Nrf2表达的6例患者在相应的肿瘤中未表达该标记物。正如预期的那样，在所有25例化疗初发的非小细胞肺癌中，均在正常支气管上皮中发现Keap1细胞质表达。在肿瘤和相应的正常支气管上皮中检测到类似的细胞质Keap1表达得分（平均得分=126.0，SD=81.8）。
利用TMA标本研究Nrf2和Keap1表达与非小细胞肺癌患者预后的关系
我们确定了未接受新辅助或辅助治疗的I期和II期非小细胞肺癌患者的核Nrf2和细胞质Keap1表达与RFS和OS率之间的关系。在NSCLC患者（n=235）中，核Nrf2阳性表达（得分>0）与单变量分析中的5年RFS和OS较差以及多变量Cox模型分析中的OS较差相关(P（P）=0.0139; 危险比[HR]=1.75；95%置信区间[95%CI]，1.12–2.73），根据手术年龄、吸烟史和病理分期进行调整()(). 根据组织学肿瘤类型，未发现核Nrf2表达与预后之间的关联(补充图2).
A、，五年操作系统和B类所有非小细胞肺癌患者的核Nrf2蛋白表达为RFS评分。C类、五年操作系统和D、，鳞状细胞癌患者细胞质Keap1蛋白表达的RFS率。E、，五年操作系统和F类在所有NSCLC患者中，RFS由核Nrf2和低细胞质Keap1蛋白表达分级。(E类、事件；和N个，案例总数）。
表3
非小细胞肺癌和鳞癌患者5年总生存率（OS）和无复发生存率（RFS）的多变量Cox模型。
| 变量 | 心率（95%置信区间） | P（P）价值 |
|---|
| OS，Nrf2表达，非小细胞肺癌 |
| 手术年龄（每增加1年） | 1.067 (1.043–1.092) | <0.0001 |
| 阶段（II与I） | 2.096 (1.332–3.299) | 0.0015 |
| 吸烟（当前和以前吸烟vs.从不吸烟） | 2.476 (1.069–5.736) | 0.0331 |
| 核Nrf2（正与负） | 1.747 (1.120–2.726) | 0.0139 |
|
| OS，Keap1表达，鳞状细胞癌 |
| 手术年龄（每增加1年） | 1.054 (1.020–1.090) | 0.0020 |
| 阶段（II与I） | 1.876 (1.033–3.409) | 0.0389 |
| 细胞质Keap1（得分<150 vs.≥150） | 2.087 (1.134–3.841) | 0.0181 |
|
| OS、Nrf2和Keap1表达，非小细胞肺癌 |
| 手术年龄（每增加1年） | 1.063 (1.039–1.087 | <0.0001 |
| 阶段（II vs.I） | 2.093 (1.332–3.290) | 0.0014 |
| 吸烟（当前和以前吸烟vs.从不吸烟） | 2.639 (1.134–6.142) | 0.0244 |
| Nrf2/Keap1状态（阳性Nrf2和Keap1<150 vs.其他） | 1.966（1.167–3.313） | 0.0111 |
|
| RFS、Nrf2和Keap1表达，非小细胞肺癌 |
| 手术年龄（每增加1年） | 1.043 (1.023–1.064 | <0.0001 |
| 阶段（II vs.I） | 1.962 (1.296–2.970) | 0.0014 |
| 吸烟（当前和以前吸烟vs.从不吸烟） | 2.115 (1.064–4.203) | 0.0325 |
| Nrf2/Keap1状态（阳性Nrf2和Keap1<150 vs.其他） | 1.688 (1.045–2.727) | 0.0325 |
Keap1的表达与所有非小细胞肺癌患者的预后没有相关性(补充图3). 然后，我们通过个体组织学肿瘤类型检查了Keap1对患者预后的影响。我们发现，单变量分析中Keap1表达阴性和低细胞质表达（分数<150）与鳞癌患者5年RFS和OS恶化相关，而多变量Cox模型分析中OS恶化相关(P（P）=0.0181; HR=2.09；95%CI，1.13–3.84），根据手术和病理阶段的年龄进行调整() (). 在腺癌患者中，Keap1的表达与预后没有相关性(补充图3).
Nrf2阳性且Keap1表达低或缺失的NSCLC肿瘤亚群（295例中的39例[13%]）与OS恶化显著相关(P（P）=0.0111; HR=1.97；95%置信区间1.17–3.31）和RFS(P（P）=0.0325; HR=1.69；经手术年龄、病理分期和吸烟史校正后，单变量和多变量分析的95%可信区间为1.04–2.73）() ().
新辅助治疗的非小细胞肺癌中Nrf2和Keap1的表达
为了研究新辅助的铂类化疗是否导致非小细胞肺癌（NSCLC）肿瘤中核Nrf2表达增加，我们检测了26例手术切除肿瘤中Nrf2和Keap1的表达，这些肿瘤均来自术前接受铂类化疗的患者。7例（27%）肿瘤中发现核Nrf2表达（得分>0）()但18例（69%）检测到Keap1表达阴性或低表达（分数<150）。这些标志物的表达与化疗对肿瘤组织的组织学影响无关，包括肿瘤坏死、纤维化和存活恶性细胞的百分比（数据未显示）。
辅助化疗患者中Nrf2表达与预后的关系
为了评估Nrf2在以铂为基础的化疗反应中的作用，我们测定了122例手术切除的NSCLC肿瘤（I至IIIB期）的整个组织切片中的核Nrf2表达以及RFS和OS率。这些样本来自63名接受过辅助化疗的患者（35例腺癌和28例鳞状细胞癌）和59名未接受过辅助治疗的患者（27例腺癌和32例鳞状细胞癌）。在这些非小细胞肺癌中，47例（39%）检测到核Nrf2的总表达().
由于在TMA标本中检测到的鳞状细胞癌和腺癌之间的核Nrf2表达频率存在显著差异，我们分别评估了两种肿瘤组织学中佐剂治疗患者中Nrf2的表达预测效果。在接受辅助治疗的鳞状细胞癌患者中，核Nrf2表达（得分>0）与单变量Cox模型分析中的RFS恶化相关(P（P）=0.0410; HR=3.37；95%置信区间，1.05–10.81）(补充图4); 然而，这种关联在多变量分析中并不显著(P（P）=0.0618，心率=3.11，95%置信区间=0.95–10.20）。在同一肿瘤类型中，接受辅助化疗的患者中，核Nrf2表现出恶化OS的趋势；在单变量Cox模型分析中，这种关联不显著(P（P）=0.0590; HR=3.52；95%CI，0.95-13.04）和多变量分析(P（P）=0.092）。在未接受辅助治疗的鳞状细胞癌患者中，Nrf2的表达与RFS或OS率无关(补充图4).
在未接受辅助治疗的腺癌患者中，Nrf2与RFS在统计学上相关(P（P）=0.0092），尽管在多变量分析中未发现Nrf2表达与RFS或OS率之间存在关联。有趣的是，在腺癌患者中，Nrf2的核表达与接受辅助化疗的患者的预后无关。
讨论
在肺癌中，恶性细胞中的Nrf2激活与肿瘤进展和化疗耐药相关(8,11,20–22). 由于细胞保护基因的反式激活，高水平的核Nrf2促进癌细胞生长和细胞存活(8,20,21). 在非小细胞肺癌中，核Nrf2的过度表达主要归因于遗传和表观遗传改变及其阻遏物Keap1功能的丧失(5,21,23). 在NSCLC中，KEAP1公司在50%（n=12）的细胞系中检测到外显子2-6的突变(5)肿瘤的8%（n=65）和19%（n=54）(5,21). 启动子超甲基化KEAP1公司在所有肺癌细胞系（3/3）和评估的肿瘤组织（5/5）中发现(11). 此外，Nrf2基因的突变，NFE2L2，影响Keap1结合位点编码区的基因被认为是肺癌中Nrf2活化的另一种机制(12)，但是NFE2L2型只有2%（85个中的2个）的肺癌细胞株和8-11%的肺癌肿瘤标本中发现了突变，主要发生在有吸烟史的患者和鳞状细胞癌组织学类型的患者中(12,14).. 尽管有所有这些最新发现，但对Nrf2活化和Keap1表达缺失的非小细胞肺癌的特征以及Nrf2和Keap2在以铂为基础的化疗反应中的作用尚不清楚。
我们对FFPE NSCLC肿瘤中Nrf2和Keap1的表达进行了全面的免疫组化分析。我们使用了一种经验证的方法，在一组已知Nrf2和Keap1表达的非小细胞肺癌细胞系中检测了这两种抗体(5)对FFPE细胞颗粒进行Western blot分析和免疫组织化学分析。在我们的细胞系中，Nrf2和Keap1在蛋白质印迹分析中的蛋白质表达模式和亚细胞定位与先前报道的数据一致(5)Western blot分析发现的表达与细胞系颗粒中的表达一致。
在我们对TMA标本的研究中，核Nrf2在非小细胞肺癌亚群（26%）中表达，鳞状细胞癌（38%）比腺癌（18%）更常见。据我们所知，只有一篇关于Nrf2在肺癌中的免疫组织化学表达的报道；对I期非小细胞肺癌全组织切片的评估显示，62%（55/89）的肿瘤表达核Nrf2(24). 虽然我们无法从这份报告中获得详细信息(24)，这项研究似乎与我们用于评估组织标本中Nrf2表达的免疫组织化学方法（包括量化方法）存在显著差异。我们研究的一个有趣的观察结果是，核Nrf2的表达频率在表皮生长因子受体野生型（21%）腺癌比突变型（0%）腺癌多，这种相关性与患者吸烟史无关。尽管表皮生长因子受体评估的突变肿瘤相对较小，这一发现具有潜在的意义。据我们所知，这一关联以前没有报道过，值得进一步研究。我们的观察结果与发现一致表皮生长因子受体在接受化疗（卡铂和紫杉醇）的晚期非小细胞肺癌患者中，无论是否使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂（埃洛替尼），突变都与更好的生存率相关(15). 我们推测核Nrf2表达的缺失表皮生长因子受体突变型非小细胞肺癌可能有助于以铂为基础的化疗。
Nrf2可以通过多种机制激活，包括基因突变(NFE2L2型)影响Keap1-binding现场(12,14). 在我们的NSCLC样本中，外显子2NFE2L2型编码Nrf2蛋白Keap1-binding位点区域的突变很少被检测到，发生在所检测的29个肿瘤中的2个（7%）。有趣的是，这两种肿瘤都是鳞状细胞癌，表达核Nrf2，Keap1细胞质表达水平较高。其他NFE2L2型对肺癌进行了突变分析；他们报告称，8-11%的非小细胞肺癌患者外显子2发生突变，包括我们研究中检测到的两种突变，它们与肿瘤鳞状细胞癌组织学和患者吸烟史有关(12,14).
我们对整个组织学非小细胞肺癌切片的分析表明，肿瘤组织中的核Nrf2表达是异质性的，涉及少量（5%至30%）恶性细胞。尽管核Nrf2在肿瘤细胞中的表达具有异质性，但我们在36例受检患者的整个组织切片中发现Nrf2表达与相应的TMA组织核心之间存在关联。在我们的非小细胞肺癌亚群中，核Nrf2的表达与细胞质NQO1蛋白之间的相关性表明，Nrf2在恶性细胞的细胞核中具有生物活性。NQO1号机组该基因受Nrf2转录调控，正如预期的那样，与缺乏核Nrf2的肿瘤相比，显示核Nrf1的肿瘤中NQO1蛋白表达水平更高(5,10). 据报道，核Nrf2在其他上皮性肿瘤中的表达频率不同（范围为54%至92%），包括头颈部鳞状细胞癌(25)和胆囊癌(13).
Keap1是Nrf2的主要细胞质阻遏物(23,26–28). 我们的研究是首次报道确定非小细胞肺癌细胞质Keap1低表达或缺失的频率及其与肿瘤临床病理特征的相关性。Keap1低表达或缺失在非小细胞肺癌中常见（56%），主要发生在腺癌中。然而，我们只确定了1个KEAP1公司31例肿瘤中的突变（外显子2-5），包括20例核Nrf2表达，表明KEAP1公司突变不是蛋白质丢失或减少的主要机制。我们的发现与之前报道的出版物不同KEAP1公司两个非小细胞肺癌队列中8%和19%的突变，主要是腺癌（26%和30%）(5,21). 我们发现核Nrf2和细胞质Keap1的表达呈显著正相关，并且我们研究中只有13%的肿瘤Keap1和核Nrf1表达低或缺失，这表明其他机制与Keap1失活无关，促进了Nrf2核定位和随后的激活。目前很少有人提出激活Nrf2的替代机制，包括Nrf2蛋白被许多蛋白激酶磷酸化，包括蛋白激酶C、细胞外调节激酶、Jun N末端激酶和磷脂酰肌醇激酶(7). 此外，最近有证据表明，某些蛋白质基序的存在决定了Nrf2的亚细胞定位(29). Nrf2蛋白具有核输出信号（NES）基序，将蛋白质从细胞核运输到细胞质；以及将蛋白质从细胞质运输到细胞核的核定位信号（NLS）基序。有人认为，这两种驱动力的净结果对于调节Nrf2的亚细胞定位很重要，而不依赖于其与Keap1的相互作用(29).
所有非小细胞肺癌患者的核Nrf2表达、鳞状细胞癌患者的Keap1低表达或缺失以及核Nrf1低表达和Keap1缺失的非小细胞肝癌亚群与不良预后相关。不管导致肿瘤细胞核Nrf2活化的机制如何，有证据表明这种现象促进了恶性细胞的细胞存活(8,12,13,21)这可能解释了我们的非小细胞肺癌患者因手术切除而导致的低RFS和OS发生率。我们发现Keap1表达水平低或缺失的患者生存率低，这表明这种假定的肿瘤抑制基因失活通过非Nrf2介导的机制影响肿瘤的生长和进展。这些未知机制之一可能涉及其他具有抗凋亡和增殖功能的Keap1结合蛋白(30–32)，包括磷酸甘油变位酶家族成员5(31)，核癌蛋白原胸腺肽α(30)和胎儿Alz-50反应性克隆1蛋白(32). 除了一项肾细胞癌研究表明Keap1过表达与更晚期的肿瘤分期和较差的总生存率有关外，以前在人类上皮肿瘤中还没有报道过Keap1与患者预后之间的关系(33).
有研究表明，导致肿瘤中Nrf2过度表达的Nrf2/Keap1通路的异常通过促进肿瘤细胞存活和增殖而诱导基于铂的化疗抵抗(5–8). 在非小细胞肺癌细胞系中，Nrf2下游基因的上调在铂化疗耐药中起着关键作用，主要是因为参与药物外排系统的基因和抗氧化蛋白（包括谷胱甘肽、硫氧还蛋白和NQO1）的转录增加(20,24,34). 此外在体外和体内非小细胞肺癌模型表明，RNAi抑制Nrf2表达可抑制肿瘤生长并诱导对铂类化疗药物的敏感性(8,20). 我们假设新辅助铂类化疗会导致NSCLC肿瘤中Nrf2核表达增加；然而，我们发现在化疗初治和化疗治疗的肿瘤中，包括那些病理特征与新辅助化疗无反应相关的肿瘤，核Nrf2表达相似。
我们观察到，在接受手术和以铂为基础的辅助化疗的鳞状细胞癌患者中，核Nrf2表达与RFS和OS恶化之间存在关联。有趣的是，在腺癌患者中没有观察到这种现象。这些发现表明，正如在体外和体内非小细胞肺癌细胞系研究(8,20,22,34)，恶性肺癌细胞中核Nrf2的表达可能在鳞癌亚型的化疗耐药中起作用。然而，作为前瞻性临床试验的一部分，需要在更多的病例中进一步研究这些观察结果。重要的是，在晚期（转移性）肿瘤的非小细胞肺癌患者中，Nrf2表达作为与铂类化疗耐药相关的潜在预测标记物的作用需要得到解决，在这些患者中，可以建立Nrf2的表达与化疗反应之间更直接的关系。
总之，Nrf2表达增加和Keap1表达减少是手术切除的非小细胞肺癌中常见的异常，与临床结果相关。在我们的研究中，与相应的基因突变相比，Nrf2和Keap1蛋白的异常表达更为常见，这表明其他机制也参与了NFE2L2型和灭活KEAP1公司Nrf2的表达可能在鳞癌患者对以铂为基础的辅助化疗的反应中发挥作用。识别Nrf2异常表达的患者对于选择非小细胞肺癌的化疗可能很重要，我们的数据表明，当使用基于铂的化疗药物时，可以将Nrf2表达添加到潜在的分子标记物列表中，以测试非小细胞肝癌的个性化治疗。
补充材料
1
补充图1：Nrf2和Keap1蛋白表达的Western blot分析(A类)NSCLC细胞系和永生化支气管上皮BEAS2B细胞的免疫组化分析(B类).A类在Western blot分析中，Nrf2阳性的NSCLC细胞系在细胞核（N）中的表达高于细胞质（C）。聚ADP-核糖聚合酶表达（PARP）表明核蛋白裂解物。B类：显示核Nrf2表达的显微照片（放大x400）(蓝色箭头)在2个细胞系（H460和A549）中；其他2个细胞系（H1933和BEAS2B）仅表现为细胞质表达。显示细胞质Keap1的显微照片（放大倍数，x400）(红色箭头)在2个细胞系（H1933和BEAS2B）中表达；其他2种细胞系（H460和A549）显示出低的细胞质Keap1表达。
2
补充图2：A、，五年操作系统和B类腺癌患者核Nrf2蛋白表达对RFS评分。C类、五年操作系统和D、，鳞状细胞癌患者核Nrf2蛋白表达的RFS率。(E类、事件；和N个，案例总数）。
4
补充图3：A、，五年操作系统和B类根据所有非小细胞肺癌患者的细胞质Keap1蛋白表达对RFS进行评级。C类、五年操作系统和D、，腺癌患者细胞质Keap1蛋白表达的RFS率。(E类、事件；和N个，案例总数）。
5
补充图4：A、，核Nrf2蛋白表达鳞癌患者接受辅助治疗后五年RFS评分。B类，F未接受辅助治疗的核Nrf2蛋白表达鳞癌患者五年RFS评分。(E类、事件；和N个，案例总数）。
致谢
授权信息：本研究的部分资助来自国防部（W81XWH-07-1-0306，授予J.D.S.、J.D.M.和I.I.W.）、肺癌卓越研究专项拨款（P50CA70907，授予J.D.和I.I.W；P50CA058184，授予S.B.）和国家癌症研究所（癌症中心支持拨款CA-16672）。
缩写
- 编号2
- 核因子红细胞-2相关因子2
- 基亚1
- Kelch-like ECH-associated蛋白1
- 非小细胞肺癌
- 非小细胞肺癌
参考文献
1Jemal A、Siegel R、Ward E等人，《癌症统计》，2008年。CA癌症临床杂志。2008;58:71–96.[公共医学][谷歌学者] 2Herbst RS、Heymach JV、Lippman SM。肺癌。N英格兰医学杂志。2008;359：1367–80。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 三。Arriagada R、Bergman B、Dunant A、Le Chevalier T、Pignon JP、Vansteenkiste J.对完全切除的非小细胞肺癌患者进行基于顺铂的辅助化疗。N英格兰医学杂志。2004;350:351–60.[公共医学][谷歌学者] 4Bordoni R.共识会议：早期和中期非小细胞肺癌的多模式管理。肿瘤学家。2008;13:945–53.[公共医学][谷歌学者] 5Singh A，Misra V，Thimmulappa RK，等。非小细胞肺癌中KEAP1-NRF2的功能失调相互作用。公共科学图书馆-医学。2006;三：e420。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6Colburn NH，Kensler TW。靶向转录因子预防癌症——Nrf2病例。癌症预防研究（Phila Pa）2008;1:153–5.[公共医学][谷歌学者] 7Lau A，Villeneuve NF，Sun Z，Wong PK，Zhang DD。Nrf2在癌症中的双重作用。药物研究。2008;58:262–70. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 8Singh A，Boldin-Adamsky S，Thimmulappa RK，等。非小细胞肺癌中RNAi介导的核因子-红细胞-2-相关因子2基因表达沉默抑制肿瘤生长并提高化疗疗效。癌症研究。2008;68:7975–84. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 9Hayes JD、McMahon M.NRF2和KEAP1突变：癌症适应性反应的永久激活。生物化学科学趋势。2009;34:176–88.[公共医学][谷歌学者] 10Thimmulappa RK、Mai KH、Srisuma S、Kensler TW、Yamamoto M、Biswal S.通过寡核苷酸芯片鉴定由化学预防剂萝卜硫烷诱导的Nrf2调节基因。癌症研究。2002;62:5196–203.[公共医学][谷歌学者] 11Wang R，An J，Ji F，Jiao H，Sun H，Zhou D.人肺癌细胞系和肺癌组织中Keap1基因的高甲基化。生物化学与生物物理研究委员会。2008;373:151–4.[公共医学][谷歌学者] 12Shibata T，Ohta T，Tong KI，等。NRF2中的癌症相关突变损害了Keap1-Cul3 E3连接酶对其的识别并促进恶性肿瘤。美国国家科学院院刊。2008;105:13568–73. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 13Shibata T、Kokubu A、Gotoh M等。Keap1的基因改变导致胆囊癌中构成性Nrf2活化和化疗抵抗。胃肠病学。2008;135:1358–68. 68，e1-4。[公共医学][谷歌学者] 14Kim YR、Oh JE、Kim MS等。食管和皮肤鳞状细胞癌中的致癌NRF2突变。病理学杂志。2009;220:446–51.[公共医学][谷歌学者] 15Eberhard DA、Johnson BE、Amler LC等。表皮生长因子受体和KRAS的突变是单用化疗和联合厄洛替尼治疗的非小细胞肺癌患者的预测和预后指标。临床肿瘤学杂志。2005;23:5900–9.[公共医学][谷歌学者] 16Travis WD、Brambilla E、Muller-Hermelink HK、Harris CC。肺部肿瘤。收件人：Travis WD、Brambilla E、Muller-Hermelink HK、Harris CC、编辑。病理学和遗传学：肺、胸膜、胸腺和心脏肿瘤。里昂：国际癌症研究机构（IARC）；2004年，第9-124页。[谷歌学者] 17Sauter G，Simon R，Hillan K。药物发现中的组织微阵列。Nat Rev药物发现。2003年；2:962–72.[公共医学][谷歌学者] 18Shigematsu H，Lin L，Takahashi T，等。与肺癌中表皮生长因子受体基因突变相关的临床和生物学特征。美国国家癌症研究所杂志。2005;97:339–46.[公共医学][谷歌学者] 19Tang X，Shigematsu H，Bekele BN，等。肺癌患者组织学正常呼吸上皮中检测到EGFR酪氨酸激酶结构域突变。癌症研究。2005;65：7568–72。[公共医学][谷歌学者] 20Cho JM、Manandhar S、Lee HR、Park HM、Kwak MK。Nrf2-抗氧化系统在抗癌顺铂介导的细胞毒性中的作用：与癌细胞耐药性的关系。癌症快报。2008;260:96–108.[公共医学][谷歌学者] 21Ohta T，Iijima K，Miyamoto M等。Keap1功能的丧失激活Nrf2，并为肺癌细胞生长提供优势。癌症研究。2008;68:1303–9.[公共医学][谷歌学者] 22Kim HR，Kim S，Kim EJ，等。抑制Nrf2驱动的血红素加氧酶-1增强肺癌A549细胞对顺铂的化疗敏感性。肺癌。2008;60:47–56.[公共医学][谷歌学者] 23Padmanabhan B，Tong KI，Ohta T，等。肺癌中Keap1点突变引起的活性缺陷的结构基础。分子细胞。2006;21:689–700.[公共医学][谷歌学者] 24Kim JH、Bogner PN、Ramnath N、Park Y、Yu J、Park YM。过氧化物酶原1（而非NF-E2相关因子2）升高是I期非小细胞肺癌复发和生存率降低的独立预后因素。临床癌症研究。2007;13:3875–82.[公共医学][谷歌学者] 25Stacy DR、Ely K、Massion PP等。头颈部鳞癌中核因子E2 p45相关因子2（NRF2）的表达增加。头颈。2006;28:813–8.[公共医学][谷歌学者] 26Itoh K，Wakabayashi N，Katoh Y等。Keap1通过与氨基末端Neh2结构域结合，抑制Nrf2对抗氧化反应元件的核激活。基因发育。1999;13:76–86. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Dhakshinamoorthy S，Jaiswal AK。INrf2在抗氧化反应元件介导的NAD（P）H:quinone氧化还原酶1基因表达和抗氧化诱导中的功能特征和作用。致癌物。2001;20:3906–17.[公共医学][谷歌学者] 28Lo SC、Li X、Henzl MT、Beamer LJ、Hannink M。Keap1:Nrf2接口的结构提供了对Nrf2信令的机械洞察力。Embo J。2006;25:3605–17. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30Karapetian RN、Evstafieva AG、Abaeva IS等。核癌蛋白原胸腺肽α是Keap1的伴侣：对氧化应激保护基因表达的影响。分子细胞生物学。2005;25:1089–99. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 31Lo SC，Hannink M.PGAM5是一种Bcl-XL相互作用蛋白，是氧化还原调节Keap1依赖性泛素连接酶复合物的新底物。生物化学杂志。2006;281:37893–903.[公共医学][谷歌学者] 32Strachan GD、Ostrow LA、Jordan-Sciutto KL。胎儿Alz-50克隆1蛋白的表达诱导凋亡细胞死亡。生物化学与生物物理研究委员会。2005;336:490–5.[公共医学][谷歌学者] 33Ronkainen H，Vaarala MH，Kauppila S，等。BTB-Kelch型底物适配器蛋白免疫反应增强与肾细胞癌晚期和分化不良相关。Oncol代表。2009;21:1519–23.[公共医学][谷歌学者] 34Jozkowicz A，Was H，Dulak J.肿瘤中的血红素加氧酶-1：它是一个虚假的朋友吗？抗氧化氧化还原信号。2007;9:2099–117. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 
