CXC趋化因子受体4拮抗剂AMD3100对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化的抑制作用

流式细胞仪分析

肺中的纤维细胞用Col I、CD45、CXCR-4进行三重染色，并用流式细胞术进行分析。博莱霉素给药后3天，小鼠肺中的纤维细胞最多。AMD3100治疗显著阻止博莱霉素给药后3天纤维细胞向肺部的积聚(图3A和3B). 尽管BAL流体中有SDF-1(图1A)和SDF-1 mRNA(图5)博莱霉素损伤后第0天开始增加，肺纤维细胞仅在损伤后第3天增加。

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图3

博莱霉素损伤后肺内CD45+CXCR4+Col I+纤维细胞募集。博莱霉素损伤后第3天，CD45+CXCR4+Col I+纤维细胞显著增加。AMD3100治疗显著降低博莱霉素损伤后第3天的纤维细胞募集（A，B）。取博莱霉素损伤组、博莱霉素联合AMD3100组和对照组的肺单细胞悬液进行CD45、Col I和CXCR4三重染色，然后进行FACS分析。n个=5个样本组^-1(^*:P（P）< 0.05;^**:P（P）< 0.01).

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图5

SDF-1 mRNA在小鼠肺中的表达。博莱霉素损伤后0、3和7天，SDF-1 mRNA在肺中的表达比对照组小鼠增加。AMD3100治疗降低了博莱霉素损伤后0天和3天肺内SDF-1 mRNA的表达。使用实时RT-PCR和β-actin作为看家基因分析各组的mRNA水平。非参数Kruskal-Wallis H检验。n个=每组3个肺(^*:P（P）< 0.05).

AMD3100对博莱霉素治疗小鼠肺胶原含量和肺纤维化的影响

从博莱霉素给药后7天到21天，肺中的胶原蛋白含量增加。AMD3100治疗在给予博莱霉素后第21天显著降低了肺中的总胶原蛋白含量，第7天没有变化(图4A). 阿什克罗夫特法测定的肺纤维化评分表明，AMD3100治疗可显著降低博莱霉素损伤模型的肺纤维化程度(图4B). 组织学检查也显示AMD3100明显改善了博莱霉素诱导的肺部炎症和纤维化(图4C).

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图4

胶原蛋白含量和典型组织病理学。博莱霉素损伤后第3天到第21天，肺胶原蛋白含量增加。博莱霉素损伤（A）后第21天，AMD3100治疗可降低胶原蛋白含量。总胶原蛋白含量通过Sircol分析测定。博莱霉素损伤后第21天出现严重的肺部炎症和纤维化，AMD3100治疗显著减轻了这种组织学改变（B）。采用Ashcroft法对肺纤维化进行评分。苏木精-伊红染色的肺组织的典型显微照片（C）。原始放大倍数X 200。n个=4肺组^-1(^*:P（P）< 0.05;^**:P（P）< 0.01).

SDF-1 mRNA在肺中的表达

据描述，博莱霉素治疗小鼠的血清和BAL液中SDF-1浓度升高(Xu等人，2007年). 如所示图5博莱霉素损伤后第0天、第3天和第7天，肺中SDF-1 mRNA的表达增加，AMD3100治疗后第3天SDF-1的mRNA表达显著降低。

肺部CXCR-4水平

博来霉素给药后第3天至第21天，肺中CXCR-4蛋白表达增加，AMD3100治疗后第7天和第21天，CXCR-4蛋白表达减少(图6). 相对于BAL SDF-1浓度的时间进程，肺部CXCR4表达增加的时间进程延迟(图2). 这一发现表明，AMD3100治疗抑制了博莱霉素损伤后SDF-1增加诱导的CXCR-4阳性细胞的积聚。

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图6

免疫印迹显示肺中CXCR4蛋白在博莱霉素损伤后3天到21天增加。AMD3100治疗在博莱霉素损伤后7天和21天降低了CXCR4蛋白。C： 对照组，B：博莱霉素，BA：博莱霉素加AMD3100。非参数Kruskal-Wallis H检验。n个=3肺组^-1(^*:P（P）< 0.05).

骨髓干细胞的趋化性

为了阐明SDF-1/CXCR-4轴在博莱霉素治疗小鼠骨髓间充质干细胞（BMDMSC）或造血干细胞（BMDHSC）归巢到肺中的作用，我们使用培养的小鼠BMDMSC进行了趋化性分析(图7A)或BMDHSC(图7B)用博莱霉素治疗后第3天从小鼠身上获得的不同肺提取物。在迁移实验中，SDF-1（50 ng/ml）显著诱导MSC和HSC的趋化性迁移，与博莱霉素处理的肺裂解物的趋化迁移量相同。AMD3100治疗显著阻断SDF-1或博莱霉素处理的肺裂解物诱导的MSC和HSC迁移。此外，博莱霉素损伤后AMD3100治疗的肺的裂解物减少了博莱霉素受损肺裂解物诱导的MSC和HSC的迁移。这些结果再次表明，博莱霉素治疗的小鼠通过CXCR4受体将BMDMSC或HSC征募到肺部，在受损的肺部产生SDF-1，AMD3100治疗有效地阻断了MSC和HSC的迁移在体外通过阻断CXCR4受体进行实验。

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图7

MSC和HSC在HTS Transwell®-96渗透支撑系统过滤器中的趋化作用。从小鼠股骨收集MSC和HSC，并允许其向Transwell系统中的几种刺激物迁移至下腔。显微镜下对迁移到下腔的细胞进行计数。SDF-1（50 ng/ml）和博莱霉素损伤的肺裂解物显著增加MSCs（A）和HSC（B）的迁移。将AMD3100（100µg/ml）添加到博莱霉素损伤的肺裂解物或SDF-1处理的样品中抑制干细胞迁移。与博来霉素损伤的肺裂解物相比，AMD3100治疗组博莱霉素损伤的小鼠肺裂解物也显示出抑制干细胞迁移的作用。非参数Kruskal-Wallis H检验。结果是至少三个独立实验的平均值(^*:P（P）< 0.05;^**:P（P）< 0.01).

动物的治疗

通过腹腔注射盐酸氯胺酮（100 mg/kg）和盐酸二甲苯嗪（10 mg/kg）对小鼠进行麻醉，然后通过颈部切口暴露气管。在第0天用24号针头将50µl PBS或PBS载体中的博莱霉素（西格玛，密苏里州圣路易斯；小鼠中为2 U/kg）注入气管腔。从第-1天到第20天，静脉注射AMD3100（Sigma-Aldrich；200µg存于250µl PBS中）21天，然后在第0、3、7和21天处死(补充数据图S1). 动物实验程序按照韩国天主教大学动物学科委员会的指南进行。

BAL公司

切开皮肤暴露气管，并用24号静脉导管插管。用500µl等分磷酸盐缓冲盐水（PBS）进行冲洗，并重复2次。收集的液体在400×克收集上清液并在-70℃下保存5分钟，直到进行细胞因子分析。将BAL细胞颗粒重新悬浮在500µl PBS中，并使用血细胞仪计算细胞数量。使用细胞胞浆2（Shandon，Pittsburgh，PA）将细胞分散在玻片上，并用Wright-Giemsa染色。对300个细胞进行差异计数，以确定每个细胞组分的数量。

ELISA用于评估BAL液中SDF-1、TGF-β1和KC水平

根据制造商的方案，使用ELISA试剂盒（明尼苏达州明尼阿波利斯DuoSet®ELISA开发系统研发系统）定量BAL液中SDF-1、TGF-β1和KC的水平。在分析之前，所有样品在8000 rpm下离心15分钟，每个水平测量两次。通过微孔板阅读器（加利福尼亚州桑尼维尔市分子器件公司）测量450 nm波长的吸光度。

荧光激活细胞分选分析（FACS）

从小鼠的整个肺中分离出肺细胞。对整个肺组织进行机械浸渍，在37℃下用0.2%（w/v）的RPMI 1640中的IV型胶原酶和10%的FBS持续搅拌2h。在PBS中清洗总细胞后，用蒸馏水溶解细胞悬浮液中的红细胞，然后用血细胞仪对残余细胞进行计数。10个以上⁶细胞用4%多聚甲醛固定在冰上15min，并用100%甲醇渗透。细胞在PBS中清洗，用PBA（PBS，5%FBS，0.01%NaN）封闭_三)然后与PerCP结合的抗鼠CD45（BD Pharmigen，San Jose，CA）、PE结合的抗小鼠CXCR4（BD Pharmigen）和兔抗胶原蛋白I（Abcam，Cambridge，UK）在4℃孵育过夜。为了观察I型胶原，使用了FITC-结合兔抗体（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）。细胞在FACS上进行分析（30000个细胞计数，BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，CA），数据通过使用CellQuest™3.3软件（BD Biosciences）进行分析。

形态学分析

左肺在4℃下用4%多聚甲醛固定48小时。固定肺用石蜡包埋，4µm厚切片，并用苏木精-伊红染色。为了定量分析博莱霉素引起的纤维化变化，使用阿什克罗夫特评分。在放大×100倍的条件下观察每个肺切片内的5个视野，并使用显微镜视野得分的平均值，按照0（正常）到8（总纤维化）的等级对纤维化程度进行分级。纤维化被定义为阿什克罗夫特分级为7或8级的区域(Ashcroft等人，1988年).

Sircol胶原蛋白测定

根据制造商的方案，使用Sircol分析试剂盒（北爱尔兰卡里克弗格斯的Biocolor有限公司）测量肺组织右中叶的总可溶性胶原蛋白。将1 ml Sircol染料试剂添加到100µl试样中，并在室温下混合30分钟。胶原-染料复合物通过在10000×克持续10分钟；然后用500µl乙醇清洗两次。将颗粒溶解在500µl碱性试剂中。用微孔板阅读器在540 nm处测量吸光度。校准曲线是根据制造商提供的胶原蛋白标准建立的。

实时RT-PCR用于SDF-1基因表达分析

使用TRI试剂（异硫氰酸胍-苯酚混合物）和SuperScript III（200 U/µl，Invitrogen，Carlsbad，CA）分离每个样本（右下叶）的总RNA并将其反向转录成cDNA。使用以下特定引物对，使用SYBR Green Real-Time Premix（RBC Bioscience，Chung Ho City，台湾）在iQ5 cycler（加州Hercules Bio-Rad）中扩增50 ng cDNA。SDF-1:5'-GAAGGAGGAGGGTGGCAG-3’（正向）/5'-TCCCGTCTTTCTCGAGT-3’（反向），GAPDH:5'-TGCAAGCTGCTTAAGGCT-3'（正向）/5'-AGTCCAAGCAGGTCTTGCTG-3'（反向）。循环条件为60℃下45个循环，扩增的DNA水平归一化为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）。

CXCR4和MAPK蛋白的Western blot

用含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液（20 mM Tris-HCl（pH 7.4）、137 mM NaCl、1%NP-40、0.25%脱氧胆酸钠、0.1%SDS、1 mM EDTA、10 mg/ml抑肽酶、1 mM-PMSF、0.1 mM钒酸钠和10 mM氟化钠）使右上叶匀浆，通过离心分离上清液。为了阐明干细胞中通过CXCR4的信号通路，从小鼠股骨分离出造血干细胞和间充质干细胞，然后在博莱霉素或博莱霉素加AMD3100治疗3天后，用SDF-1（50 ng/ml，R&D系统）、AMD310（100µg/ml，Sigma）或小鼠的肺裂解物孵育这两种细胞。用chaps细胞提取液缓冲液（0.1%的chaps，50 mM管-HCl（pH 6.5），2 mM EDTA，20µg/ml亮氨酸蛋白酶，10µg/ml胃蛋白酶抑制素A，10μg/ml抑肽酶，5 mM DTT）溶解每个样品。根据制造商的说明，通过Bradford（加利福尼亚州Hercules Bio-Rad）分析定量肺和细胞裂解物中的总蛋白浓度。将50µg蛋白质样品加载到10%的PAGE凝胶上，并在10 mA下通过电泳分离。在70 V下将蛋白质转移到硝化纤维素膜上2 h。在Tris缓冲溶液（TBS；10 mM Tris-HCl（pH 7.5）、，含5%脱脂奶粉的150 mM NaCl），在4℃的封闭溶液中与CXCR4抗体（1:200；Santa Cruz Biotechnology）或磷酸化p38 MAPK抗体（1:1000，Cell Signaling，danvers，MA）孵育过夜。用洗涤缓冲液（含0.1%NP-40的TBS）洗涤膜3次，并在室温下与辣根过氧化物酶结合二级抗体（1:2000）孵育2 h。用ECL检测目标蛋白⁺套件（GE Healthcare UK Ltd，英国白金汉郡Little Chalfont）和x射线胶片。

迁移分析

从小鼠骨髓中获得造血干细胞和间充质干细胞。通过DMEM/F-12培养基冲洗双侧股骨末端分离骨髓细胞。10之后⁶细胞置于100 mm培养皿中，用含有20%FBS、200 IU/ml青霉素和250µg/ml链霉素的DMEM/F-12培养基培养48 h。用蒸馏水去除红细胞后，从非粘附细胞中纯化HSC，收集粘附细胞作为MSCs。通过CD44染色鉴定纯化的BMDMSC(Tian等人，2008年)CD45染色鉴定BMDHSC。第四至第六代用于个体化趋化实验。抑制组的细胞在SDF-1或肺裂解物处理前30分钟用AMD3100（100µg/ml）孵育。HSC或MSC（5×10⁴将每个细胞）加载到8-µm孔transwell插入物（HTS-transwell®-96渗透支撑系统，Corning Incorporated，Corning，NY）的上腔中进行迁移分析。在用博莱霉素或博莱霉素加AMD3100治疗3天后，将小鼠的PBS、SDF-1（50 ng/ml）或肺裂解物（425µg/ml）添加到下室。孵育24小时后，收集下腔细胞并用血细胞仪计数。

本研究部分由韩国天主教大学医学院资助。