Global analysis of TDP-43 interacting proteins reveals strong association with RNA splicing and translation machinery

Brian D. Freibaum; Raghu Chitta; Anthony A. High; J. Paul Taylor

doi:10.1021/pr901076y

蛋白质组研究杂志。作者手稿；PMC 2011年2月5日发布。

以最终编辑形式发布为：

蛋白质组研究杂志，2010年2月5日；9(2): 1104–1120.

数字对象标识：2010年10月21日/1990年07月06日

预防性维修识别码：项目经理2897173

NIHMSID公司：美国国家卫生研究院167817

PMID：20020773

TDP-43相互作用蛋白的全局分析显示与RNA剪接和翻译机制密切相关

布莱恩·弗雷巴姆,¹ 拉胡·奇塔,² 安东尼·A·高,²和J.保罗·泰勒^1,^*

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关联数据

补充材料: NIHMS167817-补充-补充_1.pdf（616000）
GUID:24144BF5-7F5F-48AD-AB25-B12EE6E9AB15

摘要

TDP-43是异质核核糖核蛋白（hnRNP）家族中一个高度保守且普遍表达的成员。最近，TDP-43被证明是大多数肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者泛素化包涵体中的主要疾病蛋白，陶-额颞叶变性阴性（FTLD）和包涵体肌病。在这些疾病中，TDP-43从其主要的细胞核位置重新分布到泛素阳性的细胞质病灶。TDP-43在多大程度上驱动病理生理学尚不清楚，但在家族型ALS和FTLD-U中TDP-43突变的鉴定表明该蛋白在发病机制中具有重要作用。目前对TDP-43的功能知之甚少，之前仅鉴定出少量TDP-43相互作用蛋白，这使得进一步了解TDP-43正常和病理功能变得困难。在这里，我们通过全球蛋白质组学方法表明，TDP-43与调节RNA代谢的蛋白质具有广泛的相互作用。研究发现，与TDP-43的一些相互作用依赖于RNA结合，而其他相互作用则依赖于RNA。TDP-43（A315T和M337V）的致病突变不会改变其相互作用谱。TDP-43相互作用蛋白主要聚集在两个不同的相互作用网络中，一个是核/剪接簇，另一个是细胞质/翻译簇，这强烈表明TDP-43在RNA代谢中起着多重作用，在细胞核和细胞质中都发挥着作用。最后，我们发现许多TDP-43相互作用物是应激颗粒的已知成分，事实上，我们发现TDP-43也被招募到应激颗粒中。

介绍

RNA结合蛋白TDP-43¹最近被确定为肌萎缩侧索硬化症（ALS）散发型和家族型的泛素化包涵体中的主要疾病蛋白，陶-额颞叶变性阴性（FTLD）和包涵体肌病。TDP-43病理学也经常伴随帕金森病和阿尔茨海默病的病理学病理学²^-⁴在这些疾病中，TDP-43从其主要的核位置重新分布到泛素阳性的细胞质病灶。TDP-43在多大程度上驱动病理生理学尚不清楚，但TDP-43突变的鉴定揭示了该蛋白在罕见的家族型ALS和FTLD发病机制中的重要作用⁵^-⁹。

TDP-43是异质核核糖核蛋白（hnRNP）家族中一个高度保守且普遍表达的成员¹⁰.TDP-43包含两个RNA识别基序（RRM），并主要通过其中的第一个基序结合RNA¹TDP-43富含甘氨酸的C末端已被证明能与其他几种hnRNP蛋白，特别是hnRNP A1、A2/B1、C1/C2和A3相互作用¹¹，尽管TDP-43相互作用的全部范围之前尚未描述。TDP-43主要是一种核蛋白，已被证明在细胞核和细胞质之间穿梭¹²有趣的是，作为对神经元损伤的生理反应，TDP-43重新分布到细胞溶质颗粒，恢复后核定位恢复¹³^,¹⁴。

尽管从实验系统中有证据表明TDP-43可以在转录、剪接和翻译等多个水平上负调控目标基因的表达，但对TDP-43的功能知之甚少¹⁵^-¹⁷尽管TDP-43靶基因的完整范围以及TDP-43对其表达的影响尚不清楚。此外，对于病理性TDP-43如何在病变细胞中发挥作用，目前还没有明确的共识。

迄今为止，只有少数TDP-43相互作用蛋白被鉴定出来，这使得进一步了解TDP-43的正常和病理功能变得困难。在这里，我们通过全球蛋白质组学方法表明，TDP-43与调节mRNA代谢的蛋白质有广泛的相互作用。TDP-43相互作用蛋白主要聚集成两个不同的蛋白质相互作用网络。第一个是调节RNA剪接和核RNA代谢其他方面的核蛋白网络，第二个是调节mRNA翻译的细胞质蛋白网络。此外，我们发现TDP-43与某些蛋白质的相互作用依赖于TDP-43和RNA的相互作用，而其他相互作用则依赖于RNA。令人惊讶的是，致病突变A315T和M337V并没有改变TDP-43相互作用的模式。已知翻译调控簇中的许多蛋白质在应激颗粒中积累，事实上，我们发现TDP-43也被招募到应激颗粒中。

方法

质粒

将FLAG-TDP-43亚克隆到哺乳动物表达载体pcDNA 3.1（+）中(Invitrogen公司). 利用PCR产生W113A和R151A突变的FLAG-TDP-43（A315T）、FLAG-TDP43（M337V）和FLAG-TDP43（mutRRM），以进行定点突变。

免疫沉淀/免疫印迹

10厘米²将生长在1:1 DMEM/F12培养基混合物中的HEK-293T或HeLa细胞平板转染5μg FLAG-TDP-43或相关TDP-43突变质粒48小时。然后在温和的裂解缓冲液中裂解细胞（1X PBS，5mM EDTA，0.2%NP-40，10%甘油+罗氏完全无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒Cat#11836170001），通过21号针头五次，在20000下旋转克持续10分钟。使用蛋白G亲和凝胶（Sigma，Cat#E3403）预先清除上清液30分钟，然后使用抗-FLAG M2亲和凝胶在4C下免疫沉淀1.5小时。然后使用FLAG肽（Sigma，Cat#F3290）在4C温度下洗脱免疫沉淀30分钟。如有指示，在免疫沉淀前溶解后立即添加330μg RNase A（Sigma，类别号R4642）。对于来自小鼠脑组织的免疫沉淀，如上所述裂解小鼠脑匀浆，然后用2.5μg TDP-43多克隆抗体（Proteintech，Cat#10782-2-AP）进行免疫沉淀。作为对照，使用正常兔IgG对一半的匀浆进行免疫沉淀。

在8-16%梯度三甘氨酸凝胶上分离裂解产物/免疫沉淀。M2单克隆抗体（Sigma，Cat#F1804）和TDP-43多克隆抗体（Proteintech，Cat#10782-2-AP）用于观察TDP-43。还使用多克隆抗体分别对PABPC1、hnRNP H和hnRNP U进行可视化（Abcam Cat#ab21060和ab10374，Bethyl Laboratories Cat#A300-689A）。

免疫荧光

使用FuGENE 6（Roche Diagnostics）用FLAG-TDP43或FLAG-TDP-43（mutRRM）瞬时转染在室载玻片（Lab Tek Cat#154917）上生长的HEK-293T细胞。48小时后，将HEK-293T细胞在室温下固定在PBS中4%甲醛中10分钟。然后用0.5%Triton-X在PBS中渗透细胞，并用一级抗体孵育1小时，以观察TDP-43、hnRNP H、PABPC1、EIF4G和G3BP1。然后清洗细胞，并使用与罗丹明红-X和FITC（Jackson Immunoresearch）结合的二级抗体观察蛋白质。然后清洗细胞，用DAPI染色，并用63X物镜在徕卡DMIRE2荧光显微镜上观察。

抗体

使用以下主要抗体对蛋白质进行可视化：小鼠抗FLAG M2（western blot和免疫荧光1:1000）（Sigma Cat#F1804）、兔抗TDP-43（免疫荧光1:350）（Proteintech Group Cat#10782-2-AP）、兔抗体PABPC1（westernblot 1:1000，免疫荧光1:200）（Abcam Cat#ab21060-100）、，兔抗hnRNP H（1:10000 western blot，1:500用于免疫荧光）（Abcam，Cat#10374-50）、鼠抗G3BP1（1:200用于免疫荧光（BD Transduction Laboratories Cat#611126）和兔抗EIF4G（1:200用来免疫荧光）

LC-MS/MS蛋白质鉴定

将FLAG表位标记的TDP-43构建物转染到HEK293T细胞并如上所述进行免疫沉淀。然后在8-16%的凝胶上运行样品，并按如下所述进行分析。

蛋白质的酶消化

将含有免疫沉淀样品的凝胶条带手动切割成分子量在14kDa到大于200kDa之间的24条带。然后分别消化每条蛋白带，如下所示。将蛋白质带切割成小塞子，用50%乙腈洗涤，并在含有50%乙腈的100 mM pH值为8的碳酸氢铵中进行几次培养以去除其污染。进行还原（10 mM，37°C下DTT 1小时）和烷基化（50 mM碘乙酰胺，室温黑暗中45分钟），然后用50%乙腈在50mM碳酸氢铵中清洗凝胶塞两次。然后使用speedvac（Savant）干燥凝胶塞，并在10μl 0.2 ug胰蛋白酶中重新水化。10分钟后，向试管中加入25微升pH值为8的25 mM碳酸氢铵。在37°C下进行过夜（约12小时）酶促反应后，使用20至30微升0.2%甲酸从凝胶塞中提取肽。然后将溶液转移到样品瓶中进行LC-MS/MS分析。将未转染的细胞作为对照，并以相同的方式处理以确定非特异性相互作用。

电喷雾电离离子阱质谱分析

使用ThermoFisher LTQ XL线性离子阱质谱仪和nanoAcquity超性能LC系统（Waters Corporation，Milford，MA）进行LC-MS/MS分析。将上述产生的色氨酸肽加载到“预柱”（Symmetry C18，180μm i.d X 20mm，5μm颗粒）（Waters Corporation，Milford，MA）上，该“预柱“通过零死体积接头连接到分析柱（BEH C18，75μm i.d.X 100mm，1.7μm颗粒”）（Water Corporation，Milford，MA）。然后以250nL/min的流速在梯度上洗脱肽（60分钟内0-70%B，10分钟内70-100%B，其中B=70%乙腈，0.2%甲酸），并使用电喷雾电离（ESI）在线引入线性离子阱质谱仪（加利福尼亚州圣何塞市ThermoFisher公司）。结合数据相关扫描，从全扫描质谱中选择10个最丰富的离子（每个光谱一个微扫描；前体隔离宽度3.0Da，35%碰撞能量，30ms离子激活，排除持续时间：30s；重复持续时间：15s；重复计数：2），以通过碰撞激活解离（CAD）进行碎片化。

数据库搜索

上述生成的产物离子（b/y型离子）用于针对Swissprot（Swissprot57.1，智人子集）数据库¹⁸用胰蛋白酶（1个缺失的裂解酶）作为消化酶。研究中允许进行以下残基修饰：半胱氨酸上的氨基甲酰化和蛋氨酸上的氧化。搜索吉祥物时，前体离子耐受性为1.0 Da，片段离子耐受性0.6 Da。使用吉祥物中的自动诱饵数据库搜索工具，估计超过身份阈值的肽匹配错误发现率为4%。此外，还对两个mgf文件进行了搜索（一个用于IP车道，另一个用于控制车道），这些文件是通过合并每个车道中所有频带的数据生成的。通过Scaffold（Proteome Software，Portland，OR）和对原始数据的手动检查，进一步验证了自动搜索的识别。如果按照肽Prophet算法的规定，以大于95%的概率建立肽鉴定，则接受肽鉴定¹⁹。如果蛋白质鉴定的概率大于99%，并且含有至少2种已鉴定的肽，则可接受蛋白质鉴定。蛋白质概率由蛋白质先知算法分配²⁰。

结果

HEK-293细胞中TDP-43相互作用蛋白的鉴定

通过FLAG-TDP-43的免疫沉淀分离人上皮肾（HEK-293T）细胞中的TDP-43相互作用蛋白，然后通过质谱鉴定共纯化蛋白(图1A,补充图1). 我们发现与对照组相比，FLAG-TDP-43免疫沉淀物中富集了261个蛋白质(表1). 在这261种蛋白质中，126种仅与TDP-43相关。与免疫沉淀相比，对照组中有68个蛋白质富集，表明我们的免疫沉淀具有高度特异性(补充表1).

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图1

FLAG免疫沉淀法鉴定TDP-43相互作用蛋白

(A类)用凝胶电泳分离表达FLAG-TDP-43的HEK-293T细胞或对照HEK-293细胞的免疫沉淀物，并用Sypro-Ruby染色以显示蛋白质。对照组和FLAG-TDP-43通道沿凝胶全长被分离成24条带，并通过质谱分析。出于可视化目的，删除了干预性空车道。(B类)TDP-43相互作用蛋白功能类的饼图表示。

表1

TDP-43相互作用蛋白质

与对照组相比，通过质谱鉴定的蛋白质在TDP-43免疫沉淀中富集。括号中的蛋白质符号是STRING指定的基因名称，用于图2如果它与官方的基因名称不同。最后一栏中的星号表示控制通道中未发现肽。

蛋白质名称	符号	分子量（kDa）	加入号码	总光谱：FLAG IP	独特肽：FLAG IP	覆盖率：FLAG IP	总光谱：对照	独特肽：对照	覆盖率：控制	折叠光谱增加：IP/控制
TAR DNA-结合蛋白43	TARDBP公司	45	问题13148	176	17	35	0	0	0	*
40S核糖体蛋白S3	转速3	27	第23396页	68	16	55	22	10	47	3.1
核仁蛋白	NCL公司	77	第19338页	57	20	25	19	8	11	3
聚腺苷酸结合蛋白1	PABPC1	71	1940年1月	53	27	36	27	16	25	2
热休克同源71 kDa蛋白	热休克蛋白8	71	第1142页	51	23	33	13	7	14	3.9
依赖ATP的RNA解旋酶A	DHX9型	141	问题08211	49	27	23	14	12	10	3.5
组蛋白H1.3	HIST1H1D公司	22	第16402页	46	7	19	5	三	15	9.2
热休克70 kDa蛋白1	热休克蛋白A1	70	P08107号	44	23	28	14	10	17	3.1
异质核核糖核蛋白U	HNRNPU（HNRPU）	91	Q00839问题	43	16	17	15	8	9	2.9
白细胞介素增强因子3	ILF3级	95	问题12906	42	14	17	10	5	7	4.2
推测ATP-依赖RNA解旋酶DHX30	DHX30型	134	问题7L2E3	41	24	18	2	2	2	20.5
40S核糖体蛋白S9	RPS9型	23	第46781页	40	15	46	9	三	9	4.4
60S核糖体蛋白L7a	RPL7A型	30	第62424页	38	12	35	11	三	9	3.5
异质核核糖核蛋白A2/B1	HNRNPA2B1（HNRPA2B1）	37	第2626页	38	9	24	13	5	17	2.9
异构核核糖核蛋白C1/C2	HNRNPC（HNRPC）	34	P07910号	34	12	28	6	5	19	5.7
胰岛素样生长因子2 mRNA-结合蛋白1	IGF2BP1型	63	问题9NZI8	33	17	31	20	13	27	1.7
可能依赖ATP的RNA解旋酶DDX5	DDX5型	69	第17844页	32	15	27	8	5	9	4
40S核糖体蛋白S18	RPS18型	18	第62269页	31	11	49	5	三	19	6.2
40S核糖体蛋白SA	RPSA公司	33	P08865号	30	12	42	7	三	13	4.3
60S核糖体蛋白L6	RPL6型	33	企02878	30	9	29	三	三	9	10
核仁RNA解旋酶2	DDX21型	87	问题9NR30	29	16	20	0	0	0	*
RNA结合蛋白武藏同源物2	MSI2系列	35	Q96DH6号机组	29	5	21	0	0	0	*
胰蛋白酶-3	减贫战略3	33	第35030页	29	三	10	18	2	7	1.6
La相关蛋白1	LARP1号机组	124	Q6PKG0	27	11	9	4	三	4	6.8
异质核核糖核蛋白A1	HNRNPA1（HNRPA1）	39	P09651型	27	8	25	8	5	18	3.4
推测解旋酶MOV-10	移动10	114	问题9HCE1	26	18	21	7	6	8	3.7
无意义转录物调节器1	UPF1（UPF1）	124	Q92900问题	25	18	14	2	2	2	12.5
蛋白	TUBB公司	50	P07437号	25	8	20	12	7	19	2.1
40S核糖体蛋白S3a	RPS3A型	30	第61247页	24	11	36	4	三	10	6
可能依赖ATP的RNA解旋酶DDX17	DDX17型	72	问题92841	23	11	20	1	1	2	23
40S核糖体蛋白S16	RPS16型	16	第62249页	23	7	42	4	三	19	5.8
异质核核糖核蛋白Q	SYNCRIP简介	70	O60506号机组	23	9	15	8	6	7	2.9
异质核核糖核蛋白K	HNRNPK公司	51	第61978页	23	10	25	19	11	28	1.2
40S核糖体蛋白S2	RPS2型	31	第15880页	22	9	27	2	2	7	11
异质核核糖核蛋白M	每分钟转速	78	第52272页	22	13	24	三	三	5	7.3
依赖ATP的DNA解旋酶2亚单位1	XRCC6型	70	第12956页	21	12	17	0	0	0	*
40S核糖体蛋白S6	RPS6系列	29	第62753页	21	7	17	2	1	三	10.5
异质核核糖核蛋白U样蛋白1	HNRNPUL1（HNRPUL1）	96	问题9BUJ2	21	9	13	1	1	2	21
60S酸性核糖体蛋白P0	RPLP0型	34	P05388号	21	12	47	4	三	10	5.3
60S核糖体蛋白L26	RPL26型	17	第61254页	20	6	29	2	1	6	10
60S核糖体蛋白L8	RPL8型	28	第62917页	20	6	19	三	1	4	6.7
40S核糖体蛋白S4，X亚型	RPS4X系列	30	第62701页	20	12	46	7	4	17	2.9
锌指CCCH型抗病毒蛋白1	ZC3HAV1型	101	Q7Z2W4型	19	12	14	0	0	0	*
泛素	RPS27A（UBB）	9	第61864页	19	三	45	8	2	33	2.4
异质核核糖核蛋白D0	HNRNPD公司	38	问题14103	19	7	25	10	三	9	1.9
聚（rC）结合蛋白2	PCBP2型	39	问题15366	19	7	25	9	5	19	2.1
ATP-依赖RNA解旋酶DDX1	DDX1接口	82	问题92499	19	10	15	15	7	10	1.3
BAT2结构域蛋白1	BAT2D1电池	317	Q9Y520型	18	9	三	0	0	0	*
60S核糖体蛋白L7	RPL7型	29	第18124页	18	7	16	4	1	4	4.5
可能依赖ATP的RNA解旋酶DHX36	DHX36型	115	问题9H2U1	18	11	11	1	1	1	18
DNA结合蛋白A	CSDA公司	40	第16989页	18	8	24	5	2	10	3.6
聚腺苷酸结合蛋白4	PABPC4	71	问题13310	18	14	16	2	2	三	9
60S核糖体蛋白L13	RPL13型	24	第26373页	18	6	27	8	5	21	2.3
富含脯氨酸和谷氨酰胺的剪接因子	标准功率因数	76	第23246页	18	11	16	10	7	10	1.8
胰岛素样生长因子2信使核糖核酸结合蛋白3	IGF2BP3型	64	2004年4月25日	18	12	23	14	10	16	1.3
真核翻译起始因子4γ1	EIF4G1型	176	Q04637问题	17	10	7	0	0	0	*
核蛋白	NPM1型	33	P06748号	17	6	26	2	1	三	8.5
60S核糖体蛋白L4	RPL4级	48	第36578页	17	7	19	2	2	5	8.5
异质核核糖核蛋白H	HNRNPH1（HNRPH1）	49	第31943页	17	7	22	4	2	6	4.3
DNA拓扑异构酶1	排名前1	91	第11387页	16	10	13	0	0	0	*
La相关蛋白4	LARP4级	81	Q71RC2号机组	16	9	16	0	0	0	*
40S核糖体蛋白S25	RPS25型	14	第62851页	16	4	24	7	三	24	2.3
60S核糖体蛋白L18	RPL18型	22	Q07020问题	16	6	31	15	4	25	1.1
40S核糖体蛋白S11	RPS11型	18	第62280页	15	9	48	0	0	0	*
40S核糖体蛋白S14	RPS14型	16	第62263页	15	6	25	2	1	7	7.5
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶38	STK38型	54	2008年第1520号问题	15	6	13	12	7	14	1.3
60kDa热休克蛋白，线粒体	热休克蛋白1	61	第10809页	15	10	17	10	8	15	1.5
马特林-3	材料3	95	第43243页	14	9	10	0	0	0	*
可能的ATP依赖性RNA解旋酶YTHDC2	YTHDC2年	160	Q9H6S0型	14	6	5	0	0	0	*
非POU结构域八聚体结合蛋白	NONO（无）	54	问题15233	14	9	25	12	7	22	1.2
ELAV-样蛋白1	ELAVL1型	36	15717问题	13	5	15	4	2	7	3.3
远上游元素结合蛋白2	KHSRP公司	73	问题92945	13	9	16	2	2	三	6.5
管蛋白α-1B链	管A1B	50	第68363页	13	9	26	4	三	9	3.3
微管相关蛋白1B	地图1B	271	第46821页	13	12	6	10	10	5	1.3
德麦西丁	DCD公司	11	第81605页	12	2	20	0	0	0	*
异质性核糖核蛋白A/B	HNRNPAB公司	36	问题99729	12	5	13	0	0	0	*
胰岛素样生长因子2 mRNA-结合蛋白2	IGF2双极管2	66	Q9Y6M1	12	8	17	1	1	2	12
PPAR-gamma-like蛋白1的组成性辅活化子	FAM120A型	122	问题9NZB2	12	6	8	三	2	2	4
Ras GTPase激活蛋白结合蛋白1	G3BP1型	52	问题13283	12	5	13	2	2	6	6
七肽-1	首都1	78	问题14444	12	5	8	5	三	4	2.4
白细胞介素增强因子2	ILF2级	43	问题12905	12	7	21	4	三	9	3
热休克蛋白105 kDa	热休克蛋白1	97	问题92598	11	7	10	0	0	0	*
异质核核糖核蛋白U样蛋白2	HNRNPUL2公司	85	问题1KMD3	11	8	12	0	0	0	*
狼疮La蛋白	安全气囊系统	47	P05455号	11	5	11	0	0	0	*
可能的二甲基腺苷转移酶	DIMT1L（尺寸1升）	35	第9季度第2季度	11	7	27	0	0	0	*
异质核核糖核蛋白A3	HNRNPA3（HNRPA3）	40	第51991页	11	8	19	1	1	三	11
多嘧啶束结合蛋白1	PTBP1型	57	第26599页	11	4	6	1	1	2	11
60S核糖体蛋白L3	RPL3级	46	第39023页	11	7	21	三	2	6	3.7
40S核糖体蛋白S19	RPS19型	16	第39019页	11	4	18	7	三	13	1.6
60S核糖体蛋白L5	RPL5型	34	第46777页	10	7	25	0	0	0	*
RNA结合蛋白武藏同源物1	MSI1系列	39	O43347号机组	10	5	18	0	0	0	*
60S核糖体蛋白L10	RPL10型	25	第27635页	10	6	21	4	三	17	2.5
UPF0027蛋白质C22orf28	C22或28	55	Q9Y3I0型	10	7	14	6	5	10	1.7
14-3-3蛋白sigma	SFN公司	28	1947年3月	9	6	19	0	0	0	*
双标记RNA结合蛋白Staufen同源物1	STAU1号机组	63	O95793号	9	6	12	0	0	0	*
La相关蛋白4B	LARP4B型	81	A6NEL6型	9	5	7	0	0	0	*
40S核糖体蛋白S20	RPS20型	13	第60866页	9	6	29	1	1	9	9
60S核糖体蛋白L12	RPL12型	18	第3050页	9	6	43	2	1	6	4.5
60S核糖体蛋白L19	RPL19型	23	第84098页	9	4	10	三	1	5	3
依赖ATP的RNA解旋酶DDX3X	DDX3X系列	73	O00571号	9	7	12	2	1	2	4.5
剪接因子，富含精氨酸/丝氨酸7	SFRS7标准	27	问题16629	9	三	15	2	1	4	4.5
60S核糖体蛋白L24	RPL24型	18	第83731页	9	三	18	5	2	13	1.8
ADP/ATP转定位酶2	SLC25A5型	33	P05141号	9	7	20	2	2	8	4.5
依赖ATP的DNA解旋酶2亚单位2	XRCC5型	83	第3010页	8	5	7	0	0	0	*
组蛋白H1x	H1FX公司	22	Q92522问题	8	4	18	0	0	0	*
可能具有锌指结构域的解旋酶	HELZ公司	219	第42694页	8	6	4	0	0	0	*
推测ATP-依赖RNA解旋酶DHX57	DHX57型	156	问题6P158	8	5	4	0	0	0	*
60S核糖体蛋白L31	RPL31型	14	第62899页	8	2	15	三	1	7	2.7
60S核糖体蛋白L35	RPL35型	15	第42766页	8	2	19	4	1	8	2
热休克70 kDa蛋白4	热休克蛋白4	94	第14932页	8	6	9	1	1	2	8
60S核糖体蛋白L14	RPL14型	23	第50914页	8	6	24	2	2	11	4
伸长率2	EEF2级	95	第13639页	8	5	7	三	2	2	2.7
异质核核糖核蛋白G	RBMX公司	42	第38159页	8	5	14	三	2	6	2.7
核酸酶敏感元件结合蛋白1	YBX1型	36	第67809页	8	2	12	5	三	19	1.6
40S核糖体蛋白S7	转速7	22	第62081页	7	5	23	0	0	0	*
远上游元素结合蛋白3	FUBP3型	62	问题96I24	7	6	12	0	0	0	*
鸟嘌呤核苷酸结合蛋白样3	全球三级	62	Q9BVP2号机组	7	5	12	0	0	0	*
异质核核糖核蛋白R	HNRNPR（HNRPR）	71	O43390号	7	4	8	0	0	0	*
核糖体结合蛋白1	RRBP1号机组	152	问题9P2E9	7	5	4	0	0	0	*
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶SRPK1	SRPK1型	74	Q96SB4型	7	4	7	0	0	0	*
剪接因子，富含精氨酸/丝氨酸6	SFRS6系列	40	问题13247	7	2	5	0	0	0	*
转录中介因子1-beta	TRIM28阀内件	89	问题13263	7	5	7	0	0	0	*
Desmoplakin公司	数字信号处理器	332	第15924页	7	6	2	1	1	0	7
60S核糖体蛋白L23a	RPL23A型	18	第62750页	7	5	28	三	2	15	2.3
连接斑球蛋白	JUP公司	82	第14923页	7	7	9	三	三	5	2.3
异质核核糖核蛋白L	HNRNPL公司	64	第14866页	7	5	10	4	4	7	1.8
依赖ATP的RNA解旋酶DDX50	DDX50型	83	问题9BQ39	6	4	6	0	0	0	*
拜斯廷	BYSL公司	50	第48634页	6	6	18	0	0	0	*
核脆性X智力低下相关蛋白2	NUFIP2号机组	76	企7Z417	6	4	7	0	0	0	*
Plakophilin-1	PKP1系列	83	问题13835	6	4	6	0	0	0	*
纤溶酶原激活物抑制剂1 RNA-结合蛋白	SERBP1系列	45	Q8NC51问题	6	6	15	0	0	0	*
蛋白质LYRIC	平均温差	64	问题86UE4	6	5	11	0	0	0	*
Serrate RNA效应分子同源物	SRRT公司	101	问题9BXP5	6	4	5	0	0	0	*
U5小核核糖核蛋白200kDa解旋酶	SNRNP200（ASCC3L1）	245	O75643号	6	6	三	0	0	0	*
锌指RNA结合蛋白	ZFR公司	117	Q96KR1号机组	6	5	7	0	0	0	*
40S核糖体蛋白S5	RPS5型	23	第46782页	6	三	12	4	1	4	1.5
60S核糖体蛋白L10a	RPL10A型	25	第62906页	6	4	13	2	1	4	3
60S核糖体蛋白L23	RPL23型	15	第62829页	6	三	32	2	1	11	3
78kDa葡萄糖调节蛋白	热休克蛋白5	72	第11021页	6	5	11	1	1	2	6
异质核核糖核蛋白A0	HNRNPA0（HNRPA0）	31	问题13151	6	2	12	1	1	5	6
血清白蛋白	白蛋白	69	P02768号	6	2	4	5	1	三	1.2
Ras GTPase激活蛋白结合蛋白2	G3BP2型	54	Q9UN86型	6	4	12	2	2	5	3
甲基体亚基pICln	CLNS1A公司	26	第54105页	6	5	32	5	三	19	1.2
U2小核核糖核蛋白A'	SNRPA1标准	28	P09661	6	4	18	三	三	15	2
40S核糖体蛋白S23	转速23	16	第62266页	5	2	16	0	0	0	*
60S核糖体蛋白L17	RPL17型	21	第18621页	5	三	13	0	0	0	*
60S核糖体蛋白L28	RPL28型	16	第46779页	5	4	27	0	0	0	*
60S核糖体蛋白L9	RPL9型	22	第32969页	5	4	22	0	0	0	*
NF-kappa-B加压因子	挪威皇家空军	78	O15226号机组	5	三	4	0	0	0	*
核RNA输出因子1	西北一区	70	问题9UBU9	5	4	7	0	0	0	*
核蛋白56	NOP56（NOL5A）	66	O00567号	5	4	7	0	0	0	*
聚（rC）结合蛋白1	PCBP1型	37	第15365季度	5	三	11	0	0	0	*
推测的RNA-结合蛋白Luc7-like 2	LUC7L2	47	问题9Y383	5	2	6	0	0	0	*
RNA-结合蛋白Raly	RALY公司	32	问题9UKM9	5	4	17	0	0	0	*
rRNA 2'-O-甲基转移酶原纤维蛋白	FBL公司	34	第22087页	5	4	16	0	0	0	*
YTH结构域家族蛋白2	年初至今2	62	问题9Y5A9	5	三	6	0	0	0	*
真核翻译起始因子3亚基B	EIF3B（PRT1）	92	第55884页	5	三	4	1	1	1	5
真核起始因子4A-I	EIF4A1型	46	第60842页	5	4	12	三	2	6	1.7
异质核核糖核蛋白D样	HNRPDL公司	46	O14979号	5	2	6	2	2	6	2.5
环指蛋白219	RNF219号机组	81	Q5W0B1型	5	三	5	三	2	4	1.7
RNA结合蛋白FUS	保险丝	53	第35637页	5	三	8	三	2	5	1.7
28S核糖体蛋白S29，线粒体	DAP3型	46	第51398页	4	2	6	0	0	0	*
共济失调蛋白2样蛋白	ATXN2L公司	113	问题8WWM7	4	4	4	0	0	0	*
细胞分裂周期5样蛋白	CDC5L型	92	第99459季度	4	4	7	0	0	0	*
地莫考林-1	DSC1型	100	问题08554	4	2	三	0	0	0	*
DNA导向RNA聚合酶，线粒体	波尔米特	139	O00411号	4	三	4	0	0	0	*
双标记RNA特异性腺苷脱氨酶	ADAR公司	136	第55265页	4	三	4	0	0	0	*
富G序列因子1	GRSF1型	53	问题12849	4	2	6	0	0	0	*
富含脯氨酸的大蛋白BAT2	BAT2电池	229	第48634页	4	三	2	0	0	0	*
核帽结合蛋白亚单位1	NCBP1号机组	92	Q09161问题	4	三	4	0	0	0	*
核蛋白58	NOP58（NOL5）	60	Q9Y2X3型	4	4	11	0	0	0	*
前rRNA处理蛋白TSR1同源物	TSR1类	92	Q2NL82型	4	三	4	0	0	0	*
推测核糖体RNA甲基转移酶NOP2	NOP2（NOL1）	89	第46087页	4	4	7	0	0	0	*
TRM1样蛋白	TRM1L型	82	Q7Z2T5型	4	三	5	0	0	0	*
泛素羧基末端水解酶10	美国药典10	87	问题14694	4	2	三	0	0	0	*
60S核糖体蛋白L11	RPL11型	20	第62913页	4	2	12	1	1	8	4
60S核糖体蛋白L22	RPL22型	15	第35268页	4	2	19	2	1	10	2
60S核糖体蛋白L27a	RPL27A型	17	第46776页	4	2	16	三	1	7	1.3
真核翻译起始因子3亚基C	EIF3C（EIF3S8）	105	Q99613问题	4	4	5	1	1	2	4
mRNA前处理因子19	PRPF19型	55	Q9UMS4系列	4	三	6	2	1	2	2
可能依赖ATP的RNA解旋酶DDX6	DDX6型	54	第26196页	4	三	5	1	1	5	4
葡萄球菌核酸酶结构域蛋白1	序号1	102	Q7KZF4型	4	4	6	1	1	1	4
富含亮氨酸的重复蛋白59	LRRC59型	35	Q96AG4号机组	4	2	7	三	2	7	1.3
肌球蛋白9	MYH9年	227	第35579页	4	4	2	2	2	1	2
未表征蛋白质C11orf84	C11或84	41	Q9Y520型	4	三	12	三	2	5	1.3
真核起始因子4A-III	EIF4A3型	47	第38919页	4	4	10	三	三	8	1.3
蛋白质FAM98B	FAM98B（传真98B）	37	问题9NZB2	4	三	12	三	三	12	1.3
28S核糖体蛋白S27，线粒体	MRPS27型	48	问题92552	三	2	5	0	0	0	*
39S核糖体蛋白L12，线粒体	物料需求计划12	21	第52815页	三	三	12	0	0	0	*
39S核糖体蛋白L22，线粒体	MRPL22型	24	Q9NWU5号机组	三	2	14	0	0	0	*
39S核糖体蛋白L44，线粒体	MRPL44型	38	Q9H9J2型	三	2	9	0	0	0	*
40S核糖体蛋白S17	RPS17型	16	P08708号	三	三	32	0	0	0	*
5'-3'核糖核酸外酶1	XRN1型	194	q8英寸2	三	三	2	0	0	0	*
60S核糖体蛋白L18a	转速18a	21	企02543	三	2	10	0	0	0	*
天冬氨酰/天冬酰胺β-羟化酶	ASPH公司	86	问题12797	三	三	6	0	0	0	*
BAG家族分子伴侣调节因子2	BAG2型	24	O95816号	三	2	8	0	0	0	*
补体成分1 Q亚组分结合蛋白，线粒体	C1QBP公司	31	Q07021问题	三	三	12	0	0	0	*
CUG-BP和ETR-3样因子1	CUGBP1美元	52	Q92879问题	三	三	5	0	0	0	*
ELAV-样蛋白2	ELAVL2型	40	问题12926	三	2	5	0	0	0	*
真核翻译起始因子3亚基I	EIF3I（EIF3S2）	37	问题13347	三	2	6	0	0	0	*
真核翻译起始因子4γ3	EIF4G3型	177	O43432号机组	三	三	2	0	0	0	*
鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β-2-样亚基1	GNB2L1公司	35	第63244页	三	2	9	0	0	0	*
进口蛋白亚基α-2	KPNA2公司	58	第52292页	三	三	6	0	0	0	*
微管相关蛋白4	地图4	121	第27816页	三	2	2	0	0	0	*
Myb结合蛋白1A	马来西亚比索1A	149	问题9BQG0	三	2	1	0	0	0	*
Y14和mago的合作伙伴	WIBG公司	23	问题9BRP8	三	2	17	0	0	0	*
蛋白质FAM98A	FAM98A（传真98A）	55	问题8NCA5	三	2	6	0	0	0	*
蛋白质LSM12同源物	LSM12型	22	Q3MHD2型	三	2	14	0	0	0	*
蛋白PAT1同源物1	第1阶段	87	问题86TB9	三	2	三	0	0	0	*
复制因子C亚单位4	RFC4协议	40	第35249页	三	三	8	0	0	0	*
RNA-结合蛋白39	RBM39型	59	问题14498	三	三	6	0	0	0	*
RuvB-like 2型	RUVBL2语言	51	Q9Y230型	三	三	7	0	0	0	*
转录激活蛋白Purβ	聚氨酯	33	Q96QR8问题	三	2	6	0	0	0	*
过渡性内质网ATP酶	VCP公司	89	第55072页	三	2	三	0	0	0	*
U2-相关蛋白SR140	SR140型	118	O15042号机组	三	三	4	0	0	0	*
U4/U6小核核糖核蛋白Prp3	PRPF3型	78	O43395号	三	三	5	0	0	0	*
UPF0568蛋白质C14或f166	C14或166	28	问题9NYF8	三	三	16	0	0	0	*
锌指CCCH结构域蛋白11A	ZC3H11A型	89	O75152号	三	2	4	0	0	0	*
锌指蛋白346	ZNF346型	33	Q9UL40型	三	2	9	0	0	0	*
116kDa U5小核核糖核蛋白组分	EFTUD2型	109	15029问题	三	三	三	2	1	1	1.5
28S核糖体蛋白S22，线粒体	MRPS22型	41	P82650页	三	2	6	1	1	三	3
60S核糖体蛋白L15	RPL15型	24	第61313页	三	2	8	1	1	4	3
60S核糖体蛋白L32	转速32	16	B2R4Q3型	三	2	15	1	1	7	3
富含亮氨酸的重复蛋白15	LRRC15型	64	Q8TF66问题	三	三	6	1	1	1	3
富含GYF域蛋白2的PERQ氨基酸	GIGYF2公司	150	Q6Y7W6号	三	2	2	1	1	1	3
小核核糖核蛋白Sm D2	SNRPD2系列	14	P62316页	三	2	16	2	1	8	1.5
泛素相关蛋白2样	UBAP2L公司	115	问题14157	三	2	2	2	1	1	1.5
26S蛋白酶体非ATP酶调节亚单位2	PSMD2型	100	问题13200	三	三	4	2	2	三	1.5
40S核糖体蛋白S13	RPS13型	17	第62277页	三	2	13	2	2	13	1.5
磷酸甘油变位酶家族成员5	PGAM5系列	32	Q96HS1号机组	三	三	11	2	2	7	1.5
波形蛋白	VIM公司	54	P08670号	三	2	4	2	2	4	1.5
28S核糖体蛋白S34，线粒体	MRPS34型	26	第82930页	2	2	7	0	0	0	*
39S核糖体蛋白L48，线粒体	MRPL48型	24	问题96GC5	2	2	11	0	0	0	*
40S核糖体蛋白S24	零售价24	15	第62847页	2	2	9	0	0	0	*
5'-3'外核糖核酸酶2	X射线2	109	Q9H0D6型	2	2	三	0	0	0	*
60S核糖体蛋白L13a	RPL13A型	24	第40429页	2	2	8	0	0	0	*
60S核糖体蛋白L21	RPL21型	19	问题6IAX2	2	2	14	0	0	0	*
线粒体ATP合成酶亚单位α	ATP5A1型	60	第25705页	2	2	5	0	0	0	*
钙结合线粒体载体蛋白SCaMC-3	SLC25A23型	52	Q9BV35型	2	2	5	0	0	0	*
细胞分裂蛋白激酶4	川东北4	34	第11802页	2	2	6	0	0	0	*
裂解和多聚腺苷化特异性因子亚基1	CPSF1型	161	10570年第1季度	2	2	2	0	0	0	*
DnaJ同源亚家族B成员6	DNAJB6号机组	36	O75190美元	2	2	7	0	0	0	*
真核翻译起始因子2亚基3	EIF2S3型	51	第41091页	2	2	5	0	0	0	*
真核翻译起始因子3亚基A	EIF3A（EIF3S10）	167	问题14152	2	2	2	0	0	0	*
真核翻译起始因子3亚基H	EIF3H（EIF3S3）	40	O15372号	2	2	5	0	0	0	*
谷氨酰胺肽环转移酶样蛋白	QPCTL公司	43	Q9NXS2型	2	2	5	0	0	0	*
新生多肽相关复合物亚单位α	NACA公司	23	问题13765	2	2	13	0	0	0	*
成神经细胞分化相关蛋白AHNAK	阿纳克	629	Q09666问题	2	2	0	0	0	0	*
核蛋白14	氮氧化物14	98	P78316页	2	2	三	0	0	0	*
核蛋白16	氮氧化物16	21	Q9Y3C1型	2	2	14	0	0	0	*
周期色氨酸蛋白2同源物	密码2	102	第15269季度	2	2	三	0	0	0	*
无名指蛋白10	RNF10（参考号：10）	90	Q8N5U6号机组	2	2	三	0	0	0	*
含有S1 RNA结合结构域的蛋白1	SRBD1型	112	Q8N5C6型	2	2	2	0	0	0	*
超级杀手病毒酸活性2-like 2	SKIV2L2系列	118	第2285页	2	2	2	0	0	0	*
转录激活蛋白Pur-alpha	聚氨酯橡胶	35	Q00577问题	2	2	10	0	0	0	*
U4/U6.U5三snRNP相关蛋白1	SART1	90	O43290号	2	2	5	0	0	0	*
D-3-磷酸甘油脱氢酶	PHGDH公司	57	O43175号	2	2	5	1	1	三	2
伸长率1-gamma	EEF1G公司	50	Q53YD7期	2	2	5	1	1	三	2
蛋白argonaute-2	EIF2C2系统	97	Q9UKV8发动机	2	2	三	1	1	2	2
蛋白质KIAA1967	KIAA1967年	103	问题8N163	2	2	2	1	1	1	2
蛋白质SDA1同源物	星期四1	80	Q9NVU7号机组	2	2	三	1	1	1	2
磷酸三糖异构酶	TPI1型	27	第60174页	2	2	10	1	1	5	2

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对TDP-43相互作用物的分析揭示了与RNA相关的蛋白质的广泛相互作用，与之前描述的TDP-43在RNA代谢中的作用一致。这些包括hnRNP、RNA解旋酶、剪接因子、翻译调节蛋白以及参与mRNA运输和稳定性的蛋白质(图1B和表一). 发现TDP-43与少量DNA结合蛋白（如转录因子）相互作用，这与之前描述的TDP-43在转录抑制中的作用一致¹，但也与DNA修复蛋白如Ku70相互作用，这表明TDP-43可能在转录调控之外的DNA代谢中发挥作用(图1B和表一). 值得注意的是，虽然TDP-43主要是一种核蛋白，但我们发现它与细胞质和核蛋白以及许多已知的在细胞核和细胞质之间穿梭的蛋白质都有相互作用。这可能反映了TDP-43在细胞核和细胞质中的功能作用，与TDP-43本身经历核质穿梭的观察结果一致¹²。

TDP-43与两个不同的蛋白质相互作用网络相关

为了更好地理解TDP-43相互作用蛋白之间的关系，我们使用了STRING相互作用数据库²¹为了最大限度地减少假阳性的可能性，我们的分析仅包括光谱计数在TDP-43免疫沉淀物中比对照组富集至少两倍的蛋白质。此外，只接受STRING数据库确定的高置信度交互。该分析表明，TDP-43相互作用物主要聚集在两个不同的蛋白质相互作用网络中(图2). “核/剪接簇”完全由核蛋白组成，包括许多hnRNP，还包括富含丝氨酸/精氨酸（SR）蛋白、小核核糖核蛋白（snRNP）、依赖ATP的RNA解旋酶和核RNA出口因子。这些蛋白质都参与核RNA代谢，主要是RNA剪接，但也将mRNA输出到细胞质(表2). “细胞质/翻译簇”完全由细胞质蛋白质组成，包括翻译起始和延伸因子以及核糖体亚单位(表3). 有趣的是，PABPC1被发现连接这两个不同的蛋白质相互作用网络(图2).

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图2

TDP-43相互作用蛋白形成两个不同的蛋白质相互作用网络

使用STRING相互作用软件分析质谱鉴定的TDP-43蛋白，以使用数据库、文献和实验搜索参数鉴定高置信相互作用。仅使用STRING分析TDP-43免疫沉淀物中至少两倍富集的蛋白质。观察到两种不同的蛋白质相互作用，标记为核/剪接簇和细胞质/翻译簇。

表2

核hnRNP集群

核/剪接簇中发现的TDP-43相互作用蛋白。此处引用的参考文献可在补充参考文献。

姓名	符号	功能	补充参考#
依赖ATP的RNA解旋酶A	DHX9型	转录/翻译	1,2
异质核核糖核蛋白U	HNRNPU（HNRPU）	转录/mRNA稳定性	3,4
异质核核糖核蛋白C1/C2	HNRNPC（HNRPC）	剪接/mRNA稳定性	5,6
异构核核糖核蛋白A2/B1	HNRNPA2B1（HNRPA2B1）	拼接	7
异质核核糖核蛋白U样蛋白1	HNRNPUL1（HNRPUL1）	mRNA转运	8
异质核核糖核蛋白A1	HNRNPA1（HNRPA1）	剪接/mRNA稳定性	5,9
异质核核糖核蛋白M	HNRNPM（高转速）	拼接	5
聚（rC）结合蛋白2	PCBP2型	翻译	10
异质核核糖核蛋白H	HNRNPH1（HNRPH1）	拼接	5
异质核核糖核蛋白A3	HNRNPA3（HNRPA3）	mRNA转运	11
异质核核糖核蛋白G	RBMX公司	拼接	12
多嘧啶束结合蛋白1	PTBP1型	拼接	13
剪接因子，富含精氨酸/丝氨酸7	SFRS7标准	拼接	14
U5小核核糖核蛋白200kDa解旋酶	SNRNP200（ASCC3L1）	拼接	15
聚（rC）结合蛋白1	PCBP1型	转录/翻译/mRNA稳定性	16
剪接因子，富含精氨酸/丝氨酸6	SFRS6系列	拼接	17
核核糖核酸输出因子1	西北一区	信使核糖核酸转运	18
异质核核糖核蛋白R	HNRNPR（HNRPR）	剪接/mRNA稳定性	19
核帽结合蛋白亚单位1	NCBP1号机组	剪接/mRNA转运	20,21
异质核核糖核蛋白A0	HNRNPA0（HNRPA0）	未知	22
U2小核核糖核蛋白A'	SNRPA1标准	拼接	7

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表3

细胞质翻译簇

细胞质/翻译簇中发现的TDP-43相互作用蛋白。此处引用的参考文献可在补充参考文献。

姓名	符号	功能	参考
40S核糖体蛋白S11	RPS11型	40S核糖体亚基	24
40S核糖体蛋白S14	RPS14型	40S核糖体亚基	24
40S核糖体蛋白S16	RPS16型	40S核糖体亚基	24
40S核糖体蛋白S18	RPS18型	40S核糖体亚基	24
40S核糖体蛋白S2	RPS2型	40S核糖体亚基	24
40S核糖体蛋白S20	转速20	40S核糖体亚基	24
40S核糖体蛋白S23	转速23	40S核糖体亚基	24
40S核糖体蛋白S24	零售价24	40S核糖体亚基	24
40S核糖体蛋白S25	RPS25型	40S核糖体亚基	24
40S核糖体蛋白S3	转速3	40S核糖体亚基	24
40S核糖体蛋白S3a	RPS3A型	40S核糖体亚基	24
40S核糖体蛋白S4，X亚型	RPS4X系列	40S核糖体亚基	24
40S核糖体蛋白S6	RPS6系列	40S核糖体亚基	24
40S核糖体蛋白S7	RPS7型	40S核糖体亚基	24
40S核糖体蛋白S9	RPS9型	40S核糖体亚基	24
40S核糖体蛋白SA	RPSA公司	40S核糖体亚基	24
60S酸性核糖体蛋白P0	RPLP0型	60S核糖体亚基	24
60S核糖体蛋白L10a	RPL10A型	60S核糖体亚基	24
60S核糖体蛋白L11	RPL11型	60S核糖体亚基	24
60S核糖体蛋白L12	RPL12型	60S核糖体亚基	24
60S核糖体蛋白L13	转速13	60S核糖体亚基	24
60S核糖体蛋白L13a	转速13a	60S核糖体亚基	24
60S核糖体蛋白L14	RPL14型	60S核糖体亚基	24
60S核糖体蛋白L17	RPL17型	60S核糖体亚基	24
60S核糖体蛋白L18A	RPL18A型	60S核糖体亚基	24
60S核糖体蛋白L19	RPL19型	60S核糖体亚基	24
60S核糖体蛋白L21	RPL21型	60S核糖体亚基	24
60S核糖体蛋白L22	RPL22型	60S核糖体亚基	24
60S核糖体蛋白L23	RPL23型	60S核糖体亚基	24
60S核糖体蛋白L23a	RPL23A型	60S核糖体亚基	24
60S核糖体蛋白L26	RPL26型	60S核糖体亚基	24
60S核糖体蛋白L28	RPL28型	60S核糖体亚基	24
60S核糖体蛋白L3	RPL3级	60S核糖体亚基	24
60S核糖体蛋白L31	转速31	60S核糖体亚基	24
60S核糖体蛋白L32	转速32	60S核糖体亚基	24
60S核糖体蛋白L35	RPL35型	60S核糖体亚基	24
60S核糖体蛋白L4	RPL4级	60S核糖体亚基	24
60S核糖体蛋白L5	RPL5型	60S核糖体亚基	24
60S核糖体蛋白L6	RPL6型	60S核糖体亚基	24
60S核糖体蛋白L7	RPL7型	60S核糖体亚基	24
60S核糖体蛋白L7a	RPL7A型	60S核糖体亚基	24
60S核糖体蛋白L8	RPL8型	60S核糖体亚基	24
真核翻译起始因子4γ1	EIF4G1型	翻译起始因子	25
伸长率2	EEF2（EF2）	翻译延伸因子	26
真核翻译起始因子3亚基I	EIF3I（EIF3S2）	翻译起始因子	27
真核翻译起始因子3亚基A	EIF3A（EIF3S10）	翻译起始因子	27
真核翻译起始因子3亚基B	EIF3B（PRT1）	翻译起始因子	27
真核翻译起始因子3亚基C	EIF3C（EIF3S8）	翻译起始因子	27
真核翻译起始因子3亚基H	EIF3H（EIF3S3）	翻译起始因子	27

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疾病相关TDP-43突变对TDP-43相互作用没有显著影响

错义突变A315T和M337V是显性遗传ALS的病因⁵^,⁷为了研究疾病相关突变是否改变与TDP-43相互作用的蛋白质的补体，我们通过定点突变将每个突变引入TDP-43，并检查其相互作用情况。我们发现，携带A315T或M337V突变的TDP-43变异体具有相互作用特征，通过Sypro-Ruby-tain凝胶检测，这些特征与野生型TDP-43在质量上无法区分(图3A). 这一发现表明，TDP-43错义突变体致病的机制可能是由于293T细胞中没有发生的细胞类型特异性相互作用，或者致病突变不会严重改变TDP-43或其结合伙伴的功能。

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图3

TDP-43突变对相互作用的影响

(A类)疾病相关突变不会改变TDP-43相互作用组。如图所示，Sypro-Ruby-tained FLAG免疫沉淀物来自对照HEK-293T细胞、表达野生型FLAG-TDP-43、FLAG-TDP43（A315T）或FLAG-TDP43（M337V）的HEK-293G细胞。FLAG-TDP-43（M337V）可重复免疫沉淀的效率低于FLAG-TDP43或FLAG-TDP43（A315T），这与Sypro-Ruby观察到的相互作用蛋白强度的降低成正比。(B类)一些TDP-43相互作用依赖于RNA。图中显示了来自对照HEK-293T细胞、表达野生型FLAG-TDP-43、野生型FLAG-TDP-43（用RNase A处理）或FLAG-TDP43（mutRRM）的HEK-293细胞的Sypro-Ruby-tained FLAG免疫沉淀物，如图所示。免疫沉淀至少重复三次，结果一致。选择具有代表性的图像进行显示。

一些TDP-43相互作用是RNA依赖性的，而另一些是RNA依赖的

由于TDP-43及其许多相互作用蛋白是RNA结合蛋白，我们试图确定RNA结合如何影响TDP-43相互作用组。TDP-43的RNA结合由其第一个RRM结构域介导²²两种特殊的点突变W113A和R151A先前被证明可以消除TDP-43与RNA的结合²²我们将这两种突变导入FLAG-TDP-43，以产生RNA结合突变FLAG-TDP43（mutRRM）。与FLAG-TDP-43相比，一些TDP-43与FLAG-TDP-43（mutRRM）的相互作用丢失，这表明许多TDP-43相互作用的蛋白质/复合物受到RNA结合的强烈影响(图3B，车道4）。为了进一步研究RNA结合在确定TDP-43相互作用中的作用，我们在存在RNase A的情况下对TDP-43进行免疫沉淀以降解RNA。这种方法产生了与FLAG-TDP-43（mutRRM）几乎相同的相互作用曲线，进一步证明了RNA结合对TDP-33相互作用的强烈影响(图3B，车道3）。许多RNA-依赖性相互作用是分子量在~14至35kDa之间的蛋白质，这一队列主要由核糖体亚单位组成，这表明TDP-43与核糖体的关联是间接的，并通过与同一转录物的相互作用来介导。然而，其他蛋白质可能与TDP-43相互作用，而不依赖于其结合RNA的能力。此类蛋白质更可能存在于与TDP-33的多聚蛋白复合物中。

TDP-43相互作用蛋白的验证

我们通过免疫共沉淀和Western blot验证了TDP-43相互作用蛋白的子集。hnRNP H是我们蛋白质组分析中发现的大量与TDP-43相互作用的hnRNP之一。与TDP-43类似，该蛋白已被证明参与剪接调控²³免疫沉淀和Western blot证实TDP-43和hnRNP H之间存在相互作用(图4A). 这种相互作用在疾病相关点突变A315T或M337V中没有改变(图4A). TDP-43和hnRNP H之间的相互作用至少部分受到TDP-43与RNA结合的影响，因为用RNase A处理可以大大减轻相互作用(图4A). 与这一发现一致，hnRNP H与TDP-43（mutRRM）突变体的相互作用减少(图4A). 为了确定TDP-43和hnRNP H之间发生相互作用的亚细胞隔室，在HeLa细胞中进行免疫荧光以同时显示TDP-43与hnRNP H(图4B).

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图4

TDP-43与hnRNP H和PABPC1相互作用的表征

(A类)在HEK-293T细胞中，通过联合免疫沉淀和Western blot分析验证TDP-43与hnRNP H和PABPC1的相互作用。左侧面板：免疫沉淀前对全细胞裂解物进行Western blot分析，以可视化1%的蛋白质输入。右侧面板：FLAG免疫沉淀物的Western blot分析。使用图像J（显示在每个波段下方）进行量化，并将其归一化为车道2中的TDP-43数量。免疫沉淀至少重复三次，结果一致，并选择具有代表性的图像进行显示。(B类)用免疫荧光法观察TDP-43和hnRNP H在HeLa细胞中的定位。DAPI染色显示细胞核。TDP-43和hnRNP H在HeLa细胞的亚核灶中均表现出泛核表达，且共定位。所示的免疫荧光数据表示在多次重复中获得的一致结果。IB：免疫印迹，IP：免疫沉淀。

还对TDP-43和PABPC1之间的相互作用进行了验证。PABPC1是一种主要的细胞质蛋白，与poly（a）mRNA结合并稳定，调节RNA翻译²⁴^,²⁵免疫沉淀和Western blot证实PABPC1与TDP-43相关，并且这种关联不受A315T或M337V突变的影响(图4A). RNase A存在下的免疫沉淀表明，TDP-43和PABPC1之间的联系也依赖于RNA，因为RNA酶A处理可以显著减轻结合(图4A). 与这一发现一致，PABPC1显示与TDP-43（mutRRM）突变体的相互作用减少(图4A). 因此，核糖核酸酶A处理完全消除了hnRNP H和PABPC1与TDP-43的相互作用，但选择性地损害TDP-43结合RNA（TDP-43-（mutRRM））的能力只能部分缓解这种相互作用。RNase A处理可能会完全分解核糖核蛋白复合物，从而消除TDP-43和RNA结合蛋白之间的直接和间接相互作用。另一方面，TDP-43（mutRRM）显示的残余结合表明，与多聚核糖核蛋白复合物结合的能力有限，不依赖于其结合RNA的能力，尽管这种相互作用明显通过RNA结合来稳定。在HeLa细胞中也进行了共免疫沉淀实验，证实了PABPC1和hnRNP H与TDP-43及相关突变体之间的相互作用(补充图2A)并提供第二种细胞类型，其中观察到这些新的相互作用。此外，我们从小鼠脑匀浆中进行联合免疫沉淀，以证实TDP-43和PABPC1以及hnRNP U之间的相互作用与TDP-43相关疾病中经常受影响的一个组织中的内源性TDP-43蛋白发生(补充图2B).

TDP-43定位于细胞质中的RNA颗粒

尽管TDP-43主要是一种核蛋白，但在一些HeLa细胞中，除了弥漫性核染色外，TDP-43还可以在离散的细胞质斑点中观察到(图5A). 这些点状物没有hnRNP H染色（数据未显示），尽管它们对PABPC1染色强烈，PABPC1是细胞质RNA颗粒的标记²⁶(图5A). 我们的发现与先前的证据一致，表明TDP-43与细胞质RNA颗粒共同纯化²⁷细胞质RNA颗粒，包括应激颗粒、加工体和生殖细胞（或极性）颗粒，是细胞质结构，被认为代表信使核糖核酸和核糖核蛋白的生理积累，通过影响翻译、运输和稳定性来调节基因表达²⁸.PABPC1是应激颗粒的特异性标记²⁶，表明TDP-43存在于这种特定亚型的RNA颗粒中。TDP-43与应激颗粒相关的进一步广泛证据是TDP-43和应激颗粒的许多额外蛋白质组分相互作用的鉴定²⁸^,²⁹(表4).

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图5

细胞质TDP-43定位于应激颗粒

免疫荧光用于可视化外源性(A-C公司)FLAG-TDP-43或内源性(D类)TDP-43和(A类)PABPC1(B、 D类)G3BP1和(C类)HeLa细胞中的EIF4G。DAPI染色显示细胞核。TDP-43定位于HeLa细胞胞浆中的应激颗粒。(D类)用50μM MG-132处理3小时后，66%的细胞中观察到RNA颗粒。MG-132处理后，25%的细胞中至少观察到1个TDP-43阳性应激颗粒。计数300个HeLa细胞。所有显示的免疫荧光数据代表了多次重复获得的一致结果。

表4

TDP-43相关应激颗粒蛋白

应激颗粒蛋白与TDP-43共同免疫沉淀。

姓名	符号
蛋白argonaute-2	EIF2C2系统
七肽-1	首都1
真核翻译起始因子3（5亚基）	EIF3型
真核翻译起始因子4γ（2亚单位）	EIF4G公司
远上游元素结合蛋白2	KHSRP公司
Ras GTPase激活蛋白结合蛋白1	G3BP1型
ELAV样蛋白1	ELAVL1型
聚腺苷酸结合蛋白1	可编程只读存储器1
可能依赖ATP的RNA解旋酶DDX6	数字数字6
Plakophilin-1	PKP1系列
双标记RNA结合蛋白Staufen同源物1	STAU1号机组
泛素羧基末端水解酶10	美国药典10
真核起始因子4A（2个亚基）	EIF4A型
核酸酶敏感元件结合蛋白1	YBX1型
40S核糖体（20亚单位）	40秒

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为了证实TDP-43与应激颗粒的相关性，我们进行了免疫荧光检测，以检测另外两种已知与应激颗粒相关的应激颗粒蛋白（EIF4G和G3BP1）。FLAG-TDP-43被发现与这些蛋白在离散的细胞质点状物中高度共定位，清楚地表明细胞质TDP-43与应激颗粒相关(图5B-C). 此外，在蛋白酶体抑制剂MG-132（一种公认的应激颗粒形成刺激物）的作用下，发现内源性TDP-43定位于应激颗粒标记(图5D).

为了确定TDP-43定位到应激颗粒是否需要RNA结合，我们可视化了FLAG-TDP-43（mutRRM）和EIF4G的定位作为RNA颗粒的标记。FLAG-TDP-43（mutRRM）的定位仍以核为主，尽管在许多既有核定位又有细胞质定位的细胞中观察到微小的离散点，但这些细胞与应激颗粒并不共存(图6). FLAG-TDP-43（mutRRM）仅存在于6.5%的应激颗粒中，而FLAG-TDP43存在于84.7%的应激颗粒(图6). 这表明TDP-43与应激颗粒的联系因无法与RNA相互作用而受到严重损害。

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图6

TDP-43与应激颗粒的关联性因无法结合RNA而得到强烈缓解

(A类)TDP-43（mutRRM）在细胞质RNA颗粒中很少发现（如EIF4G所示）。(B类)在表达FLAG-TDP-43的细胞中，发现FLAG-TDP43与EIF4G在85%的应激颗粒（n=242个细胞）中共存，而FLAG-TDP43（mutRRM）仅在6.5%的应激颗粒中存在（n=168个细胞）。

讨论

使用全球蛋白质组学方法，我们已经证明TDP-43与调节mRNA代谢的蛋白质有广泛的相互作用。这些包括核蛋白、细胞质蛋白和已知的进行核质穿梭的蛋白质。TDP-43的相互作用物包括hnRNP、RNA解旋酶、剪接因子、翻译调节蛋白以及参与mRNA运输和稳定性的蛋白质。发现TDP-43与少量DNA结合蛋白（如转录因子）相互作用，这与之前描述的TDP-43在转录抑制中的作用一致¹也与DNA修复蛋白（如Ku70）相互作用，表明TDP-43可能参与DNA代谢的其他方面。

TDP-43的疾病相关突变几乎都位于C末端富含甘氨酸的结构域内，该结构域以前被发现与一些hnRNP相互作用⁵^-⁹^,¹¹令人惊讶的是，致病突变A315T和M337V并没有改变293T细胞中TDP-43相互作用的特征。使用蛋白质-蛋白质相互作用的STRING数据库进行的分析表明，TDP-43与两个不同的蛋白质相互作用网络相关。第一个是核蛋白网络，调节RNA剪接和核RNA代谢的其他方面，与先前的证据一致，即TDP-43可以影响转录和RNA剪接¹⁰第二个是调节mRNA翻译的细胞质蛋白质网络。尽管TDP-43主要是一种核蛋白，但之前已经表明它在细胞核和细胞质之间穿梭¹²此外，发现TDP-43在神经元损伤中重新分布到细胞质RNA颗粒¹³^,¹⁴这与我们的发现一致，即TDP-43与应力颗粒的组分具有广泛的相互作用，并且TDP-43与应力颗粒共定位。

TDP-43在与疾病相关的越来越多的RNA结合蛋白中是一个相对较新的参与者³⁰除TDP-43外，至少还有另外两种RNA结合蛋白的突变会导致运动神经元疾病。影响SMN基因的功能缺失突变导致脊髓性肌萎缩³¹而SR蛋白FUS/TLS的突变也会导致显性遗传性ALS³²^,³³此外，大量额外的神经退行性疾病也与RNA结合蛋白的突变有关，这表明RNA代谢缺陷可能是导致神经退行变性的常见机制³⁰我们的研究表明，TDP-43可能在转录、稳定、运输和翻译等多个水平上调节mRNA。神经退行性疾病中突变的其他RNA结合蛋白也具有类似的功能，包括SMN、FUS/TLS和FMRP。在这些疾病中，RNA代谢的任何一个特定方面是否受到干扰仍有待确定。

TDP-43在细胞核中对剪接的负调控起到了很好的作用，特别是通过与CFTR mRNA的直接相互作用促进外显子跳跃³⁴在细胞质中，TDP-43已被证明通过与mRNA直接相互作用来稳定神经丝轻链的mRNA¹⁷最近，研究表明TDP-43与14-3-3蛋白亚基（也在我们的筛选中确定）相互作用，以调节NFL mRNA的稳定性³⁵另一个有趣的可能性是，特定mRNA的定点翻译需要TDP-43。先前的工作表明TDP-43在海马神经元树突中的RNA颗粒中定位并抑制翻译在体外³⁶运动神经元中mRNA位点特异性翻译调控的改变可能被证明是导致TDP-43蛋白病发生的重要机制。因此，未来的研究将需要确定神经元中与TDP-43相关的特定mRNA。

ALS、FTLD-TDP和IBMPFD中TDP-43的病理学特征是TDP-43从细胞核中清除并积聚在受影响细胞的细胞质中²因此，由TDP-43介导的疾病可能涉及TDP-43核功能的丧失或细胞质功能的毒性增加。考虑到与TDP-43突变相关的ALS的显性遗传模式⁵^-⁷以及从我们的果蝇属我们假设TDP-43相关疾病的模型（Ritson等人提交）更有可能出现细胞质功能的毒性增益。

结论

TDP-43与两个不同的蛋白质相互作用网络相关，一个涉及RNA代谢核，另一个涉及细胞质中的mRNA代谢。其中许多相互作用依赖于TDP-43结合RNA的能力。TDP-43相互作用不会被导致ALS的两个突变所改变。TDP-43与翻译机制的关联，以及TDP-43和应激颗粒关联的组织学证据，强烈表明TDP-43在翻译调节中发挥作用。

补充材料

单击此处查看。^{（616K，pdf）}

致谢

作者感谢泰勒实验室的成员，特别是娜塔莉亚·内德尔斯基，他们进行了有益的讨论并提出了建议。这项工作得到了NIH拨款AG031587和约翰·霍普金斯大学帕卡德ALS研究基金会对JPT的拨款支持。

工具书类

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