致癌mTOR通路的基因分析显示通过4EBP-eIF4E对转化控制的药物成瘾

mTORC1下游翻译成分的遗传解剖揭示了4EBPs而非rpS6在Akt介导的肿瘤发生中的关键作用

在确定蛋白质合成控制在PI3K-Akt-mTOR信号传导中起因果作用后，我们接下来使用一系列独特的基因小鼠模型来评估mTOR致癌信号下游直接激活的特定翻译成分在癌症发生中的作用。mTOR激酶激活的两个最显著且特征最鲜明的翻译调节因子是eIF4E结合蛋白4EBP1、4EBP2和4EBP3及rpS6(图2A) (Ruggro和Sonenberg，2005年). 在这三个4EBP中，4EBP1最具特色。AKT公司^T型与WT对照组相比，胸腺细胞的rpS6和4EBP1磷酸化水平均增加(图2B). mTOR通过磷酸化4EBP来响应PI3K激活，导致帽结合蛋白eIF4E从4EBP中分离，并刺激帽依赖性翻译。rpS6的磷酸化是通过S6激酶实现的，S6激酶是mTOR的直接靶点(Kim等人，2002年；Kozma等人，1990年). rpS6在翻译控制中的作用仍知之甚少(Ruvinsky等人，2005年；Stolovich等人，2002年；Tang等人，2001). 由于缺乏足够的基因小鼠模型，很难解决rpS6和eIF4E过度激活在致癌PI3K-Akt-mTOR信号下游的翻译控制和肿瘤发生中的相对贡献。由于rpS6和eIF4E可能在控制细胞活性和组织内环境稳定所需的蛋白质合成方面具有构成功能，我们试图仅选择性地恢复其mTOR激活下游过度激活的后果。为此，我们使用rpS6磷酸化缺陷敲除小鼠（rpS6^P−/−) (Ruvinsky等人，2005年)或突变4EBP1转基因小鼠（见下文），分别将rpS6和eIF4E过度激活恢复到致癌PI3K-Akt-mTOR信号下游的正常水平(图2A).

4EBP1蛋白通过T37和T46上的mTOR直接磷酸化，从而启动S65和T70上的后续磷酸化(Gingras等人，1999a,2001). mTOR响应PI3K激活对4EBP1的磷酸化降低了其对eIF4E的亲和力，使eIF4G和相关因子与eIF4E结合(Brunn等人，1997年；Gingras等人，1998年). 与eIF4G结合的eIF4E的增加导致cap依赖性翻译增加，因为这种复合物的组装触发了40S核糖体亚基向5′cap的募集，从而启动cap依赖翻译(Gingras等人，1999b). 研究eIF4E过度激活在AKT中的后果^T型小鼠，我们生成了胸腺特异性4EBP1磷酸化缺陷转基因小鼠^M（M）)其中，五个胰岛素和雷帕霉素响应的4EBP1磷酸化位点中的每一个都突变为丙氨酸(图2A和图S2A–S2C). 4EBP1和eIF4G到eIF4E的绑定是互斥的，因为它们竞争相同的绑定站点(哈格海特和索伦伯格，1997年). 因此，低磷酸化4EBP1直接与eIF4G竞争eIF4E结合，而高磷酸化形式是一种效率较低的竞争对手。因此，由于Akt过度激活，外源性4EBP1的共表达^M（M）预计可补偿内源性4EBP结合eIF4E的效率降低(Avdulov等人，2004年).

首先，我们分析了来自AKT的胸腺细胞中eIF4E和eIF4G之间的相互作用程度^T型和AKT^T型; 第4期EBP1^M（M）通过帽状下拉试验将转基因小鼠与各自的对照组进行比较(图2C). 在本试验中，胸腺细胞裂解物中存在的eIF4E与包被帽类似物7-甲基GTP（m⁷GTP），允许检测与eIF4E结合的蛋白质。AKT公司^T型胸腺细胞显示4EBP1过度磷酸化，这与eIF4E-eIF4G复合物形成增加相关(图2C). 4EBP1的表达^M（M）AKT来源胸腺细胞的转基因^T型；第4期EBP1^M（M）小鼠选择性地将与eIF4E结合的eIF4G的量恢复到正常水平(图2C). 值得注意的是，4EBP1^M（M）与WT细胞相比，细胞的eIF4E-eIF4G复合物形成仅略有减少，表明4EBP1^M（M）转基因选择性地抑制致癌Akt信号下游的eIF4E过度激活，但不干扰稳态eIF4E活性。这与以下事实一致：内源性、低磷酸化4EBP1和4EBP2均在胸腺中高表达，并且在稳定状态下4EBP1^M（M）与这两者竞争eIF4E绑定(图S2D). 这些结果表明，内源性4EBP和外源性4EBP1之间的平衡^M（M）蛋白质允许维持基本细胞功能，在WT背景下对cap依赖性翻译没有功能影响(图S1B和S2D). 的确，4EBP1^M（M）突变小鼠的蛋白质合成没有减少(图S1B)并显示正常胸腺生成(图S2C). 因此，4EBP1^M（M）该蛋白主要阻断致癌Akt信号下游的eIF4E过度激活。因此，4EBP1^M（M）小鼠是一种重要的遗传工具，可以以组织特异性的方式选择性抑制致癌Akt信号下游的eIF4E过度激活。

为了确定mTOR激酶对4EBP1或rpS6的磷酸化是否直接导致致癌Akt信号下游蛋白合成的增加，我们交叉了Akt^T型4EBP1小鼠^M（M）或rpS6^P−/−老鼠。重要的是，磷酸化缺陷4EBP1和/或rpS6蛋白分别对mTORC1或S6激酶活性没有任何显性负效应(图S2E). 在肿瘤形成之前，Akt过度表达的胸腺细胞中蛋白质合成速率的增加在Akt中得到了显著缓解^T型；第4期EBP1^M（M）老鼠(图2D). 出乎意料，尽管rpS6^P−/−与WT胸腺细胞相比，细胞的蛋白质合成能力降低了20%(图S1B)，抑制rpS6的磷酸化并不能恢复致癌Akt信号下游增加的蛋白质合成速率。出乎意料，恰恰相反，AKT^T型；rpS6系列^P−/−与AKT相比，细胞显示出更高的蛋白质合成速率^T型单元格(图2D和讨论）。与这些结果一致，AKT中细胞大小明显增加^T型胸腺细胞在AKT中恢复到正常水平^T型；第4期EBP1^M（M）胸腺细胞，但AKT中没有^T型；转速S6^P−/−单元格(图2E). 这些发现证明了体内4EBP1和/或rpS6磷酸化在控制致癌Akt信号下游蛋白合成中的二分法要求，并强调了4EBP1-介导的定量翻译控制和细胞大小调节的特异性。

这些结果使我们下一步评估了肿瘤发生中Akt过度激活下游蛋白质合成中eIF4E依赖性增加的生理相关性。值得注意的是，AKT患者出现淋巴腺病^T型；第4期EBP1^M（M）与AKT相比，小鼠明显延迟^T型小鼠和最重要的是60%的AKT^T型；第4期EBP1^M（M）小鼠不发生淋巴瘤(图3A). 有趣的是，在AKT的子集中^T型；4个桶1^M（M）最终发展为淋巴瘤的小鼠，在这些肿瘤中观察到蛋白质合成的增加(图S3A). 这些发现表明，AKT的一个子集可能会出现额外的遗传损伤^T型；第4期EBP1^M（M）这会导致蛋白质合成增加并导致癌症形成。与AKT中蛋白质合成和细胞生长不受抑制这一事实相一致^T型；rpS6系列^P−/−小鼠，我们在AKT和^T型和AKT^T型；rpS6系列^P−/−老鼠(图3B). 这些结果表明，Akt信号的mTOR-4EBP1-eIF4E臂是蛋白质合成控制的主要和特异性效应器，对PI3K-Akt-mTOR致癌活性至关重要。此外，虽然rpS6的磷酸化是mTOR激活的常用读数，但它对Akt介导的肿瘤发生是不可或缺的。

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图3

eIF4E的过度激活对癌基因PI3K-Akt-mTOR信号下游T细胞淋巴瘤的发生至关重要，而rpS6的磷酸化是不必要的

两组AKT患者无淋巴结生存率的Kaplan-Meier分析^T型（n=26）和AKT^T型；第4期EBP1^M（M）（n=25）小鼠（A），p=0.0001，和AKT^T型（n=19）和AKT^T型；rpS6系列^P−/−（n=18）只小鼠（B），p=0.3319。另请参见图S3.

癌基因Akt信号下游4EBP-eIF4E通过表达抗凋亡蛋白Mcl-1，至少部分特异性控制T细胞前体存活

接下来，我们研究了Akt介导的淋巴腺病期间eIF4E活性和蛋白质合成增加的细胞后果。T细胞前体的发育以分化抗原CD4、CD8、CD44和CD25表达的规定变化为标志，这些抗原可用于将胸腺细胞分裂成不同的亚群。早期胸腺细胞祖细胞缺乏CD4和CD8表达，被称为双阴性（DN）细胞。DN阶段分为四类。DN1期以CD44（CD44）的表面表达为特征⁺CD25型^负极). 这种最早的胸腺细胞亚群从DN2期（CD44）开始成熟⁺CD25型⁺)至DN3阶段（CD44^负极CD25型⁺)最后进入DN4阶段（CD44^负极CD25型^负极) (肖特曼和吴，1996；Zuniga-Pflucker，2004年). 驱动AKT的Lck近端启动子^T型和4EBP1^M（M）表达首先在DN2阶段变得活跃(巴克兰等人，2000年)因此，致癌Akt的影响必须发生在这个阶段或以后。DN3-4转变的特征是突然出现增殖和生存刺激，确保DN胸腺细胞随后分化为CD4+CD8+双阳性和单阳性阶段(图S4A和S4B) (Ciofani和Zuniga-Pflucker，2006年). 通过分析单个癌前T细胞前体亚群的数量，我们特别观察到AKT胸腺中DN3-4细胞的增加^T型小鼠，在AKT中完全恢复到正常数量^T型；第4期EBP1^M（M）和AKT^T型；L24级^+/−小鼠，但AKT中没有^T型；rpS6系列^P−/−老鼠(图4A). 与这些发现一致，而AKT^T型肿瘤在T细胞成熟的各个阶段都有细胞聚集，DN3-4细胞是胸腺肿瘤细胞中最丰富、最早的DN细胞类型(图4B和4C)，并且此配置文件被复制到AKT的子集中^T型；第4期EBP1^M（M）最终发展成肿瘤的小鼠(图S3B).

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图4

癌基因PI3K-Akt-mTOR信号导致依赖eIF4E高活性的DN3-4胸腺亚群的富集

（A） 通过流式细胞术（n>5/基因型）评估胸腺中DN3-4胸腺细胞的百分比（与总DN胸腺细胞相比，肿瘤形成前）（*p<0.003；**p<0.002；无统计学意义）。

（B） AKT胸腺瘤中DN细胞亚群的百分比^T型小鼠（n=5）。

（C） AKT胸腺瘤中所有胸腺细胞亚群的流式细胞术分析^T型小鼠（n=5）。数据以平均值±SEM表示。另请参阅图S4.

接下来，我们试图进一步了解DN3-4细胞在AKT中积聚的细胞机制^T型小鼠以及这种影响是否取决于Akt增强蛋白质合成的能力。为此，我们分析了WT和AKT中DN3-4细胞的程序性细胞死亡、细胞增殖和分化^T型小鼠在肿瘤形成之前。我们在AKT中观察到正常的T细胞分化^T型OP9-DL1培养体系中的小鼠，其中来自AKT的DN2细胞^T型小鼠进入CD4+和CD8+单阳性期(图S4A–S4C). 同样，在AKT中，DN3-4细胞以及所有其他胸腺亚群的细胞增殖没有增加^T型单元格(图S4D和S4E). 这些结果与先前的研究结果一致，先前的研究结果表明，Lck-Akt1转基因小鼠在体内也没有表现出细胞增殖的增加(Malstrom等人，2001年). 相反，AKT中DN3-4细胞的增殖降低^T型细胞与WT细胞相比，可能反映了对致癌损伤的抑瘤细胞反应(图S4D). 此外，尽管AKT^T型；rpS6系列^P−/−与AKT相比，胸腺细胞的蛋白质合成水平进一步增加^T型单就它们而言，并没有任何增殖优势(图S4E). T淋巴细胞发育过程中细胞死亡和增殖之间存在随机平衡，所有胸腺细胞亚群中都存在背景水平的细胞死亡(Ciofani和Zuniga-Pflucker，2006年；Mao等人，2007年). 接下来我们检查了AKT中的细胞死亡^T型在DN3-4细胞中观察到程序性细胞死亡的特异性显著减少，并且在AKT中完全恢复到背景水平^T型；第4期EBP1^M（M）和AKT^T型；L24级^+/−老鼠(图5A). 这些发现与Akt1和Akt2联合缺失导致DN3-4胸腺细胞死亡增加的观察结果一致(Juntilla等人，2007年). 总之，这些结果说明了Akt介导的细胞存活作为淋巴细胞发育阶段淋巴腺病机制的重要性，淋巴细胞发育阶段通常依赖Akt进行正常发育。

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图5

致癌PI3K-Akt-mTOR信号下游的eIF4E过度激活通过控制Mcl-1的翻译至少部分地损害特定T细胞前体的程序性细胞死亡

（A） 附件五百分比⁺肿瘤形成前的DN3-4细胞（n>3只小鼠/基因型）（*p<0.001、**p<0.02和**p<0.003）。

（B和C）总胸腺细胞中Mcl-1蛋白表达水平的分析。（右）代表性蛋白质印迹。（左）密度分析（*p=0.005）。所有具有代表性的western blot均从同一凝胶中加载、解析和转移。

（D） AKT中Mcl-1表达增加的百分比^T型和AKT^T型；第4期EBP1^M（M）与WT对照组相比（n=4/基因型）（*p=0.01）。

（E） Annexin V的折叠变化⁺Mcl-1敲除后DN3-4细胞中（n>3只小鼠/基因型）（*p<0.01和n.s.，无统计学意义）。数据表示为平均值±SEM。另请参见图S5.

了解AKT中DN3-4细胞的分子机制^T型小鼠对程序性细胞死亡更具抵抗力，我们采用了一种候选基因方法来检测帽依赖性蛋白翻译的增加是否会改变特异性抗凋亡蛋白的转录后表达。虽然我们没有检测到六种重要的抗凋亡因子的蛋白质表达水平有任何变化(图S5A)，我们观察到Mcl-1在AKT中特异性上调^T型与WT相比，细胞在蛋白质水平上受控制，但在mRNA水平上不受控制(图5B和图S5B). 此外，AKT中Mcl-1蛋白的降解不受影响^T型胸腺细胞(图S5C). 重要的是，Mcl-1已被证明是早期胸腺祖细胞（包括DN3-4细胞）细胞死亡的关键调节因子(Opferman等人，2003年). 据报道，Mcl-1也是一个翻译调控基因，其表达受原代成纤维细胞和肿瘤中eIF4E磷酸化的影响，与Tsc2（结节性硬化2蛋白）丢失相关(Mills等人，2008年). 接下来，我们测试了致癌Akt信号下游Mcl-1蛋白水平的增加是否是蛋白质合成增加和/或eIF4E过度激活的结果。Mcl-1蛋白表达在AKT中恢复到正常水平^T型；第4期EBP1^M（M）和AKT^T型；L24级^+/−，但不适用于AKT^T型；rpS6系列^P−/−(图5B和5C和图S5D和S5E). 此外，Mcl-1特别富含DN3-4 AKT^T型胸腺细胞显示出细胞存活优势，这种效应依赖于eIF4E过度激活(图5D). 因此，eIF4E增加Mcl-1是致癌mTOR的4EBP1臂所特有的，并不依赖于rpS6磷酸化。

接下来，我们询问Mcl-1对AKT中观察到的细胞存活率增加是否具有重要功能^T型DN3-4细胞。我们筛选了一组Mcl-1 shRNAs候选基因，该候选基因可使AKT中Mcl-1水平降低约25%^T型胸腺细胞(图S5F和S5G). 我们观察到AKT的抗凋亡优势显著逆转^T型Mcl-1敲除后的DN3-4细胞(图5E). 因此，eIF4E依赖性的Mcl-1蛋白表达控制赋予特定胸腺细胞祖细胞的细胞生存优势。

eIF4E过度激活对AKT很重要^T型-介导肿瘤维持

接下来我们询问AKT的维护^T型肿瘤依赖于4EBP-eIF4E轴的激活。为此，我们诱导4EBP1的表达^M（M）10周龄AKT转基因^T型；4个桶1^M（M）小鼠，此时淋巴瘤已经很明显(图6A和6B). 随后，AKT队列^T型和AKT^T型；第4期EBP1^M（M）通过MRI对小鼠成像以监测肿瘤进展。令人惊讶的是，在14周大时，AKT^T型小鼠的肿瘤生长增加了5倍，而4EBP1的诱导^M（M）转基因导致肿瘤尺寸急剧缩小(图6A和6B). 这些发现表明，eIF4E过度激活在肿瘤维持中起着重要作用，并为在致癌Akt下游药物上靶向eIF4E过度激活提供了有力的理论依据。

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图6

eIF4E过度激活对AKT很重要^T型肿瘤维护

第4期EBP1^M（M）在AKT中诱导^T型；第4期EBP1^M（M）10周龄的小鼠。

（A） 平均肿瘤体积（p<0.03）。数据表示为平均值±SEM。

（B） AKT公司^T型和AKT^T型；第4期EBP1^M（M）在10周和14周时在GE 3T MRI上成像的小鼠。来自同一AKT的图像^T型和AKT^T型; 第4期EBP1^M（M）小鼠在10周和14周时。

AKT的药理治疗^T型小鼠同种异体移植模型

生成30只同种异体小鼠。所有小鼠均发生肿瘤，并在第21天随机接受载体雷帕霉素（惠氏）（5 mg/kg）或PP242（100 mg/kg）的灌胃治疗，每周7天。PP242再次悬浮在5%N-甲基吡咯烷酮、15%聚乙烯吡咯烷酮和80%水中。根据之前的药效学研究和Feldman等人（2009年），在裸鼠中显示出对磷酸化4EBP1和磷酸化Akt的有效抑制。用碘化丙啶染色法对肿瘤样本进行细胞周期分析，如下所述。

全球蛋白质合成分析

胸腺细胞总数（2×10⁶)在含有10%透析FBS的1ml不含蛋氨酸的RPMI培养基中孵育，使蛋氨酸饥饿45分钟。饥饿后，20μCi的S³⁵-将标记的蛋氨酸添加到每个样品中，并继续孵育1小时。将细胞溶解并³⁵使用10%三氯乙酸（TCA）沉淀S-标记蛋白，干燥，并在闪烁计数器（Beckman Coulter）中测量。每个样品测量三次。S系列³⁵通过对每组实验使用相同数量的细胞来控制实验。在每个基因型（AKT）之间进行最终比较^T型、AKT^T型；第4期EBP1^M（M），rpS6^P−/−，阿克特^T型; 转速S6^P−/−，L24^+/−、AKT^T型；L24级^+/−)与WT控制相比。

Cap-Binding分析

在缓冲液A[10 mM Tris-HCL（pH 7.6）、140 mM KCl、4 mM MgCl中溶解总胸腺细胞₂将1 mM DTT、1 mM EDTA和蛋白酶抑制剂，辅以1%NP-40]和细胞裂解物（500μl中500μg蛋白质）在4°C下与50μl mRNA帽类似物m⁷GTP-sepharose（GE Healthcare）置于缓冲液A中，持续温和搅拌。用添加0.5%NP-40的缓冲液A洗涤蛋白质复合物sepharose珠，并通过SDS-PAGE和western blotting解析eIF4E-相关复合物。按照制造商的说明使用以下抗体：兔抗eIF4G（细胞信号）、鼠抗eIF4 E（BD Biosciences）和兔抗4EBP1（细胞信号传递）。

DN3-4在体细胞凋亡分析及胸腺肿瘤的特征

为了表征DN3-4细胞的百分比以及体内凋亡，在PBS-FBS中用APC-Cy7-结合抗CD4（BD Biosciences）、太平洋蓝结合抗CD8（Caltag）和PE-结合抗TCRβ抗体（BD bioscience）标记等量的新鲜分离胸腺细胞（所有抗体稀释为1:100 v/v）。按照制造商的说明，用Annexin V-FITC（BD Biosciences）标记凋亡细胞。通过省略Annexin V孵育，为每个样本建立阴性对照。样品（10⁶细胞）在BD-LSRII流式细胞仪上采集。使用FlowJo软件（8.7.1版）进行分析和量化。为了确定肿瘤中胸腺细胞亚群的特征，用APC-Cy7-结合抗CD4抗体（BD Biosciences）、太平洋蓝结合抗CD8抗体（Caltag）、FITC-结合抗CD25抗体（BD-Biosciences）、APC-结合抗CD44抗体（BD-Pioscience）和PE-结合抗TCRβ抗体（BD-Mioscieences）标记细胞。单元格（10⁶)如上所述进行分析。

胸腺细胞的分选和体外分化

用生物素结合的抗CD4和抗CD8抗体（BD Biosciences）在4°C下标记新鲜分离的胸腺细胞30分钟，然后用抗生物素磁珠（Myltenyi Biotec）在4℃下标记20分钟。CD4细胞^负极CD8（CD8）^负极然后按照制造商的说明，使用AutoMACS（Myltenyi Biotec）分离DN胸腺细胞。然后用APC结合抗CD44和PE结合抗CD25抗体（BD Biosciences）和CD44标记DN细胞⁺CD25型⁺使用Becton Dickinson FACS DiVa流式细胞仪和细胞分选仪分离（DN2）胸腺细胞。DN2细胞在OP9-DL1-GFP细胞上共培养(Schmitt和Zuniga-Pflucker，2002年)持续1周。然后通过上述流式细胞仪分析胸腺细胞亚群，但包括胸腺细胞与生物素化抗CD45抗体的孵育，然后再与Qdot605结合的链霉亲和素孵育。在CD45中进行胸腺细胞亚群分析⁺GFP公司^负极门控细胞。

细胞增殖的体内定量

小鼠接受两次腹腔注射（间隔4小时），每次注射1 mg BrdU（BD Biosciences），第二次注射后12小时收集胸腺细胞。在PBS-FBS中用APC-Cy7-结合抗CD4抗体（BD Biosciences）、太平洋蓝结合抗CD8抗体（Caltag）和PE-结合抗TCRβ抗体（BD-Biosciences）标记细胞（所有抗体稀释为1:100 v/v）。按照制造商的说明，使用FITC BrdU流式试剂盒（BD Biosciences）对染色细胞进行清洗、固定和流式细胞术处理。单元格（10⁶)在BD-LSRII流式细胞仪上进行分析，并使用FlowJo软件（8.7.1版）测定BrdU阳性细胞的百分比。对未接受BrdU的小鼠进行阴性对照。

胸腺细胞Mcl-1 shRNA敲除

WT或AKT产生的单细胞悬浮液^T型通过电穿孔（Amaxa）将Mcl-1 shRNA（TTTCAAAGATGGCGTAACATTCAAGAGAGTTACGCCATTTGAAA）或打乱shRNA转染胸腺细胞，将其克隆到RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen构建物（Clontech）中。如上所述，在转染后12小时，通过流式细胞术对DN3-4亚群进行凋亡分析。为了评估敲除的程度，采用流式细胞术在平行实验中测量Mcl-1蛋白水平。为此，用CD4、CD8和TCRß链的荧光抗体（如上所述）标记胸腺细胞，并在4°C下用细胞修复剂/细胞周期缓冲液（BD Biosciences）固定15分钟。细胞渗透20分钟，通过添加正常山羊血清（1:20 v/v）阻断非特异性结合。然后用单克隆兔抗Mcl-1抗体（Abcam）（1:100 v/v）孵育细胞20分钟。用APC结合的山羊抗兔抗体（分子探针）（1:200 v/v）孵养细胞20分钟，清洗，最后在PBS中再次悬浮，以在BD-LSRII流式细胞仪上进行分析。阴性对照是由于遗漏一级抗体和遗漏一级和二级抗体而产生的，以解释背景信号。如上所述进行分析，但GFP中有额外的门控⁺细胞。使用FlowJo软件生成对应于Mcl-1表达的平均荧光强度水平。

Mcl-1蛋白降解试验

WT和AKT^T型如上所述分离胸腺细胞。5 × 10⁶细胞重新悬浮在培养基中，并用50μg/ml环己酰胺处理。在指定的时间点分离细胞。制备蛋白裂解物并通过SDS-PAGE进行分解，然后按照上述方法转移到PVDF上。使用Bio-Read分子成像仪凝胶Doc XR和Quantity One v.4.6.7软件对每个西部进行密度分析。每个通道首先归一化为β-肌动蛋白，然后归一化成无环己酰亚胺处理对照。

双顺反子帽/IRES荧光素酶测定

WT和AKT^T型如上所述分离胸腺细胞。通过电穿孔（Amaxa）将p53 IRES双顺反子载体转染胸腺细胞。转染24小时后收集细胞，并使用Optocomp 1光度计（MGM Instruments）定量Firefly/Renilla活性。用Rluc 5′-AACGCGCCTTCTTATTT-3′定量PCR标准化双顺反子mRNA水平；5′-ATTTGCCTGATTTGCCCATA-3′；和Fluc 5′-GAGGTTCACATCTGCAGTA-3′；5′-CCGGTATCCAGACACAAC-3′引物。为了在体内分析Cap/IRES诱导的荧光素酶活性，从HCV-IRES和AKT中分离胸腺细胞^T型；如上所述，直接定量HCV-IRES小鼠和荧光素酶活性。

我们感谢巴纳先生的支持、批判性讨论和阅读手稿；Intellikine公司的Y.Liu和C.Rommel提供试剂和技术专业知识；B.Hann和加州大学旧金山分校（UCSF）临床前治疗核心寻求技术援助；O.Krasnykh提供技术援助；O.F.Siegel和J.M.Shen负责编辑手稿。我们感谢Margaret Hart Surbeck Institute的J.Kurhanewicz和R.Bok提供的先进成像技术支持和MRI图像。这项工作得到了V癌症研究基金会（D.R.）、国家癌症研究所拨款CA77429（J.R.T.）、美国国立卫生研究院T32培训拨款（A.C.H.）、加州大学旧金山分校前列腺癌SPORE职业发展计划（M.C.）和美国意大利癌症基金会（O.Z.）的支持。D.R.是白血病和淋巴瘤学会学者。A.C.H.、M.E.F.、K.M.S.和D.R.是UCSF拥有并授权给Intellikine，Inc.的与PP242相关的专利申请的发明人。K.M.S是其科学咨询委员会的联合创始人和成员。