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癌细胞。作者手稿；PMC 2011年6月15日发布。
以最终编辑形式发布为：
癌细胞。2010年6月15日；17(6): 547–559.
数字对象标识：2016年10月10日/j.ccr 2010年10月04日.026
预防性维修识别码：项目经理2901842
NIHMSID公司：美国国家卫生研究院206941
PMID：20541700

综合基因组和蛋白质组分析确定磅1肺转移瘤缺乏

朱利安·卡雷特罗，*,1,2 岛村武史，*,1,三 克拉丽萨·里科娃，4 秋季L.Jackson，5 马修·威尔克森，5 克里斯塔·博格曼，1 马修·巴特拉齐，1,6 本杰明·萨诺夫斯基，1,6 凯特·L·麦克纳马拉，1,6 凯萨琳·A·布兰德斯特，1,6 赞德拉·E·沃尔顿，1,6 丁磊谷，4 杰弗里·席尔瓦，4 凯瑟琳·克罗斯比，4 杰弗里·夏皮罗，1,三 米歇尔·迈拉，7 季洪斌，8 迭戈·H·卡斯特里隆，9 卡拉·F·金，10 卡洛斯·加西亚·埃切弗里亚，7 纳比尔·巴迪西，11 诺曼·夏普莱斯，5,12 尼尔·D·海斯，5 威廉·Y·金，5,12 杰弗里·恩格尔曼，三，11和王国健1,三，6
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关联数据

补充资料

总结

在小鼠中，磅1删除和激活喀斯特G12D系列结果肺肿瘤淋巴结外显率高，远处转移。我们分析了这些原发性和转移性从头开始的具有完整基因组和蛋白质组特征的肺癌，并已确定与Lkb1型侵袭性和转移性肺肿瘤的消失和进展。这些研究表明，SRC在Lkb1型缺乏原发性和转移性肺肿瘤，SRC、PI3K和MEK1/2的联合抑制导致协同肿瘤消退。这些研究表明，综合基因组和蛋白质组分析可用于识别可能作为治疗靶点的信号通路。

介绍

肺癌是全世界癌症死亡的主要原因。原发性人类肺癌的基因分析和基因表达谱分析已确定了几种与非小细胞肺癌（NSCLC）发生有关的异常信号通路(图片等，2006年). 虽然这些途径中的许多也可能参与非小细胞肺癌的进展和转移，但很明显，转移表型需要额外的途径扰动来调节细胞运动、细胞粘附、上皮-间充质转化（EMT）和细胞外基质重塑(Nguyen和Massague，2007年). 由于转移的发展在很大程度上导致了上皮癌的发病率和不治之症，因此迫切需要阐明这一生物学过程背后的事件。

由于缺乏匹配的原发性和转移性人类肺肿瘤，因此很难检测与非小细胞肺癌进展和转移相关的基因变化。利用基因工程小鼠进行的研究表明，某些致癌基因组合的激活足以引发肺部肿瘤(Engelman等人，2008年;Jackson等人，2001年;Ji等人，2006年a;Ji等人，2006年b)肿瘤进展需要额外的基因事件(Iwanaga等人，2008年;Jackson等人，2005年)或转移(Ji等人，2007年;Kim等人，2009年). 我们最近表明磅1抑癌基因喀斯特-驱动性肺肿瘤导致小鼠淋巴结和远处转移(Ji等人，2007年). 此外，我们和其他人已经表明LKB1号机组至少15-35%的非小细胞肺癌因点突变或缺失而失活KRAS公司和LKB1号机组在4-10%的非小细胞肺癌中观察到突变(Carretero等人，2004年;Koivunen等人，2008年;Ji等人，2007年;松本等人，2007年;Sanchez-Cespedes等人，2002年).

在人类中LKB1号机组结果出现了Peutz-Jeghers综合征，这是一种以肠错构瘤为特征的家族性癌症综合征，上皮癌（包括肺癌）风险增加(Hearle等人，2006年). 这个LKB1号机组该基因编码一种丝氨酸/苏氨酸激酶，可磷酸化多种底物，其中许多底物也是激酶(Alessi等人，2006年). 然而，确定了导致磅1损失尚待阐明。

确定参与肿瘤进展和转移的信号转导途径的改变磅1我们对原发性和转移性小鼠肺肿瘤的基因组和磷酸蛋白质组特征进行了无偏见的综合分析。

结果

磅1缺乏转移性肺肿瘤具有独特的基因表达变化

突变体的肺特异性激活喀斯特G12D系列支气管肺泡增生和低级别腺癌的结果(Jackson等人，2001年). 我们最近观察到磅1肿瘤抑制基因导致肺部肿瘤的组织学谱扩大，这些肿瘤具有很高的局部侵袭和转移倾向(Ji等人，2007年). 确定与肿瘤侵袭和转移进展相关的基因表达变化磅1-缺乏小鼠肺肿瘤，我们比较了9个喀斯特和9克拉/Lkb1原发性肿瘤和16例克拉/Lkb1转移（淋巴结和远处）。样本的无监督分层聚类显示了三个不同的聚类，分别对应于以下组：1）原发性肺肿瘤激活喀斯特G12D系列，2）激活的原发性肺肿瘤喀斯特G12D系列和磅1丢失，以及3）激活的肺肿瘤转移喀斯特G12D系列和磅1损失(图S1A).

为了更好地描述与磅1我们从小鼠肺肿瘤中获得的表达特征反映了Lkb1型通过比较原发性肿瘤的损失（Lkb1）喀斯特肿瘤转原发性克拉/勒克伯1肿瘤和转移瘤（Mets）的比较克拉/Lkb1原发性肿瘤克拉/Lkb1转移。我们使用了两类非配对差异表达分析和<0.01的错误发现率（FDR）。产生的“Lkb1”和“Mets”基因特征分别包含727和757个差异表达基因(图1A). 总的来说，这些结果表明磅1丢失在原发性癌症中诱导显著的转录改变，并且有进一步的基因表达改变，这些改变是淋巴结进展和远处转移的特征。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms-206941-f0001.jpg
转移的基因表达特征来自于喀斯特-驱动，磅1-缺陷型小鼠肺癌模型预测人类非小细胞肺癌的生存率

答：。生成转移的表达特征。克拉/Lkb1原发性肿瘤与克拉/Lkb1转移瘤采用两类非配对差异表达分析，假发现率（FDR）<0.01。共有757个独特的转录本被显著差异性地解除管制，并用于定义转移基因特征（Mets）。

B。Kaplan-Meier对Director's Challenge Consortium数据集（N=180）和Memorial Sloan Kettering Cancer Center数据集2（N=98）的人类肺部肿瘤进行分析，比较显示我们的小鼠Mets签名激活（红线）或失活（绿线）的肿瘤之间的总体生存率。红线=已激活Mets签名。绿线=已禁用Mets签名。

C、。通过基因集富集分析得出的相对富集分数的热图。肿瘤以列表示，基因特征以行表示（红色表示过度表达基因的显著富集；绿色表示未表达基因的明显富集；黑色表示不显著；p<0.05）。右侧面板显示了三类肿瘤中每一类肿瘤的总富集分数(克拉斯、克拉斯/Lkb1原发性肿瘤和克拉/Lkb1转移）。

另请参见表S1和图S1。

小鼠和人类数据集的跨物种比较验证了转移的表达特征作为人类非小细胞肺癌的预后

接下来，我们试图确定Mets信号是否能预测人类肺癌患者的临床结果。使用Mets签名中小鼠基因的人类同源序列，我们查询了两个公开可用的原发性非小细胞肺癌的基因表达数据集，对总生存率和组织学分级进行了注释（Director's Challenge Consortium数据集，Shedden等人，2008年)或无转移复发（MSKCC数据集2，Nguyen等人，2009年). 对这些人类非小细胞肺癌的基因表达谱进行查询，以确定是否存在Mets表达特征，如Mets特征中过度表达或表达不足基因的协调上调和下调所定义的。

与我们的Mets基因特征与转移倾向相关的观点一致，在这两个数据集中，表达Mets特征的肿瘤患者的生存率和转移发生率明显低于未表达Mets特征的肿瘤患者(图1B). 相反，通过比较生成的Lkb1签名喀斯特肿瘤至克拉/Lkb1原发性肿瘤，无预后价值（数据未显示）。这些数据表明，相同的基因表达在磅1该小鼠模型中的肿瘤转移缺陷准确地再现了与人类原发性非小细胞肺癌晚期不治之症发展相关的肿瘤转移，可能有助于预测早期肺癌患者。Lkb1信号和Mets信号在预测生存率方面的能力差异表明，原发性肿瘤中有一个细胞亚群注定要发生转移，但从整个肿瘤的表达分析中无法区分，或者在转移部位出现了额外的表达变化癌-癌细胞相互作用。最后，如所示图S1B，Mets特征的抑制成分与两种基因都突变的人类样本显示出强烈而显著的相关性KRAS公司和LKB1号机组在北卡罗来纳大学数据集中(Ji等人，2007年).

Lkb1型转移瘤缺陷导致EMT相关基因特征上调

致癌信号通路的激活已被证明可诱导广泛的基因表达变化，可用于生成基因表达或原基因特征(Nevins和Potti，2007年). 为了更好地理解该模型中肿瘤转移的生物学基础，我们将这些小鼠肺肿瘤转移过程中上调的基因与已知通路中特定改变相关的已知转录物列表进行了比较。通过基因集富集分析，我们确定了在我们的克拉/Lkb1相对于原发肿瘤的转移喀斯特和克拉/Lkb1肺肿瘤(Segal等人，2004年). 具体来说，一组精心策划的基因集(表S1)由分子特征数据库（MsigDB，宽带.mit.edu/gsea/msigdb)和那些从文献中收集的(Ben-Porath等人，2008年;图片等，2006年;科尔等人，2008年;Onder等人，2008年)使用Genomica分析工具（Genomica.weizmann.ac.il）查询我们的基因表达数据集。

在我们的数据集中，51个精心策划的与癌症相关的基因集中，有32个明显丰富且高度表达（p<0.05，FDR<0.05）克拉/勒克伯1相对于…的转移喀斯特和克拉/Lkb1原发性肺部肿瘤(图1C). 这包括一些与转移过程相关的基因特征，如局部粘附改变、EMT、TGF-β和β-catenin信号增加，以及胚胎干细胞表达特征和与ES细胞表型相关的转录因子，如TCF3和OCT4(Ben-Porath等人，2008年;图片等，2006年;科尔等人，2008年;Onder等人，2008年). 其中一些发现得到了验证。例如，标准EMT标记(Kalluri和Weinberg，2009年)通过RT-PCR验证了该签名中的波形蛋白、蜗牛、Twist1、N-钙粘蛋白、Acta2和纤维连接蛋白(图S1C). 多重微球试验证实了来自克拉/Lkb1转移(图S1D). 此外，免疫染色显示两种组织中都存在典型的EMT标记物，如波形蛋白和纤维连接蛋白克拉/Lkb1原发性和转移性肿瘤。(图S1E). 虽然这些致癌特征的成分在磅1-缺乏原发性肿瘤，其水平在磅1-转移瘤不足(图1C，图S1C、S1D和S1E). 这些结果表明，额外的分子事件与磅1在转移过程中无法最大限度地激活这些通路。

磷聚糖LKB1号机组-缺陷细胞识别SRC家族激酶的激活

为了补充我们的转录分析，我们评估了磅1影响酪氨酸激酶信号级联。我们假设如果磅1损失导致特异性酪氨酸激酶的显著激活，我们应该检测它们各自底物的磷酸化增加。为了补充对小鼠肿瘤的分析，我们生成了成对的LKB1号机组并控制BEAS-2B人支气管上皮细胞系中的敲除细胞(Reddel等人，1988年)用SV40大T抗原（分别为BEAS-2B-LKB1D和BEAS-2B-NT）和K-RAS公司突变体，LKB1号机组野生型NSCLC细胞系H358（H358-LKB1D和H358NT），此前已证明其不表达EMT标记(汤姆森等人，2008年) (图2A). 这些成对的人类细胞系，连同我们的小鼠肺原发性和转移性肿瘤，被用于使用先前描述的方法生成磷酸酪氨酸信号(Rikova等人，2007年). 具体来说，从细胞系或混合组织裂解物中提取的全细胞提取物（两个池，每个池中有三个肿瘤样本克拉斯、克拉斯/Lkb1原发性肿瘤，以及克拉/Lkb1转移瘤）用磷酸酪氨酸特异性抗体进行免疫沉淀，然后对免疫沉淀进行MS分析，以识别和量化磷酸肽。

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人细胞系和小鼠肿瘤的磷蛋白谱分析

答：。中鉴定的磷酸酪氨酸位点的维恩图克拉/Lkb1原发性与转移性小鼠肿瘤和表达shRNA至LKB1（LKB1D）或非靶向shRNA（NT）的等基因配对细胞系（NCI-H358和BEAS-2B）。Western blot显示LKB1敲除（LKB1D）在NCI-H358和BEAS-2B细胞中的有效性。括号中的红色数字表示每次比较中磷酸酪氨酸位点的不同增加或减少。

B。协调调节的LKB1依赖性磷酸酪氨酸位点表。列出了LKB1依赖的磷酸化酪氨酸位点的详细信息，这些位点在数据集中被协调调节，包括磷酸化蛋白、酪氨酸位点、对数热图2指示比较的比率（红色，正对数2比率；蓝色，负对数2比率），以及假定的上游激酶。GEP（基因表达谱）数据列显示了编码这些蛋白质的基因在克拉/Lkb1（初级或中级）与喀斯特小鼠肿瘤比较（红点=显著过表达，绿点=显著低表达，橙色点=无显著变化）。1从PhosphoELM、HPRD和Swissprot数据库获得的上游激酶；2从NetworKIN数据库获得的上游激酶。另请参见图S2。

我们在BEAS-2B、H358和小鼠肺部肿瘤中分别鉴定出441、259和363个磷酸酪氨酸位点，这些位点在缺乏LKB1的情况下富集(图2A). 发现其中41个受LKB1影响的酪氨酸磷酸化肽在所有3个数据集中重叠(图2A而另外26个肽和10个肽分别在BEAS-2B/小鼠肿瘤和H358/小鼠肿瘤数据集之间重叠(图2A，集群B和C）。对已知磷酸化这些酪氨酸残基的假定上游激酶的检查表明，许多激酶与LKB1缺乏有关而被激活。这些分析指出了SRC活化的一个特别重要的作用，在我们的数据集中，SRC活化不仅高度磷酸化，而且被预测为40个差异磷酸化蛋白的13个位点的上游激酶(图2B). 此外，克拉/Lkb1通过GSEA分析评估，原发性肿瘤和转移瘤显示Src底物信号的显著过度磷酸化(图S2A).

非受体酪氨酸激酶SRC和粘着斑激酶被激活LKB1号机组损失

我们推测，基因表达和磷酸蛋白质组学数据集的整合将是一种强有力的方法，可以识别磅1缺乏肺癌。我们注意到，病灶黏附激活的基因特征在肿瘤转移中高度富集克拉/Lkb1肺肿瘤(图1C). 局灶性黏附是一种动态亚细胞结构，已知其可介导细胞与细胞外基质的黏附，由50多种蛋白质组成，包括局灶性粘着激酶（FAK或PTK2）、帕罗西林和SRC(Burridge等人，1997年;Playford和Schaller，2004年;Yeatman，2004年). 如上所述，SRC激活是我们磷酸化蛋白质组分析中最显著的特征，也有强有力的证据表明FAK激活。为了更好地整合我们检测LKB1缺失对局灶性粘附通路影响的数据，在基因表达或酪氨酸磷酸化水平上调的通路组分分别呈黄色和红色，并在KEGG通路图上显示(图3). 结果显示，通过以下途径，SRC、FAK及其下游通路的激活趋于一致磅1粘着调节因子在糖尿病发病机制中的表达和活性缺失及隐含改变磅1缺乏肺癌。

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病灶粘连受损克拉/Lkb1肿瘤和转移

我们的基因组和蛋白质组分析的大多数相关结果都描述在焦点粘附KEGG通路上。在磷聚糖分析比较中，红色标记的蛋白质被过度磷酸化克拉/Lkb1原发性肿瘤和转移性肿瘤内磷蛋白分析的比较克拉/Lkb1原发性肿瘤和转移瘤喀斯特单独肿瘤。(图2B). 在基因表达谱比较中，发现标记在橙色中的蛋白质过度表达（或其特征被丰富）克拉/Lkb1原发性肿瘤和转移瘤喀斯特单独肿瘤(图1A和1C).

SRC和FAK的激活通过RhoA的下调导致局部黏附分解和翻转，导致细胞运动增强(Arthur等人，2000年;Yeatman，2004年). 鉴于细胞运动和迁移在转移过程中的关键作用，我们接下来确定LKB1是否调节这些关键的局灶粘附动力学成分。为此，使用针对SRC和FAK中激活的酪氨酸磷酸化位点的抗体（分别为Y416和Y576/577）对表达对照shRNA（NT）或针对LKB1（A、B、C和D）的四种不同shRNA序列的H358细胞的全细胞提取物进行免疫印迹。如所示图4ALKB1敲除导致局灶黏附复合体激活，特别是SRC和FAK。此外，与LKB1作为AMPK/TSC/mTORC1轴调节器的既定作用一致(Carretero等人，2007年;Shaw等人，2004年)，H358LKB1号机组-缺陷细胞显示AMPK（T172）增加，ACC（S79）磷酸化减少，S6（S240/S244）磷酸化增加(图S3A).

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LKB1敲除激活EMT标记物，即局部粘附动力学的介质，并增强细胞运动

答：。NCI-H358细胞的Western blot分析(LKB1号机组野生型，KRAS公司G12C突变体）感染慢病毒，慢病毒编码靶向LKB1或非靶向shRNA（NT）的4种不同序列的shRNA（A-D）。用LKB1特异性抗体或针对SRC（Total和Y416）、FAK（Totals和Y576）、paxillin（Total和Y118）、E-Caddherin和vimentin的酪氨酸特异性抗体模拟全细胞裂解物。α/β-肌动蛋白（actin）起到负荷控制作用。

B。在用移液管尖端受伤12小时后，NCIH358细胞汇合单层的划痕区域的代表性照片，这些细胞表达一种shRNA到LKB1（LKB1D）或一种非靶向shRNA（NT）。

C、。将表达shRNA至LKB1（LKB1D）或非靶向shRNA（NT）的NCI-H358细胞置于涂有基质凝胶的Boyden培养箱中，以10%FBS作为化学引诱剂，进行48小时的侵袭试验。数据以3个重复±SD的平均值绘制。

D。NCI-H358异种移植物的平均肿瘤体积测量。在裸鼠皮下培养人肺癌细胞NCI-H358，表达shRNA至LKB1（LKB1D）或非靶向shRNA（NT）。14天后测量肿瘤并计算肿瘤体积（误差棒=1 SD；n=5，p=0.043）。

E。NCIH358 NT和LKB1D异种移植物中人波形蛋白和人细胞角蛋白的免疫组织化学染色。另请参见图S3。

由于磷蛋白聚糖和Western blot分析检测到一个磷酸化位点（Y416），该位点是所有SRC家族激酶（SFKs）共有的，包括SRC、FYN、LYN、LCK、HCK FGR和YES，因此我们使用Luminex微珠分析询问了NCI-H358和A549细胞系中受LKB1缺失影响的SFKs的磷酸化状态。如所示图S3B和S3CH358细胞优先激活SRC和LYN，而A549仅激活SRC。在这两种情况下，LKB1的缺失促进了SFK的激活。此外，对来自H358-LKB1D和H358-NT细胞的蛋白裂解产物以及带有位点特异性磷酸化抗体的蛋白阵列的分析进一步验证了通过MS分析获得的SRC、FAK和其他靶点克拉/Lkb1小鼠模型(图S3D).

SRC和FAK的这些变化表明粘附受损，细胞运动增强(Yeatman，2004年). 评估LKB1号机组影响这些NSCLC细胞的运动，我们进行了划痕试验。H358细胞LKB1号机组敲除（LKB1D）比对照细胞（NT）更快地迁移到划痕空间，而两种细胞系的增殖和生存能力相同在体外(图4B，图S3E). LKB1损失也增加在体外通过Boyden小室试验评估H358细胞的侵袭性(图4C). 因此LKB1号机组似乎增加了参与黏附动力学的几个关键蛋白的激酶活性，并促进细胞运动和侵袭。

我们还确定了非小细胞肺癌细胞中LKB1缺失的后果体内为此，将H358-LKB1D和H358-NT细胞作为裸鼠皮下异种移植瘤生长，并在植入后两周测量平均肿瘤体积。来源于H358 LKB1缺陷细胞的肿瘤明显大于那些表达非特异性shRNA的肿瘤，这表明细胞丢失LKB1号机组促进原发性肿瘤生长和转移(图4D). 用特异性识别人类（而非小鼠）抗原的抗体进行免疫组织化学（IHC）染色显示，H358-LKB1D异种移植物中的波形蛋白水平高于H358-NT肿瘤(图4E)与之前的结果一致，表明LKB1号机组促进EMT(图3A). 波形蛋白染色升高在肿瘤边缘特别明显，表明EMT在肿瘤边缘LKB1号机组缺乏的肿瘤细胞也可能与邻近基质细胞的信号有关(图4E). 与这些观察结果一致，没有LKB1的H358细胞（LKB1D）释放的TGF-β1/2明显多于H358对照细胞（NT），并且核β-连环蛋白在LKB1D中的积聚比在NT细胞中更普遍(图S3F和S3G). 这些观察结果支持了LKB1丢失在EMT中起重要作用的观点。

LKB1号机组丢失增加了细胞粘附和迁移对SRC和FAK信号的依赖性

我们的综合基因表达和磷蛋白聚糖结果表明，LKB1缺失可能通过激活SRC和FAK信号促进转移。转移是一个多步骤过程，涉及细胞与细胞外基质（ECM）成分的相互作用，增加细胞迁移和肿瘤侵袭(Mitra和Schlaepfer，2006年). 这些单独的过程可以通过SRC和FAK活动进行调节(Huveneers和Danen，2009年;Shibue和Weinberg，2009年). 我们假设，LKB1缺失诱导的SRC/FAK激活导致细胞粘附ECM对这些信号通路的依赖性增加。为了验证这个假设，5×105在含有SRC-家族激酶抑制剂达沙替尼或FAK抑制剂PF573228的情况下，将LKB1敲除或未敲除的细胞接种在涂有I型胶原、IV型胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白I、纤维蛋白原或BSA的组织培养孔上(Johnson等人，2005年;Slack-Davis等人，2007年). 在测试的ECM成分中，只有I型或IV型胶原能够促进H358细胞的粘附(图5A和数据未显示）。敲除H358细胞中的LKB1对H358与I型或IV型胶原的基线粘附没有明显影响。然而，达萨替尼或PF573228治疗H358的细胞导致细胞粘附的剂量依赖性降低，这在LKB1敲除的H358中更为显著(图5B). 当检测有或无LKB1表达的H358细胞Dasatinib和PF573228对细胞迁移的影响时，也得到了类似的结果(图5C). 这些观察结果支持这样的观点，即由于LKB1丢失而激活SRC和FAK，促进了细胞迁移、粘附细胞外基质成分以及迁移对这些信号通路的依赖。

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LKB1敲除与FAK和SRC抑制协同作用，防止NCI-H358细胞中胶原粘附和迁移

答：。将表达LKB1 shRNA或非特异性shRNA（NT）的指数生长NCI-H358细胞以5×10接种5在含有二甲基亚砜（对照）、10nM达萨替尼（SRC抑制剂）或100nM PF 573228（FAK抑制剂）的情况下，细胞被I型胶原、IV型胶原或BSA包裹，并粘附在基质上。90分钟后，洗去松散的细胞，固定并染色粘附细胞。

B。将表达针对LKB1的shRNA（LKB1D）或非特异性shRNA（NT）的NCI-H358细胞以1×105细胞/孔置于胶原I涂层的96孔板上，该板含有二甲基亚砜或增加浓度的达萨替尼或PF573228，并孵育90分钟。数据点表示与DMSO处理的细胞相比，标准化值的平均值，表示为粘附率的%，该值来自两个独立的实验，共进行了三次；误差条=SD。

C类将表达shRNA至LKB1（LKB1D）或非特异性shRNA（NT）的NCI-H358细胞接种于1×105细胞/孔延伸至24孔，细胞生长直至形成融合单层。用移液管尖端划伤单层，形成伤口，细胞在含有二甲基亚砜或达萨替尼或PF573228浓度增加的培养基中生长。在汇合单层损伤12小时后，测量伤口闭合度，并表示为原始伤口闭合度的%。数据以3个重复±SD的平均值绘制。

PI3K-mTOR、MEK和SRC家族激酶的联合抑制导致协同作用体内肿瘤反应LKB1号机组缺陷性肺肿瘤

我们之前曾观察到，使用BEZ235（PI3K-mTOR抑制剂）和AZD2644（MEK1/2抑制剂）双重抑制PI3K-m TOR和MEK可使Kras依赖性小鼠肺肿瘤模型的肿瘤体积减少80%(Engelman等人，2008年). 令人惊讶的是克拉/Lkb1相同组合的小鼠表明，这些肺部肿瘤基本上没有反应(图6A). 由于我们整合了基因表达和磷酸化酪氨酸分析以及在体外细胞培养研究表明SRC被LKB1号机组损失(图1C，图2B，图S2 S3A、S3B和S3C)，我们假设达沙替尼抑制SRC可能会恢复克拉/Lkb1肺肿瘤对PI3K和MEK的抑制作用。检查SRC抑制对克拉/Lkb1我们治疗的肺癌克拉/Lkb1单独使用达沙替尼、BEZ235和AZD2644联合用药（AZD/BEZ）或三种药物联合用药（达沙替尼/AZD/BEZ）的肺癌。While期间克拉/Lkb1达沙替尼或BEZ/AZD对肺部肿瘤无反应，达沙替尼/BEZ/AZD3种联合用药可导致连续MRI检测到的肿瘤明显消退(图6A)和组织学(图6B). 这个体内数据表明磅1丢失导致对PI3K和MEK联合抑制的敏感性降低，至少部分是通过激活SRC。此外，尽管达沙替尼单独用于克拉/Lkb1在这方面，肺癌模型没有提供比载具更大的总体生存效益克拉/勒克伯1肺癌模型，阻断转移(表S2).

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PI3K、MEK和SRC抑制剂联合治疗可产生协同效应体内的响应磅1缺陷性小鼠肺肿瘤

答：。每组治疗前后的典型MRI图像。每组小鼠均进行MRI成像，然后每天按以下剂量处理两周：45 mg/kg BEZ235、25mg/kg AZD6244和15 mg/kg Dasatinib，然后再次成像。肿瘤体积归一化为预处理肿瘤体积。显示了每个治疗组3-7只小鼠的平均肿瘤体积。误差线=1 SD（与预处理相比，经BEZ/AZD/Dasatinib处理的结果p<0.05）。

B类H&E染色。代表性H&E部门克拉/勒克伯1使用指定药物治疗的动物肿瘤。另请参见表S2和第3章。

短期治疗肿瘤的基因表达谱显示，所有治疗都能逆转Lkb1和Mets特征(表S2). 有趣的是，达沙替尼单独诱导SRC、TGF-β和MEK信号下调，但不诱导AKT、EMT和ES信号下调。三重组合下调SRC、TGF-β、MEK以及AKT、EMT和ES信号。该分析支持了Dasatinib与BEZ/AZD协同抑制信号转导通路的观察结果，这些信号转导途径在细胞增殖和存活中起重要作用克拉/Lkb1驱动癌细胞。

讨论

癌症基因组研究已经确定了许多癌基因和抑癌途径，对非小细胞肺癌肿瘤病变的发生和维持具有重要意义。然而，非小细胞肺癌侵袭和转移所需的分子改变尚不明确。我们之前曾报告删除了磅1肿瘤抑制基因喀斯特-驱动型小鼠肺肿瘤促进侵袭和转移(Ji等人，2007年). 在这里，我们扩展了这些发现以表明克拉/Lkb1原发性和转移性肿瘤的EMT标记物和诱导物表达上调。此外，通过对小鼠肺原发性和转移性肿瘤的综合基因组和磷酸蛋白质组分析，我们确定了局灶黏附动力学的两个关键调节剂SRC和FAK通过以下途径上调：磅1NSCLC进展过程中的损失。类似地，LKB1损失在体外也导致SRC激活，运动增加和SRC依赖性粘附。事实上，在LKB1缺陷细胞中，SRC和FAK抑制选择性地消除了迁移。最后，虽然喀斯特突变型肺肿瘤对PI3K和MEK通路的联合抑制敏感，我们发现克拉/Lkb1肿瘤对这些抑制剂具有耐药性，通过额外的靶向SRC可以恢复这种敏感性。值得注意的是，在PI3K/MEK联合抑制中添加达萨替尼会导致Lkb1缺陷肿瘤的肿瘤缩小。这揭示了SFK在肿瘤生长和促进对PI3K/MEK联合抑制的抵抗中的重要作用。事实上，SFK除了在肿瘤迁移和粘附中发挥重要作用外，还对从RTK和整合素中传递信号以促进细胞生存和增殖至关重要(Yeatman，2004年). 令人有些惊讶的是，单药达沙替尼导致克拉/Lkb1肿瘤(图6)以及保存Akt和EMT签名(表S3). 虽然我们无法完全解释这一观察结果，但我们很容易推测SRC抑制导致反馈机制丧失，从而导致肿瘤生长增加，或者导致肿瘤细胞与基质或免疫细胞之间的相互作用发生变化，从而导致瘤瘤生长。总的来说，这些结果指向了一种潜在的机制，即磅1缺乏肺肿瘤，并将SRC确定为治疗肺癌的分子靶向途径LKB1号机组-人类NSCLC缺乏。

肿瘤转移是一个复杂的多阶段过程，既涉及侵袭和血管生成等启动功能，也涉及外渗和存活等转移进展功能(Nguyen和Massague，2007年). EMT与转移的启动有关，包括细胞-细胞连接蛋白的丢失，以及静止细胞向能够通过ECM侵入的活动细胞的转化(Yang和Weinberg，2008年). 我们的基因表达分析表明，LKB1缺失导致许多致癌途径和已知的EMT诱导因子转录因子的异常表达，如斯奈伊1号，扭转1号，以及TGF-β和β-catenin途径(Kalluri和Weinberg，2009年;Nguyen和Massague，2007年;Yang和Weinberg，2008年). 虽然LKB1缺失促进EMT的机制尚待确定，但我们观察到缺乏LKB1的NSCLC细胞表现出较高的β-catenin核定位和TGF-β释放增加(图S3F和S3G)提示LKB1的丢失可能在促进EMT程序中起到直接的细胞自主性作用。派生自的表达式签名克拉/Lkb1EMT强化的转移与具有转移潜能和生存恶化的非小细胞肺癌患者相关(图1B)while表达式签名派生自喀斯特原发性肿瘤或克拉/Lkb1肿瘤与生存率无关，因此没有预后价值。重要的是已见者原发肿瘤样本中的特征，包括double的子集KRAS公司和LKB1号机组突变体，表明原发性肿瘤的一个子集含有注定要转移的细胞。

定义人类非小细胞肺癌侵袭和转移途径的部分障碍是难以从转移部位获取组织。通过使用喀斯特-驱动，磅1-由于基因工程小鼠肺癌模型的缺陷，我们已经能够收集到匹配的原发性和转移性肿瘤，并应用整合的基因表达和磷酸蛋白质组分析来确定改变的信号转导途径。利用复杂的小鼠肿瘤模型来识别癌症进展和转移过程中改变的信号转导途径，可能会成为其他实体肿瘤的范例，这些实体肿瘤的组织获取障碍类似。

我们实验室以前的工作表明，PI3K和MEK途径的双重抑制喀斯特驱动的小鼠非小细胞肺癌导致协同肿瘤反应(Engelman等人，2008年). 引人注目的是，磅1损失使这些肿瘤对这种治疗方案的抵抗力显著增强；因此磅1损失可作为治疗反应的负面预测因素。尽管在磅1值得注意的是，我们能够确定一个候选的调解人磅1-肿瘤生长缺陷，SRC，其中附加抑制-达沙替尼-能够恢复对PI3K和MEK抑制的敏感性体内该分析的一个局限性是达沙替尼是其他激酶的有效抑制剂，例如ABL，在Lkb1缺乏的肿瘤中也激活到较小程度。未来的研究将确定SFK与其他达萨替尼靶点在介导对该药物的反应中的相对重要性。最后，克拉/Lkb1单用达沙替尼治疗的小鼠没有任何转移的证据(表S2). 这进一步证实了我们的数据，即Src家族成员是肿瘤转移进展的重要介质克拉/Lkb1导致肺癌。总之，我们的结果表明，尽管LKB1丢失和非小细胞肺癌进展过程中发生了复杂的转录和信号变化，但这些肿瘤可能仍然对能够成功靶向治疗的孤立致癌事件上瘾。

实验程序

小鼠集落和肿瘤采集

所有小鼠均按照达纳-法伯癌症研究所动物研究机构护理和使用委员会批准的方案进行饲养和治疗。喀斯特和克拉/Lkb1小鼠用5×106p.f.u.腺病毒Cre（爱荷华大学病毒载体核心），如前所述(Ji等人，2007年). 对原发性肺腺癌和转移瘤进行宏观解剖，将福尔马林固定或冷冻在液氮中，并在使用前储存在−80°。

组织学和免疫组织化学分析

福尔马林固定组织石蜡包埋，5μm切片，苏木精和伊红染色（布里格姆妇女医院病理科）。未染色的载玻片在二甲苯中脱蜡，然后在乙醇中依次复水。抗原提取通过在10mM柠檬酸钠（pH 6.0）中煮沸玻片30分钟进行。用5%的山羊血清在TBST中稀释初级抗体，并在4℃下培养过夜（参见补充实验程序有关主要抗体的详细列表）。采用亲和素-生物素-辣根过氧化物酶技术进行检测，其中3,3“-二氨基联苯胺是显色底物。

微阵列基因表达数据分析

基因表达谱分析方法（总RNA分离和微阵列处理）可用于补充方法使用Gepas分析套件进行聚类和差异表达分析(Tarraga等人，2008年)和基因模式(Reich等人，2006年)步骤如所述补充方法.Genomica软件(http://genomica.weizmann.ac.il/)用于识别与不同表型和癌症相关事件相关的实验特征自定义集合的富集模式(Ben-Porath等人，2008年;Segal等人，2004年)（请参见表S1详细说明）。简单地说，数据是日志2转变和以手段为中心。对表达量为平均表达水平2倍或以上的基因进行评分。使用超几何检验和错误发现率（FDR）计算来计算属于每个测试基因特征的过表达或欠表达基因的富集度，以解释多重假设测试。（P<0.05，FDR<0.05）。最后，每类肿瘤中显示特定基因特征显著富集的部分(喀斯特肿瘤，克拉/Lkb1原发性肿瘤和转移）根据超几何分布计算并分配P值（P<0.01，FDR<0.05）。

短期治疗的基因集富集分析克拉/Lkb1使用GSEA进行肿瘤治疗(宽.mit.edu/gsea)通过信噪比排序的完整基因列表。

UNC人类肺癌微阵列（安捷伦定制44000探针）注释为KRAS公司和LKB1号机组使用NCBI同源基因将遗传状态映射到小鼠基因，仅保留一对一的同源基因。将微阵列数据进行样本和基因标准化，并计算Lkb1和Mets特征分数作为整个基因集的基因中位数。使用Wilcoxon秩和检验计算统计显著性。

生存分析

Director's Challenge Consortium人类原发性肺腺癌数据集下载自caarraydb.nci.nih.gov（实验ID 1015945236141280:1）(Shedden等人，2008年). MSKK数据集2从cbio.mskcc.org/Public/lung_array_data下载(Nguyen等人，2009年). 数据集是第一个日志2转换后的以平均值为中心的数据集并加载到Genomica软件中。按照上述方法计算属于我们的鼠源Mets特征的基因富集度，并为每个患者分配一个富集分数。每个个体的阳性和阴性浓缩分数与生存数据（最后接触或死亡的时间）或转移复发（无转移生存）相匹配。使用Graphpad软件创建Kaplan-Meier图。使用对数秩检验计算统计显著性。

磷酸肽免疫沉淀、LC-MS/MS和磷酸肽分析

如前所述，我们进行了磷酸酪氨酸肽的鉴定和定量(Rikova等人，2007年). 请参见补充方法用于样品制备和处理。对于差异磷酸化分析，重复强度取平均值，并计算不同实验条件之间的fold变化。对于磷酸蛋白的KEGG分类，我们使用了FatiGO软件(网址：www.babelomics.org) (Al-Shahrour等人，2004年). 基因集富集分析（GSEA）的改进(Subramanian等人，2005年)用磷蛋白集代替基因集(图S2A)用于查询酪氨酸激酶底物的磷酸点数据库(激酶.生物信息学.tw) (Yang等人，2008).

定量RT-PCR

用上标cDNA合成试剂盒（Invitrogen）逆转录总RNA的50 ng RNA。使用从Applied Biosystems购买的引物和TaqMan探针为每个样品制备三份实时PCR反应（另请参阅补充实验程序). 反应在ABI PRISM 7900HT序列检测系统（应用生物系统）上进行。GAPDH被用作所有反应的参考。用ΔΔCt法测定基因的相对水平。

复合珠分析

分别使用人TGF-β1,2,3测定和Src家族激酶8-Plex（Millipore）测定TGF-β亚型的定量和Src家族激酶活性。根据制造商规范进行分析，并使用Luminex 100平台进行分析。使用TGFβ1、2和3标准物获得的校准曲线，对重复样品的荧光强度进行平均并转换为蛋白质浓度。对于Src测定，活性以平均荧光强度（MFI）表示，并对重复样品进行背景校正。使用双侧Student’s精确值计算统计显著性t吨-测试。

蛋白质印迹和激酶阵列分析

Western blot和抗体的参数见补充实验程序..人类磷酸激酶阵列（研发系统）是根据制造商的说明进行的。使用ImageJ软件（NIH）通过密度分析确定控制激活/失活百分比。

短发夹RNA结构、慢病毒感染和小干扰RNA感染

在pLKO.1 puro载体中克隆的短发夹RNA（Short hairpin RNA，shRNA）结构由RNAi联盟设计并由Open Biosystems分发。shRNA序列带有补充实验程序如前所述建立稳定的多克隆细胞系(Shimamura等人，2008年).

细胞迁移、侵袭和粘附测定

使用二维体外划痕运动试验测量培养物中的细胞迁移。在组织培养载玻片中的融合单层上划出1mm宽的划痕，并在标准条件下生长12h。使用尼康倒置TE2000记录清除区域的重新填充，并使用Image J软件量化迁移距离。侵袭和粘附检测试剂盒从Cell Biolabs获得，并根据制造商的规范进行检测。有关详细信息，请参阅补充方法。

免疫荧光分析

将细胞固定在-20°C下甲醇/丙酮（1:1）中的四孔室玻璃载玻片上10分钟，并进行空气干燥。在室温下，用10%山羊血清（Sigma）和0.05%吐温20在PBS缓冲液中进行一次封闭1小时。将活化β-连环蛋白（Millipore）的小鼠单克隆抗体在封闭缓冲液中按1:50稀释，并在4°C下孵育过夜。将与Alexa488染料（Invitrogen）偶联的兔抗鼠二级抗体在封闭缓冲液中按1:100稀释，并在室温下孵育1h。图像是使用尼康倒置TE2000显微镜采集的，该显微镜配备有哈马松Orca ER数字CCD相机。

在体内异种移植实验

将5至6周龄雌性nu/nu小鼠（Charles River）维持在无致病条件下。皮下注射5×10产生肿瘤6细胞与1:1比例的重组基底膜基质（BD Biosciences）混合在PBS中。接种后14天处死动物，切除肿瘤并用福尔马林固定。使用电子卡尺进行肿瘤测量。肿瘤体积的计算方法为：肿瘤体积=（长度×宽度2)/2. 我们使用双侧Student精确值比较了小鼠的肿瘤体积t吨-测试。

使用抑制剂进行癌症治疗

双PI3K-mTOR抑制剂NVP-BEZ235-AN（诺华生物医学研究院）在一体积的N个-甲基-2-吡咯烷酮（69118，福禄卡）和九卷PEG300（81160，福禄加），经口灌胃给药。MEK抑制剂ARRY-142886（AZD6244，Otava Chemicals）和Dasatinib（LC Labs）在0.5%甲基纤维素（Fluka）和0.4%聚山梨酯（Tween 80；Fluka。剂量如图例所示。

磁共振成像和肿瘤体积测量

如前所述，我们进行了MRI测量(Engelman等人，2008年). 有关简要说明，请参见补充方法。

补充材料

01

单击此处查看。（150万，pdf）

02

单击此处查看。（301K，xls）

03

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致谢

J.C.是西班牙科学与创新部（MICINN）和西班牙抗癌协会（AECC）的研究员。T.S.得到了Claudia Adams Barr创新基础癌症研究项目的支持。K.K Wong和J.A.Engelman是Gatekeeper Therapeutics的创始人。这项工作得到了哈佛癌症中心肺癌卓越研究专业项目（SPORE）资助P50 CA090578（J.A.Engelman和K-K.Wong）的支持；R01 AG2400401（K-K.Wong）、R01 CA122794；美国癌症研究协会（J.A.Engelman）；V基金会（J.A.Engelman）；美国癌症学会RSG-06-102-01-CCE（J.A.Engelman）；和埃里森基金会学者（J.A.Engelman）。K.Rikova、K.Crosby、J.C.Silva和T-L Gu是Cell Signaling Technology的员工。C.Garcia-Echeverria是诺华生物化学研究院的一名员工。我们感谢H.Voelker帮助我们准备这份手稿。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

重要性

虽然对非小细胞肺癌（NSCLC）的大规模基因组分析已经对肺癌的基因改变有了更好的了解，但定义肿瘤进展和转移中解除调控的途径的研究却很有限。LKB1号机组高达30%的人非小细胞肺癌和磅1小鼠肺肿瘤缺乏淋巴结和远处转移的外显率高。我们对原发性和转移性肿瘤的分析磅1-缺陷小鼠肺癌表明，转移性肺癌的进展与独特的基因和磷酸蛋白特征有关。在这项工作中，我们利用这些特征来设计有效、合理的治疗策略来治疗磅1-缺乏肺癌。

微阵列数据

微阵列数据已存放在GEO，并带有登记号GSE21581标准。

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