谱系决定转录因子的简单组合是巨噬细胞和B细胞特性所需的主要顺调控元件

总结

介绍

复杂多细胞生物的发展涉及到等级组织的祖细胞，这些祖细胞最终会产生具有特殊功能的末端分化细胞类型。细胞命运由谱系决定转录因子指定，其表达通常不限于单个细胞类型(特朗彻和亚尼夫，1992年). 对不同物种和细胞类型中不同转录因子的全基因组结合模式的比较产生了关于转录因子结合模式的两个主要见解：1。同一细胞类型中的不同因子往往在全基因组范围内共存(Chen等人，2008;麦克阿瑟等人，2009年). 2.同一因子在不同细胞类型或不同发育阶段表现出不同的全基因组结合模式(Lupien等人，2008年;Odom等人，2004年;Sandmann等人，2006年).

已经提出了几种机制来解释这一现象，包括蛋白质与蛋白质的相互作用，使DNA能够形成三元复合物(Verger和Duterque-Coquillaud，2002年)，破坏闭合核小体构象并使其他因子结合的先锋因子(Cirillo等人，2002年)一个或多个因子与聚集位点的协同结合，促进核小体置换和相关因子的稳定结合(Boyes和Felsenfeld，1996年;Miller和Widom，2003年)，并与赖氨酸4-甲基化组蛋白H3（H3K4me1/2）以细胞类型特异性方式标记的染色质结合(Lupien等人，2008年)是开放染色质的标志，与邻近基因的活性相关(Heintzman等人，2009年). 然而，转录因子如何进入其最终结合位点，以及产生其细胞类型特异性结合的事件层次和相关的表观遗传修饰模式，此前尚未在全基因组范围内阐明。

哺乳动物造血系统是一个特征鲜明的模型，用于分析组合转录因子集，这些转录因子集协调造血干细胞不同类型细胞的发育。在造血系统中，巨噬细胞和B细胞在免疫系统的固有臂和适应性臂中发挥着重要的互补作用。最近的研究提出了一种模型，其中这些细胞类型来源于一种淋巴阳性多潜能祖细胞（LMPP），随后产生普通淋巴祖细胞（CLP）和粒细胞巨噬细胞祖细胞（GMP）(Adolfsson等人，2005年) (图1A). Ets因子PU.1是产生GMP和CLP所必需的，巨噬细胞和B细胞发育的后期还依赖于许多细胞类型限制因子。其中，AP-1和C/EBP家族因子是巨噬细胞发育和功能所必需的(弗里德曼，2007)而E2A、EBF1、Pax5和Oct-2在B细胞的发育和功能中起着重要作用(麦地那和辛格，2005年). 除了在造血发育中的作用外，最近的证据表明，巨噬细胞中PU.1结合位点在形成对脂多糖（LPS）、，可能是通过生成开放染色质的细胞类型特异性区域，作为对刺激作出反应时转录辅激活物募集的信标(Ghisleti等人，2010年).

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图1

原代巨噬细胞和脾B细胞PU.1结合位点的鉴定及功能分析

（A） 从造血干细胞中分化巨噬细胞和B细胞的简化方案，表明特定因子缺失对发育过渡期B细胞（蓝色）和巨噬细胞（红色）的特定基因定义因子影响最大。（B） UCSC基因组浏览器图像显示巨噬细胞特异性Csf1r基因或B细胞特异性Irf4基因的PU.1 ChIP-Seq标签。灰色虚线表示估计0.1%的错误发现率（FDR）。输入的DNA信号被放大了10倍。（C） 在巨噬细胞和B细胞中给定峰值的200 bp范围内，通过各自的标准化PU.1 ChIP-Seq标记计数（log2）显示PU.1结合的基因组位点。山峰的坐标a、 b条和c（c）从面板1B显示。Refseq转录起始位点500 bp内的峰值位置为绿色。将抖动添加到标准化标记计数中，以可视化重叠的数据点。（D） 在启动子近端和远端基因组区域中发现的常见和细胞型特异PU.1结合区域的总数。细胞类型特异性被分配给在一种细胞类型中具有比另一种细胞更大4倍的标准化标记计数的区域。（E） 启动子附近具有特定数量PU.1结合位点的基因总数。根据微阵列杂交测定的绝对标准化表达水平，将基因分为表达基因和非表达基因亚组（阈值：log₂（微阵列信号）=6.5）。（F） 1E中描述的给定峰数附近基因组合亚群的基因表达值分布。（G） 巨噬细胞和B细胞之间PU.1结合差异与基因表达差异的关系。根据与最近TSS的距离定义的PU.1结合位点子集，根据它们在不同细胞类型之间的标准化标记计数差异进行排序。报告了具有最近TSS的基因的基因表达值差异相对于差异结合的移动平均值。插入内容中报告了各组的皮尔逊相关系数（所有p值<10⁻¹⁰⁰).

为了解决谱系决定转录因子如何以细胞特异性的方式与基因组区域结合的问题，我们研究了PU.1的全基因组位置，以及其他转录因子的丢失或获得对巨噬细胞、B细胞和不同B细胞祖细胞中PU.1结合模式的影响。此外，我们评估了PU.1的丢失和获得对髓系限制性转录因子C/EBPβ顺反子的影响。我们的结果表明，细胞类型特异性顺反体是由小组谱系决定因子之间的协同作用产生的，这些因素导致DNA结合增强、核小体重塑和表观遗传增强子标记H3K4me1的随后沉积。PU.1及其协同因子在这些基因组位置的结合为其他转录因子的结合提供了切入点，而这些转录因子本身似乎并没有显著影响总调控基因分布或H3K4me1模式的形成，而是赋予这些远端位点转录功能。

巨噬细胞和B细胞中不同的PU.1结合程序

我们最初进行了染色质免疫沉淀偶联深度测序（ChIP-Seq）(Barski等人，2007年)确定小鼠腹腔巨噬细胞和脾B细胞中的PU.1池。这些分析分别在巨噬细胞和B细胞中鉴定了45631个和32575个PU.1结合的基因组位点（FDR<0.1%）(表S1)，其中包括已知的PU.1目标站点(图S1A). 在这些位点中，17130个在两种细胞类型中均被PU.1独立识别为结合位点(图1B和1C、和图S1B). 相对于基因组频率，PU.1在转录起始位点（TSS）富集，但大多数结合发生在基因间和基因内位点(图S1C).

基因组峰坐标周围标签计数的散点图可以比较直观地显示实验观察到的峰，并可以覆盖这些基因组坐标上的其他注释。（例如，与PU.1相关的标签计数在基因组坐标a、b和c处达到峰值图1B如所示图1C). 出乎意料的是，超过80%的PU.1位点定位于启动子（TSS±500 bp，绿色数据点位于图1C)两种细胞类型的占有率相似，而差异结合位点大多位于远端。(图1C和1D).

为了研究PU.1结合位点与基因表达模式的关系，我们对诱导的巨噬细胞和脾B细胞进行了转录组分析，并将每个PU.1位点的结合与最近基因的mRNA水平相关联。在分析的17004个基因中，58.0%和54.9%分别与巨噬细胞和B细胞中至少一个PU.1峰相关，其中大多数基因表现出多个峰(图1E). 与PU.1结合相关的基因更有可能被表达(图1E)每个基因的峰数与两种细胞类型中的基因表达呈正相关(图1F). 细胞类型特异性PU.1结合也与细胞类型特异基因表达相关(图1G和图S1D). 虽然这种关系是显著的（皮尔逊相关系数r²=0.30，p<10⁻¹⁰⁰)，甚至细胞类型特异性基因也常常表现出细胞类型特异和共同结合PU.1峰的混合（例如。，图1B，峰值位置（b））。对于接近TSS的峰值，细胞特异性PU.1结合和细胞特异性基因表达之间的关联最强（皮尔逊相关系数r²=0.45，p<10⁻¹⁰⁰)然而，即使远在远处的PU.1峰（>100kb）也与邻近基因表达相关（r²=0.21，p<10⁻¹⁰⁰). 这与PU.1在转录起始和增强功能中已知的不同作用一致(Fisher和Scott，1998年;Lichtinger等人，2007年).

PU.1在其他谱系决定转录因子附近结合

为了深入了解巨噬细胞和B细胞中观察到的不同PU.1结合模式的可能序列决定因素，我们检测了启动子近端和远端区域，这些区域通常或细胞类型特异性地与PU.1结合，以通过从头开始基序分析。在每个不同的亚群中，最丰富的基序几乎相同，类似于已知的PU.1共有元素(图2A和图S2A). 唯一的例外是在两种细胞类型共同的近端启动子峰发现，PU.1可能在CpG岛上发现的相关ETS位点与ETS因子（如GABPα）竞争结合(谢等人，2005). 虽然近60%的PU.1峰包含PU.1或GABP版本的ETS基序，但其余峰中最丰富的基序是退化的ETS核心基序（RRGGAASY）。总的来说，约85%的PU.1峰含有ETS位点，这有力地表明PU.1直接与其绝大多数DNA靶位点结合(图2A和表S2)

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图2

转录因子与PU.1结合位点在巨噬细胞和B细胞中共定位

（A） 序列标志对应于由从头开始启动子近端或基因间/基因内PU.1结合位点的基序分析。通过比较常见峰与随机选择的基因组区域，确定巨噬细胞和B细胞共有的PU.1位点的基序。通过直接比较每种细胞类型特有的一组峰，发现了巨噬细胞或B细胞在PU.1位点富集的基序。PU.1不同亚群峰区的基序频率报告于表S2所有图案都在背景上丰富，p值<10⁻¹⁰⁰（B）PU.1中发现的基序频率峰值（±100 bp）是巨噬细胞和B细胞中PU.1差异结合的函数。图例中报告了基于100k随机基因组区域的预期基序频率。（C） 在PU.1结合位点发现的中央PU.1基序附近AP-1、C/EBP、OCT和E2A基序的上下文特异性频率。23 bp窗口内模体频率的移动平均值集中在远端巨噬细胞特异性PU.1位点（红色）、远端B细胞特异性PU.1-结合位点（蓝色）和常见远端PU.1结合位点（灰色）（距离最近的TSS>500 bp）。（D） 差异PU.1 PU.1占用率图1C; 如果C/EBPβ峰位于PU.1峰的100 bp范围内，则PU.1峰为橙色。（E和F）序列标志分别显示了C/EBPβ和Oct-2结合位点中最丰富的序列基序。在峰中心100 bp范围内包含每个基序至少一个实例的峰的分数在基序的右侧给出，基序在50k随机区域中的预期频率在括号中给出。

除了ETS基序外，常见的启动子近端PU.1结合区也高度富集了先前已证明在启动子中普遍富集的基序(谢等人，2005) (图2A). PU.1-IRF复合物的启动子-近端和启动子-远端（通常为PU.1）结合区均表现出富集，这与PU.1和IRF4/8在这两种细胞类型的复合位点上形成三元复合物的能力一致(Eisenbeis等人，1993年;Pongubala等人，1992年). 此外，两种细胞类型中PU.1结合的启动子远端区域都富集了CTCF基序，这可能是因为CTCF结合位点通常与DNA酶I超敏反应测定的可接触染色质一致(Xi等人，2007年).

与之形成鲜明对比的是，巨噬细胞特异性和B细胞特异性PU.1结合区分别显著共同富集巨噬细胞和B细胞限制性谱系决定转录因子的基序(图2A和2B). 这在启动子近端和启动子远端区域的相似程度上是明显的(表S2). 对这些共富集基序和每个峰中PU.1基序之间的空间关系的分析表明，C/EBP和AP-1基序在巨噬细胞限制的远端PU.1位点的100 bp内高度富集，而E2A、EBF、Oct和NF-κB基序在B细胞特异性远端PU.1部位附近相应地高度富集(图2B和2C,图S2B). 相反，B细胞特异性基序在巨噬细胞特异性PU.1位点附近被耗尽，而B细胞限制性PU.1位点周围的区域被巨噬细胞特异性基序耗尽(图2C和图S2B). 次级PU.1基序也在中央PU.1基元的100 bp范围内富集，特别是在巨噬细胞特异性和常见结合位点(图S2B).

为了证实PU.1-co丰富的基序被相关的细胞类型限制性转录因子占据，我们对腹腔巨噬细胞中的C/EBPα和C/EBPβ以及脾B细胞中的Oct-2进行了ChIP-Seq。对于显示几乎相同基因组结合模式的C/EBPα和C/EBPβ，我们确定了大约40000个结合位点(表S1和图S2C). 在这些位点中，13840个（34.6%）位于PU.1结合位点的100 bp以内，其中60%是巨噬细胞特异性的，而只有1%定位于B细胞特异性PU.1峰（4×PU.1标记差异）(图2D). 对于10月2日，确定的位点数量（1191个）小于C/EBP，但结果补充了上述发现，所有10月2号位点中有596个（50%）位于PU.1峰的100 bp以内，其中43%是B细胞特异性的，小于1%的巨噬细胞特异性（4×PU.1标记差异）(图S2D). C/EBP和Oct-2结合位点与PU的基因表达表现出相似的关系。1(图S2E). C/EBP和Oct-2-结合区分别高度富集了C/EBP基序和八聚体基序(图2E). 此外，对于最近描述的C/EBP:AP-1复合元素，C/EBP结合区域被共同富集(Cai等人，2008年)以及典型的PU.1和AP-1基序，而B细胞中的Oct-2-结合区高度富集了PU.1和PU.1-IRF复合基序(图2E).

组合相互作用描绘出特定阶段的水池

PU的观察结果。1结合发生在由谱系限制性转录因子结合的基序附近，这促使我们询问PU.1与这些位点的结合是否依赖于各自因子的存在。我们在缺乏E2A和EBF（E2A）的B系祖细胞中解决了这个问题^−/−)，仅EBF（EBF^−/−)或表达这两种因子的控制细胞（Rag1^−/−)在B细胞发育的连续阶段被阻止(Dias等人，2008年;Ikawa等人，2004年;Lin和Grosschedl，1995年;Mombaerts等人，1992年)(图1A). 这些细胞群中PU.1的ChIP-Seq在E2A中分别产生44609、36908和17210个峰值^−/−、EBF^−/−和Rag1^−/−祖细胞（FDR<0.1%，表S1). 令人惊讶的是，尽管与下一个发育阶段相比，PU.1峰的总数明显减少，但每个连续阶段的特征是在新的基因组位置出现PU.1位点，而这些位点在前一个祖细胞阶段没有被PU.1占据。使用E2A中确定的PU.1位点^−/−细胞作为对照，从头开始3760、2479和9504个PU.1位点的基序分析在EBF中显示3倍以上的标签^−/−，第1页^−/−、和成熟B细胞分别显示在B细胞发育的各个阶段表达的转录因子的不同基序丰富(图3A和表S3)，表明PU.1的结合依赖于其他谱系决定转录因子的活性。例如，与EBF中的PU.1顺反子相比，获得了共富集E2A基序^−/−E2A中的电池^−/−单元格(图3A). 此外，获得的位点主要与成熟脾B细胞中与B细胞特异性PU.1结合位点相对应的基因组区域相关，例如，与CLP/pre-pro-B（EBF）相比PU.1结合部位模式的重塑^−/−)至B前细胞（Rag1^−/−)（红色数据点位于图3B).

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图3

PU.1和细胞型限制性转录因子之间的协同作用决定了巨噬细胞和B细胞特异性池

（A） B细胞发育过程中，PU.1位点附近的基序获得。根据给定基序的存在与否，对各细胞类型中以ChIP-Seq PU.1峰为中心的200bp区域进行分类。显示的是包含该基序的获得峰的分数（>3倍标记计数变化）与包含该基模的不变峰的分数的比值（<2倍标记计数改变）。绝对峰值数见补充表S3.（B）图与图1C，PU.1峰在Rag1中特别富集^−/−与EBF相比^−/−红色单元格。（C）IgK3'增强子区域PU.1结合模式的UCSC浏览器图像。从上到下：B单元格，Rag1^−/−B前细胞，E2A^−/−三苯氧胺和E2A治疗6小时后用条件E2A（E47-ER）或反式激活域缺陷E2A（bHLH-ER）重组CLP/前B细胞^−/−CLP/前B细胞，以及B细胞ChIP输入。Il7r启动子上的PU.1位点显示为PU.1结合位点的控制，该结合位点在不同细胞类型之间保持不变。（D） 与组成结合的PU.1位点相比，全长E2A重组后获得PU.1结合位点附近的顶部基序从头开始基序分析。右边和括号中分别给出了PU.1峰在获得的峰和组成束缚峰的峰中心100 bp范围内包含至少一个基序实例的分数。（E） UCSC浏览器追踪初级巨噬细胞PU.1中CD14位点的PU.1和C/EBPβ结合^−/−细胞和PUER细胞没有三苯氧胺治疗和治疗1小时后。自上而下：巨噬细胞中的PU.1、三苯氧胺治疗1小时或不治疗1小时后的PUER细胞和PU.1^−/−PU.1中的细胞（蓝色-深色到浅色）和C/EBPβ^−/−细胞、未经他莫昔芬治疗或治疗1小时后的PUER细胞和巨噬细胞（棕色至红色）。（F） PU.1-ER融合蛋白激活后，在获得的C/EBPβ位点附近富集的顶部基序与从头开始基序分析。右侧和括号中分别给出了获得峰和组成束缚峰的峰中心100 bp范围内包含至少一个基序的C/EBPβ峰的分数。

为了直接测试PU.1与B血统特异性位点的结合是否依赖E2A，我们逆转录了E2A缺乏的CLP/来源于E2A骨髓的前pro B细胞^−/−小鼠(Ikawa等人，2004年)与他莫昔芬诱导的E2A–雌激素受体配体结合域融合蛋白（E47-ER）或编码E47缺失突变体的类似结构体，该突变体保留bHLH DNA结合和二聚结构域，但缺乏两个激活域（bHLH-ER）(Sayegh等人，2003年). 在用三苯氧胺激活全长E47-ER融合蛋白6小时后，与bHLH-ER对照相比，PU.1结合在3752个位点增加了4倍以上，如IgK 3’增强子所示(图3C)，并且这些位点对于E2A基序是强烈共富集的(图3D和图S3A). 相反，缺乏转录激活域的E2A缺失突变体的表达并未显著改变这些细胞中的PU.1池蛋白（共44609个峰）(图3C).

相反，为了研究PU.1本身是否也能促进其一个顺反子相关因子的结合，我们评估了诱导PU.1活性对PU.1缺陷（PU.1KO）髓系祖细胞系中C/EBPβ结合的全基因组效应(Walsh等人，2002年). 在没有PU.1的情况下，C/EBPβ的总结合模式降低（22641个峰），与原代巨噬细胞中PU.1结合位置相关的许多结合位点丢失，如巨噬细胞特异性CD14基因所示（PU.1KO-Cebpb vs.Mac-Cebpb，图3E). PU.1中C/EBPβ结合区的基序分析^−/−细胞恢复了C/EBP、C/EBP:AP-1、AP-1和RUNX基序，以及非PU.1 Ets基序（AAC类AGGAAGT），但不是初级巨噬细胞中发现的PU.1结合基序(图S3G).

接下来，我们评估了PU.1活性对PU.1中C/EBPβ结合的影响^−/−稳定表达他莫昔芬反应性PU的细胞。1-雌激素受体配体结合域融合蛋白（PUER）(Walsh等人，2002年). 在这个诱导系统中，在没有三苯氧胺的情况下，ChIP-Seq观察到PU.1活性和DNA结合水平较低（共有8144个峰，如图3E，PUER-PU.1–0小时）。这种低水平PU.1活性与某些PU.1结合位点附近C/EBPβ结合的部分恢复有关(图3E和图S3H，PUER-C/EBPβ-0h）。三苯氧胺处理1h后，PU.1与37909个基因组区域结合，获得1710个C/EBPβ结合位点（相对于0h时间点>4×标记），恢复了大量巨噬细胞特异性PU.1结合位点。诱导的C/EBPβ结合区强烈富集为PU.1基序(图3F和图S3B)并在75%以上的位点上与PU.1共结合。有趣的是，在没有三苯氧胺的情况下，观察到57%的PU.1结合位点与C/EBPβ共结合，这意味着C/EBP和相关因素在有效PU.1浓度较低时对PU.1定位起着重要作用。

PU.1诱导连续核小体重塑和组蛋白H3K4单甲基化

最近的研究表明，谱系决定转录因子优先与以组蛋白修饰的细胞类型特异性模式标记的基因组区域相关，例如H3K4（H3K4me1）的单甲基化，这意味着可获得的染色质和/或增强子样元素(Heintzman等人，2009年). 此外，H3K4（H3K4me3）的三甲基化标志着活性和/或平衡启动子(Kim等人，2005年). 因此，我们使用ChIP-Seq分析了巨噬细胞和B细胞中的H3K4me1和H3K4me3，发现大多数（>80%）PU.1结合位点与两种细胞类型中的启动子近端H3K4-me3或远端H3K_4me1相关。PU.1在远端的细胞特异性结合与细胞特异性H3K4me1高度相关(图4A). 对所有远端PU.1结合位点平均的H3K4me1信号的基因组分布分析显示，信号以PU.1结合部位为中心显著减少的双峰模式(图4B)，类似于最近在小鼠肝脏和HeLa细胞中分别围绕启动子远端FoxA2和STAT1结合位点对H3K4me1的描述(Robertson等人，2008年). 同样，80%的远端Oct-2和C/EBP位点标记有相应的细胞特异性H3K4me1模式(图4B).

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图4

与增强子相关的组蛋白修饰需要PU.1和协同因子

（A） PU.1峰与1C峰相同，如果巨噬细胞周围区域（±500 bp）中H3K4me1标签的含量是B细胞的4倍以上，则峰呈红色。满足B细胞与巨噬细胞相同标准的峰值位置为蓝色。（B） 在PU.1（B细胞和巨噬细胞）、C/EBPβ（巨噬细胞）和Oct-2（B细胞）的远端峰值位置（距离TSS>3kb）附近显示了每碱基对的细胞类型匹配的累积归一化H3K4me1-ChIP-Seq和输入测序标签计数。（C） 不同时间点PUER细胞PU.1、C/EBPβ和H3K4me1的时空关系。以基因组位点为中心的6个kb宽区域，在三苯氧胺作用1小时后获得PU.1>6倍，根据其PU.1、C/EBPβ和H3K4me1的ChIP-Seq谱在0小时、1小时或24小时时进行聚类。所示为所得热图的代表性部分（每组的10%）。（D） MNase-Seq定义的三苯氧胺治疗1小时前后以诱导PU.1峰为中心的平均核小体位置。（E） 与巨噬细胞中启动子远端H3K4me1标记的1kb区域相关的序列基序。前4个图案来自从头开始进行了基序分析。H3K4me1标记区域的分数包含峰中心500 bp范围内每个基序的至少一个实例，在基序右侧给出，括号中为随机区域中基序的预期频率。（F） 饼图描绘了在H3K4me1-ChIP-Seq局灶性峰1kb内PU.1和C/EBPβ的重叠。（G） p300与PU.1和C/EBPβ共结合位点的关联。给出了与p300共结合的转录因子结合区域的百分比。绝对数字为：PU.1仅，总计21223，p300共绑定：1921；仅C/EBPβ，共20481个，1274个p300；PU.1和C/EBPβ，总计13874，4230，p300。通过分析p300 ChIP-Seq静息骨髓源性巨噬细胞数据，确定p300的峰值位置(Ghisleti等人，2010年).

这些观察结果促使我们解决了H3K4me1是否作为征集PU.1和协同转录因子的信标，和/或这些因子是否能够启动该标记的沉积的问题。使用PUER诱导系统，我们在0，三苯氧胺治疗1小时和24小时。1h后观察到H3K4me1信号几乎没有变化（获得38个峰），但到24h时，3328个位置出现显著增加（>4×tags，占0h时H3K4me1总峰的15%）。评估PU之间的关系。1结合和H3K4me1，我们选择了7428个高诱导PU.1结合位点的子集（1小时标记数增加8倍以上），0小时标记数少于2个。这些结合位点可分为三组，每组的代表性峰显示在图4C最大的一组（第一组，43%）由PU.1活化24小时后显著增加H3K4me1的位点组成。获得的H3K4me1信号显示出双峰空间分布，与PU.1相关H3K4me1在巨噬细胞和B细胞中的观察结果相同(图S4A). 加上90%获得H3K4me1的位点位于获得PU.1位点的1kb窗口内，这些发现表明需要PU.1结合来指导H3K4me1在这些位点的局部沉积。第二组（32%）由诱导的PU.1结合位点组成，这些位点由预先存在的H3K4me1标记。在该组中，PU.1结合在1小时和24小时启动了局部含H3K4me1核小体的重塑，再次建立了与巨噬细胞和B细胞相同的模式(图S4A). 第三组（25%）由峰值组成，尽管PU.1结合稳定，但在任何时间点H3K4me1均未富集，这表明PU.1结合不足以确定这一标记。相对于第三组的峰值（11%）（<100 bp），第一组（37%）和第二组（30%）C/EBPβ的补充增加表明H3K4me1沉积可能需要其他因素。在三苯氧胺处理24小时后，PUER细胞中上调超过4倍的464个邻近基因富集了I组和II组峰，而非III组峰(Weigelt等人，2009年) (图S4B).

为了研究第II组峰中H3K4me1标记的核小体的重塑是否与核小体占据的变化一致，我们使用MNase Seq绘制了核小体位置(Schones等人，2008年)用三苯氧胺治疗后0小时和1小时在PUER细胞中。对三苯氧胺治疗前7428个区域的核小体模式进行分析，其中PU.1在1小时内最大获得，显示出一个半规则模式，在相邻核小体之间的扩展连接区上暴露出预期的PU.1结合位点(图4D). 这种预先存在的模式可能是由于PU.1结合水平较低，在当前测序深度下低于ChIP-Seq的检测，因为使用基于qPCR的ChIP分析可以在未处理的PUER细胞中的许多位点检测PU.1（数据未显示）。PU.1结合的诱导导致整个诱导位点上的核小体重塑，类似于第二组H3K4me1标记核小体所建议的那样，导致以PU.1结合位点为中心的连接区进一步扩大，核小体沿着DNA的任意方向压缩约1kb。这些发现一致表明，在第一组位点发生了一系列事件，其中PU.1结合诱导核小体重塑，随后H3K4单甲基化。

结合位点的简单组合确定H3K4me1标记区域的细胞类型特异性储备

PU.1和血统决定转录因子与巨噬细胞和B细胞中细胞特异性H3K4me1的显著关联，使我们进行了从头开始对每个细胞类型中约20000个由H3K4me1标记的远端基因组区域进行基序分析。该分析表明，巨噬细胞中这些区域的PU.1、AP-1、C/EBP和RUNX基序最为丰富(图4E)而B细胞中H3K4me1标记的区域显示PU.1、E2A、OCT、EBF和RUNX基序的最大富集(图S4C). 该计算结果得到了ChIP-Seq数据的支持，表明巨噬细胞中H3K4me1阳性区域的大多数（70%）被PU.1和/或C/EBPβ结合(图4F)与PU.1（以及可能的C/EBP）结合可以诱导H3K4me1沉积的发现一致。值得注意的是，p300在静止巨噬细胞中的全基因组定位分析(Ghisleti等人，2010年)表明PU.1和C/EBPβ共同结合的基因组位置显著富集(图4G).

为了确定启动子远端H3K4me1和其他细胞类型中转录因子的结合位点之间是否存在类似的关系，我们进行了从头开始小鼠胚胎干细胞H3K4me1/H3K4me3 ChIP-Seq数据集的基序分析(Meissner等人，2008年;Mikkelsen等人，2007年)，肝脏(Wederell等人，2008年)，人CD4⁺T细胞(Barski等人，2007年)和CD36⁺红细胞前体(Cui等人，2009年). 与巨噬细胞和B细胞的结果类似，这些组织中H3K4me1标记的启动子远端区域高度富集了生成和维持每个细胞表型所需的转录因子的基序(Ivanova等人，2006年;罗森伯格和塔贡，2005年;Zaret等人，2008年) (图S4C). 例如，ES细胞中H3K4me1标记的启动子远端区域显著富集了KLF4、OCT4、SOX2和Esrrβ的结合位点，这些因素的结合足以将体细胞重新编程为诱导的多能干细胞(Feng等人，2009年). 在CD4中⁺T细胞，该分析揭示了H3K4me1标记区域与Ets和Runx基序的强烈关联，这与其在T细胞发育和功能中已知的基本作用一致(图S4C) (罗森伯格和塔贡，2005年). 在这种细胞类型中，可以获得多种组蛋白修饰的核小体位置、DNA酶超敏反应和单核小体ChIP-Seq的全基因组数据，从而可以精确确定核小体位置、染色质可及性和组蛋白修饰(Barski等人，2007年;Boyle等人，2008年;Schones等人，2008年). H3K4me1-ChIP-Seq、总核小体序列标签位置和DNase I在富含H3K4me1标记的启动子远端区的Ets基序上的比对显示，Ets基序周围的核小体定相与我们在PUER细胞中在PU.1周围观察到的模式相似，伴随着Ets位点DNase I超敏反应的急剧增加(图S4F). 这一结果与标签分布平均值上的数据对齐时观察到的连续核小体分布形成鲜明对比(图S4F)并确定转录因子基序上H3K4me1模式的中心间隙反映了核小体的绝对位置，并代表了这些启动子远端位点的主要DNase I可访问位置。

PU.1为信号反应转录因子建立细胞型特异性顺反池

鉴于已知大量转录因子在每种细胞类型中发挥重要作用（例如，巨噬细胞和ES细胞中转录的转录因子超过350个，参见图S4D)令人惊讶的是，在我们分析的不同细胞类型中，只有少数转录因子基序在H3K4me1模式中高度过度表达(图S4C和S4E). 为了探讨H3K4me1标记区中模体不丰富的转录因子与H3K4me1相关因子、全球H3K4-me1模式和细胞类型特异性基因表达的关系，我们首先关注肝X受体（LXRα和LXRβ）。这些对氧化甾醇有反应的核受体通过调节参与脂质代谢、细胞存活和免疫的靶基因，在巨噬细胞功能中发挥着许多核心作用(Rigamonti等人，2008年).

ChIP-Seq的体内小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系中生物素标记的LXRβ（在图S5A和S5B)确定了664个可靠的LXR结合位点（FDR<0.1%），其中85%位于邻近基因TSS的远端(图5A). 原代巨噬细胞内源性LXRβ的传统、基于抗体的ChIP分析证实了12个典型LXR结合位点中的12个(图S5C). While期间从头开始基序分析确定共有LXR反应元件（DR4）是最丰富的基序，PU.1和AP-1基序在LXRβ结合区也高度共富集(图5B). 与基序富集一致，34%的LXRβ峰位于初级巨噬细胞PU.1结合位点的100 bp范围内(图5C)，以已建立的LXR靶基因Abcg1为例(图5D). 此外，巨噬细胞LXR结合位点表现出巨噬细胞特异性H3K4me1特征，与肝脏中相同位点周围的H3K4me1模式相反(Robertson等人，2008年)LXR发挥关键调节作用的另一种组织(图5E和5G).

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图5

PU.1在巨噬细胞中围绕LXRβ结合位点建立了部分LXR？池蛋白和H3K4me1模式，但反之亦然

（A） RAW264.7小鼠巨噬细胞中生物素标记的LXRβ的ChIP-Seq定义的高置信LXR？结合位点的基因组注释。（B）从头开始巨噬细胞LXR结合区的基序分析。在峰中心100 bp范围内包含每个基序至少一个实例的峰的分数在基序右侧给出，括号中为随机区域中基序的预期频率。（C） 巨噬细胞和B细胞PU.1结合图1C; 如果LXRβ峰位于PU.1峰的100 bp范围内，则PU.1峰位置为绿色。（D） LXR靶基因位点ABCG1的UCSC浏览器图像，描绘了LXR和PU.1的坐标结合，以及相关的H3K4me1特征。2.5倍放大的BirA控制轨迹表示从不含BLRP标记蛋白的甲醛固定BirA转基因RAW264.7中下拉的序列。（E） PU.1中累计H3K4me1水平^−/−髓系祖细胞（PU.1^−/−)，用三苯氧胺（PUER 24 h）处理24 h的PUER细胞或作为对照的小鼠肝脏（肝脏H3K4me1 ChIP-Seq数据来自(Robertson等人，2008年))在RAW264.7巨噬细胞中定义的LXRβ峰位置附近。（F） PU.1中指定位点的LXR结合^−/−通过ChIP-qPCR比较用三苯氧胺处理24小时的细胞与PUER细胞。数值表示使用IgG对照抗体在ChIP上的倍数富集。（G） LXRα来源的骨髓巨噬细胞中H3K4me1的累积水平^−/−/LXRβ^−/−小鼠（LXR DKO BMDM）、野生型小鼠（WT BMDM）或肝脏(Robertson等人，2008年)作为非巨噬细胞对照，在RAW264.7巨噬细胞中定义的LXRβ峰值位置附近。（H） 散点图，描述野生型小鼠（WT MФ）或LXRα骨髓衍生巨噬细胞中定义的组合基因组PU.1峰值位置200 bp内的PU.1 ChIP-Seq标签计数（log2）^−/−/LXRβ^−/−小鼠（LXR DKO MФ）。RAW264.7巨噬细胞中LXRβ峰100 bp范围内的基因组PU.1峰呈红色。

为了确定LXR和PU.1对彼此DNA结合谱的影响，比较了PU1中不含或含PU.1的LXR结合谱^−/−与之相反，在野生型和LXRα/β双敲除骨髓源巨噬细胞中评估PU.1结合。PU.1中LXRβ的定量ChIP分析^−/−与他莫昔芬处理的PUER细胞相比，LXRβ募集到邻近PU.1结合位点（100 bp内）是PU.1依赖性的(图5F). 对于不靠近PU的LXRβ结合位点，情况并非如此。1(图5F)，表明PU.1以空间受限的方式确定LXR绑定。与这些发现一致，巨噬细胞特异性LXRβ结合区在H3K4me1信号中显示出显著的PU.1依赖性增益，与PU中的H3K4me1 ChIP-Seq谱相比较。1^−/−与他莫昔芬处理的PUER细胞(图5E). 相反，在LXRα/β双敲除巨噬细胞中，巨噬细胞特异性LXRβ结合位点周围的PU.1池蛋白和H3K4me1模式没有显著改变(图5G和5H)这表明LXR对定义PU.1池蛋白或在这些区域建立H3K4me1模式没有贡献。

LXR和TLR依赖性基因表达需要PU.1

虽然PU.1结合位点与邻近基因的表达显著相关(图1E和1F)，使用瞬时报告基因分析法对休眠巨噬细胞和B细胞中71个位点进行了无偏分析，结果表明，相对较小的部分（15%）具有构成增强子活性(图S6A). 鉴于PU.1参与建立巨噬细胞特异性LXR池蛋白的发现，其中许多位点可能参与定义每种细胞类型中的上下文和信号依赖性转录库。为了支持这一概念，包含LXR和PU.1结合位点的区域在脊椎动物中表现出显著的序列保守性，这与其作为功能性信号反应调节模块的潜在重要性一致(图S5D). 邻近LXR靶基因的代表性LXR-PU.1共结合基因组区域的功能分析（定义为它们对初级巨噬细胞中合成的LXR配体GW3965的反应性，图S6B)通过对RAW264.7细胞的瞬时报告基因分析，证明11个基因组区域中有10个区域表现出配体依赖性增强子活性(图6A). 此外，在PUER细胞中诱导LXR靶基因对LXR激动剂GW3965的反应明显依赖于PU.1(图6B).

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图6

PU.1是巨噬细胞中LXR-和TLR4依赖性基因表达所必需的

（A） 插入RAW264.7巨噬细胞中驱动荧光素酶表达的最小TK启动子上游的指示LXR-结合区的相对增强活性。数据显示为用1µM GW3965处理24小时后与载体（DMSO）进行的三次独立实验的平均折叠变化（±SEM）。（B） 用三苯氧胺或载体（EtOH）处理PUER细胞24小时，然后用1µM GW3965或载体（DMSO）再处理24小时。通过定量实时RT-PCR（qRT-PCR）比较GW3965与载体在两个独立实验中的平均mRNA表达倍数变化（±SEM）显示，所有表达变化均具有统计学意义（p<0.05，t检验）。（C） 相邻PU.1、C/EBPβ和H3K4me1峰在与KLA在6 h诱导的基因相关的静止巨噬细胞中重叠。（D）PUER细胞用载体（DMSO）或三苯氧胺处理24 h，然后用载体（PBS）或KLA处理6 h。所示TLR4应答基因的信使RNA水平通过qRT-PCR测定，并显示为热图，与每个基因的平均表达水平相比，绝对表达值从低（蓝色）到高（红色）不等。星号表示KLA反应依赖于PU.1的基因。（E） 描述拟议模型的示意图。

测试此类PU是否。1依赖性是定义巨噬细胞特异性输出的其他转录程序的一个特征，我们评估了PUER细胞中TLR4信号反应对PU.1的依赖性。TLR4连接通过激活众多信号依赖性转录因子，包括NF-κB和干扰素调节因子，诱导参与先天性免疫反应的巨噬细胞中数百个基因表达的高度变化(Lee和Kim，2007年). 用特异性TLR4激动剂Kdo2脂质A（KLA）处理6小时的原代巨噬细胞的转录组分析鉴定了735个诱导超过3倍的基因。静息巨噬细胞中PU.1和C/EBPβ结合分别发生在这些基因的641和583附近，在KLA刺激之前，这两个因子与这些基因相关的654个H3K4me1标记区域中的537个共同定位，单独或共同定位(图6C). 对PUER系统中20个基因的定量转录分析表明，14个需要PU.1结合的诱导才能对KLA产生定性或实质性定量反应(图6D). 未经处理的PUER细胞中其余基因的完全反应表明，TLR4信号通路在PU.1激活之前是有功能的。

讨论

在这里，我们提供了证据，证明PU.1和小组其他谱系决定转录因子在紧密结合位点的协同作用建立了它们各自的巨噬细胞和B细胞特异性池的很大比例。这些因子的基序的空间分布和频率表明，这些模式是由每个因子与其同源DNA基序的直接结合而产生的，而不是由一个因子与另一个因子相互联系。相反，基序之间缺乏固定距离，彼此之间的富集在100 bp以内，并且在可诱导PU的位点周围观察到核小体重塑。PUER细胞中的1结合，通常与C/EBPβ结合，与这些因子的同时结合能够与核小体有效竞争的机制一致(Miller和Widom，2003年)定义单元格类型特定的绑定模式。

PU.1结合导致启动子远端位点H3K4me1标记沉积，与细胞类型特异性基因表达模式相关(Heintzman等人，2009年)提供了PU.1有助于在全基因组范围内“书写”这种表观遗传特征的初步证据。我们的数据还表明，PU.1结合和核小体重塑不足以在所有情况下导致该标记的沉积(图4C，组III），表明最终导致H3K4单甲基化的机制还需要与其他转录因子（如C/EBPβ）协同作用。此外，在巨噬细胞和B细胞的局部H3K4me1标记的启动子远端区域富集了基序，并且在三种因子（C/EBPα/β，Oct-2）的结合位点周围形成了H3K4me1模式提示其他H3K4me1相关因子也参与核小体置换和靶向H3K4me1沉积在其结合位点周围。观察到H3K4me1标记的区域在其他组织和细胞类型中，包括肝脏、红细胞、T细胞和ES细胞，也表现出相应谱系决定因子的有限组基序的富集(图S4C)提出了一种在不同细胞类型中识别此类因子的通用方法，了解这些因子可能有助于细胞重新编程。

综上所述，我们的研究结果支持一种模型，即两层转录因子协同激活巨噬细胞和B细胞发育和功能所需的顺式调节元件(图6E). 第一层由相对较小的谱系决定因子集组成，如PU.1、C/EBP和E2A，它们以协作的方式作用，以细胞类型特异性的方式描绘出大量潜在的顺调控元素（以巨噬细胞为例图6E). 这些因子的具体属性使其发挥这一作用尚待确定，但可能包括表达水平和参与核小体重塑因子的能力，以及最终产生可获得的“原增强子”结构的组蛋白修饰酶。与此一致的是，野生型E2A在B细胞特异性基因组位点诱导PU.1结合，这些位点包含紧密间隔的PU.1和E2A基序，而能够与DNA结合但缺乏转录激活功能的突变型E2A则不能(图3C). 这一结果强调了除已知的转录起始作用外，反式激活域在使组合转录因子与增强子样元件处的染色质化DNA结合方面的重要作用。

我们提供了进一步的证据，证明通过谱系决定因子启动顺式活性元素是后续第二层因子结合所必需的，以LXR为例(图6E)以及被TLR4信号激活的转录因子。最近的观察结果支持了这一解释，即巨噬细胞对TLR4激活的反应中，p300向新基因组位置的募集主要发生在先前存在H3K4me1的区域(Ghisleti等人，2010年)从我们的分析来看，它们主要是PU.1、C/EBP和AP-1转录因子组合相互作用的位点。总之，这些顺序事件导致功能活性增强剂能够促进细胞类型特异性和/或信号依赖性基因表达，类似于巨噬细胞发育过程中导致Csf1r位点激活的顺序步骤(Krysinska等人，2007年). 该模型为以前各种研究中观察到的转录因子广泛的全基因组和细胞类型特异性共同定位提供了解释(Chen等人，2008;麦克阿瑟等人，2009年)，并深入了解了谱系限制性转录因子在全基因组范围内的简单组合如何指定启动子末端顺式调控元件，这些元件最终负责细胞身份和细胞类型对不同信号输入的特异性反应。

实验程序

补充材料

致谢

脚注

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