眼睛缺乏磷酸酶反式激活蛋白促进肿瘤细胞的增殖、转化、迁移和侵袭

摘要

介绍

视网膜决定途径是一种进化上保守的发育级联，已知涉及多种环境（眼睛、肾脏、肌肉、耳朵）和从苍蝇到人类的物种（在(Hanson，2001年)). 脊椎动物（和果蝇属)包括圣像牌(无眼（ey）和无眼双胞胎（玩具）)，眼睛不见了埃亚(艾娅),六(眼正弦(所以)和光学)、和腊肠犬(数模转换器)基因。有证据表明，这种网络在成人癌症中异常表达，以一种看似协调的方式埃亚和六基因上调达奇基因表达下调。有报道称Six1型在乳腺癌中(科莱塔等., 2004;福特等., 1998;福特等., 2000;赖兴贝格尔等., 2005)，威尔姆斯瘤(锂等., 2002)横纹肌肉瘤(于等., 2006;于等., 2004),Six3合金人骨外粘液样肉瘤(久冈等., 2004;拉弗拉姆等., 2003)、和六个5卵巢交界性肿瘤(温彻斯特等., 2000).Eya2号机组据报道，乳腺癌和卵巢癌的水平较高(张等., 2005)，以及在结缔组织样肿瘤中(巴卡牌手表等., 2006)，而埃亚1在Wilms肿瘤中过度表达(锂等., 2002). 另一方面第1天预后不良的乳腺癌中表达缺失(吴等., 2008;吴等., 2006;吴等., 2007).Six1型和Eya4号机组在恶性周围神经鞘肿瘤中也上调，而第1天被下调(米勒等., 2010). 视网膜决定基因的这种协调失调与其他涉及正常发育的遗传程序在致癌过程中的协同作用的例子一致。

由圣像牌,六和达奇基因是转录因子，而眼睛不见了(EYA公司)编码双功能反式激活物磷酸酶蛋白的基因(池田等., 2002;Jemc和Rebay，2007年;锂等., 2003;奥卡比等., 2009;拉亚普雷迪等., 2003;图特尔等., 2003). EYA蛋白的生化活性位于可分离的结构域中：N末端反式激活和苏氨酸磷酸酶结构域以及C末端酪氨酸磷酸酶（ED）结构域。EYA与同源域DNA-结合的SIX蛋白一起调节几个基因的表达，包括c-Myc公司,Gdnf公司，肌肉决定基因，如Myod公司,第4页和肌生成素.果蝇EYA-SO复合体的转录靶点包括菱形物,眼正弦自身，无眼的,刺猬、和无调性的(泡利等., 2005;张等., 2006). 中的实验果蝇属已经证明艾娅有助于苍蝇眼的发育(拉亚普雷迪等., 2003;图特尔等., 2003). 虽然最近的报告将EYA的核酪氨酸磷酸酶活性与DNA损伤修复联系起来(厨师等., 2009;克里希南等., 2009)，EYA酪氨酸磷酸酶活性也与细胞质细胞功能有关(熊等., 2009). 我们有兴趣了解EYA蛋白的生化活性如何影响恶性肿瘤细胞的细胞特性。

在本报告中，我们表明埃亚1,Eya2号机组，或Eya3号机组结果乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和转化增加。有趣的是，只有迁移、侵袭和转化的细胞功能依赖于磷酸酶活性。Eya3在促进入侵方面的作用也得到了以下因素的支持体内转移研究表明沉默眼睛3MDA-MB-231细胞的表达可减少转移。综上所述，我们的数据表明，EYA蛋白在乳腺上皮细胞中的过度表达可以促进肿瘤的发生，并且它们的磷酸酶活性可以特别促进侵袭性的增加。

材料和方法

结果

EYA促进的细胞增殖不需要磷酸酶活性

为了检测Eyes Absent在细胞中过度表达的影响，我们建立了稳定的MCF7细胞系，过度表达Eya1、Eya2或Eya3作为GFP融合物，以及一个单独表达载体控制GFP的细胞系。在本研究中，我们选择Eya3和Eya2进行更广泛的分析，因为Eya3在机械上是哺乳动物眼睛缺失蛋白的最佳特征(Rayapureddi和Hegde，2006年;拉亚普雷迪等., 2005;拉亚普雷迪等., 2003)据报道，Eya2在卵巢癌和乳腺癌中升高(张等., 2005). 为了检测Eya3剂量对细胞功能的影响，我们还建立了两个表达不同水平Eya3-GFP的独立克隆。WST分析中检测到过度表达导致细胞增殖显著增加(图1A). 通过过表达磷酸酶缺陷型Eya1、Eya2或Eya3来测试促增殖作用对Eya蛋白酪氨酸磷酸酶活性的依赖性(图1A、B)和测量扩散。在每种情况下，亲核天冬氨酸被保守地替换为天冬酰胺；这种替代已被证明能显著降低Eyas的磷酸酶活性(拉亚普雷迪等., 2003). 稳定过表达突变形式（Eya3（D246N）、Eya2（D209N）或Eya1（D299N））的MCF7细胞的增殖与野生型蛋白的过表达相比，在增殖水平上表现出无统计学意义的差异(图1A、B)表明酪氨酸磷酸酶活性对细胞增殖没有贡献。

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图1

Eya1、Eya2或Eya3的过度表达导致细胞增殖增加。

A） 使用WST试验测量细胞增殖，MCF7细胞稳定表达x轴上列出的结构。载体对照是GFP，并且所有的过表达构建体都作为GFP融合体制成。Eya3#1和Eya3#2表示通过qRT-PCR和荧光强度（来自GFP标签）测量的Eya3表达水平增加的单独克隆（参见补充图1). 磷酸酯酶死亡突变体Eya3（D246N）用灰色条表示，Eya3的（D246N-）-GFP mRNA水平与Eya3#2相当。条形图表示实验开始48小时后活细胞数量增加了一倍（六个实验的平均值±SD；***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05）。

B） 过度表达载体控制GFP、Eya1-GFP或Eya2-GFP的MCF7细胞的细胞增殖测定如（A）所示。表达磷酸酶缺陷突变体Eya1（D299N）-GFP或Eya2（D209N）-GPP的MCF7细胞增殖由灰色条表示。

EYA磷酸酶活性促进细胞迁移、侵袭和转化

使用transwell分析和上述MCF7细胞系测量细胞迁移。MCF7细胞过度表达Eya3(图2A)、Eya1或Eya2(图2B)与表达载体控制的MCF7细胞相比，每个细胞都表现出明显更高的细胞迁移率。在MDA-MB-231细胞中过度表达Eya3时也观察到类似的效果(图2A). 当酪氨酸磷酸酶死亡形式的Eyas（Eya3（D246N）、Eya2（D209N）和Eya1（D299N））过度表达时，这种对细胞运动性的影响持续减弱(图2A、B). 另一个酪氨酸磷酸酶死亡突变株Eya3（D248N）也获得了类似的结果，其中Asp248在催化反应中充当普通酸(拉亚普雷迪等., 2003)被Asn取代，并在COS7细胞中使用不同标记的Eya3(补充图2). 这些观察结果表明，Eyas的酪氨酸磷酸酶活性对细胞运动有积极影响。仅Eya3的C末端酪氨酸磷酸酶结构域（Eya3（ED））过表达也会增加细胞运动，而非非活性突变体Eya3(图2A). 然而，在表达靶向细胞核的Eya3的MCF7细胞中，通过在蛋白的C末端添加SV40大T抗原（PKKKKV）的核定位信号（NLS），未检测到运动性高于亲本MCF7的增加(图2A). 这些数据共同支持Eya C末端ED结构域中酪氨酸磷酸酶活性在细胞迁移中的作用。

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图2

Eya的酪氨酸磷酸酶活性促进细胞迁移和侵袭。

A） 通过对过度表达GFP、Eya3#2或磷酸酯酶缺乏的Eya3（D246N）（灰色条）的MCF7或MDA-MB-231细胞进行跨阱分析来测量细胞迁移。显示了迁移至跨阱嵌件底部的细胞数量。

B） 过度表达载体控制GFP、Eya1-GFP、Eya1（D299N）-GFP、Eya2-GFP或Eya2（D209N）-GPP的MCF7细胞的细胞迁移如2A所示。

C） Matrigel侵入试验如上文A和B所述进行，但转运孔涂有基底膜Matrigel（1:20稀释），并在试验开始48小时后测量移向插入物底部的细胞。

D） 对稳定转染有干扰控制RNA或siRNA的MDA-MB-231细胞进行细胞迁移和侵袭检测眼睛3.拯救表达任一小鼠的细胞系Eya3号机组或鼠标Eya3（D246N）除了眼睛3还分析了siRNA或干扰控制RNA。减少眼睛3mRNA显示在插图中。

所有数据代表三个实验的平均值±SD，***p<0.001，***p<0.01，*p<0.05，NS不显著。

当MCF7和MDA-MB-231细胞表达Eya3号机组或Eya2号机组上述是使用涂有matrigel的transwells进行测量的(图2C). 在每种情况下，当Eya3（D246N）过度表达时，Eya3的侵袭性明显增加，而当Eya（D246N）过度表达后，侵袭性显著降低，支持了Eya磷酸酶活性在促进细胞侵袭中的积极作用。什么时候？眼睛3使用siRNA沉默MDA-MB-231细胞中的mRNA，相对于表达干扰控制的相同细胞，迁移和侵袭都减少(图2D). 细胞的运动性在Eya3号机组，但不是Eya3（D246N），在含有siEYA3的细胞中。

使用焦点形成测定法测量Eyas转化细胞的能力(图3A、B). Eya1、2或3的过度表达导致病灶数量测量的转化显著增加。在所有情况下，效果取决于酪氨酸磷酸酶的活性，这是通过在表达磷酸酯酶死亡蛋白突变形式的细胞中观察到较少的病灶来判断的。作为这些实验的阳性对照，我们使用稳定表达组成活性Ras（Q61L）的MCF7细胞。值得注意的是，与MCF7-Ras（Q61L）相比，Eya过度表达不仅增加了病灶数量，而且加速了病灶形成速度(图3C)支持Eyas作为细胞转化的有效介质的作用。

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图3

Eya1、Eya2和Eya3促进MCF7细胞的转化。

A） 对稳定表达所示结构的细胞进行病灶形成评估。显示了电镀后13天的钢板照片。表达MCF7细胞的活化Ras（Q61L）作为阳性对照。对病灶/视野的数量进行了量化，结果如（B）所示。每根棒是三个实验的平均值±SD，***p<0.001，**p<0.01。

C） 第6天测得的病灶数，每根棒材为三次实验的平均值±SD。

Eya3引起肌动蛋白细胞骨架的变化

在进一步研究EYA磷酸酶活性的细胞作用时，我们重点关注Eya3和Eya2。我们首先研究了EYA如何影响肌动蛋白细胞骨架，发现过表达Eya3、Eya2、Eya1（D209N）或Eya3（D246N）的MCF7细胞在形态学上与亲本MCF7或表达载体对照的MCF6细胞不同(图4A). Eya3和Eya2过度表达的细胞更圆，而卵磷脂染色表明它们的应激纤维更少。出现皮质肌动蛋白和许多丝状伪足和跛足。相比之下，Eya3（D246N）或Eya2（D209N）过度表达的细胞相对平坦且扩散，并且具有更显著的应力纤维。

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图4

眼睛缺失影响肌动蛋白细胞骨架和活性Rho家族GTPases的水平。

A） Eya3或Eya2过表达诱导丝状伪足和跛足的形成，而突变体Eya3（D246N）和Eya2（D209N）导致细胞扁平化和应力纤维的形成。将稳定表达GFP、Eya3-GFP、Eya2-GFP、Eya2（D209N）-GFP或Eya3（D246N）-GFP的MCF7细胞接种在层粘连蛋白包被的载玻片上。固定细胞，染色F-actin（红色）和DAPI（蓝色），1小时后拍照。下面板显示了徕卡TCS-SP5共焦显微镜上拍摄的图像。

B） 表达载体对照、Eya3-GFP、Eya3（D246N）-GFP、Eya2-GFP或Eya2（D209N）-GPP的MCF7细胞被血清饥饿，然后用10%的血清刺激15分钟。对全细胞裂解物进行GST-RBD或GST-PAK下拉并免疫印迹RhoA、Rac1或Cdc42。RhoA、Rac1和Cdc42的GTP结合形式被归一化为负载控制，平均相对激活度显示在条形图中（三个实验的平均值）。

由于肌动蛋白细胞骨架的调节与GTPases Rho家族的激活状态密切相关，因此我们比较了过表达Eya2或Eya2（D209N）的MCF7细胞中活性Rho、Rac和Cdc42的水平，与表达载体对照的细胞相比。GST-Rhotekin（用于RhoA）或GST-PAK（用于Rac和Cdc42）用于选择性下拉GTP-结合形式。数据表明表达Eya2或Eya3的细胞中Rac和Cdc42激活增加(图4B). GTP-Rac促进运动细胞前缘的跛足形成，而GTP-Cdc42与丝状伪足形成、细胞极化和细胞定向运动有关(雷德利等., 2003). 相反，在MCF7-Eya2（D209N）和Eya3（D246N）细胞中，GTP-RhoA水平增加，与观察到的应力纤维增加一致(图4A). 这些观察结果表明，EYA酪氨酸磷酸酶活性可以对Rho和Rac/Cdc42活性产生相反的作用，从而影响细胞运动和肌动蛋白细胞骨架。

Eya3在体内促进乳腺癌细胞系的转移

接下来我们使用了体内确定EYA3是否在MDA-MB-231细胞的转移活性中发挥作用的试验。MDA-MB-231表达眼睛3并产生肺转移(里克特等., 2005). 因此，它是RNAi敲低介导的EYA3转移功能评估的一个很好的候选者。稳定表达干扰控制RNA的MDA-MB-231细胞，眼睛3小干扰RNA，眼睛3siRNA与小鼠Eya3号机组，或眼睛3siRNA与小鼠Eya3（D246N）在5-6周龄免疫缺陷SCID小鼠尾静脉注射，7周后观察到肺转移。转移瘤是指在黑色背景下的黑色填充肺中出现的白色组织区域，对转移瘤进行计数并进行统计分析。这表明亲代MDA-MB-231细胞产生的转移明显多于那些表达眼睛3小干扰RNA(图5). MDA-MB-231型眼睛3siRNA细胞也比对照MDA-MB-231细胞产生更小的转移。在救援实验中，野生型的重新表达Eya3型导致近控制水平的转移，而酪氨酸磷酸酶死亡突变体的重新表达Eya3（D246N）没有。这些结果表明，与在体外早期的观察结果表明，EYA3是这些肿瘤细胞转移行为的决定因素，并且这种功能需要酪氨酸磷酸酶活性。

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图5

的简化表达式Eya3号机组通过siRNA-介导的MDA-MB-231细胞敲除减少肺转移的数量，这可以通过野生型的重新表达来挽救Eya3号机组，但不是Eya3（D246N）.

将稳定表达所述构建体的MDA-MB-231细胞注射到SCID小鼠的尾静脉中。注射后7周处死小鼠。在印度墨汁注射后，取下肺部，漂白并检查其表面转移情况。对检查的最大左肺的转移灶数量进行计数，并以方框图显示。水平黑线是中值，方框表示四分位范围（分布的25%到75%），线条表示最小值和最大值。

讨论

磷酸酶通过改变参与局部粘附和细胞外基质相互作用的蛋白质的磷酸化状态，在调节细胞迁移中发挥重要作用。这反过来可以通过Rho家族GTPases改变肌动蛋白细胞骨架（参见(拉森等., 2003;奥斯特文等., 2006)). 蛋白质酪氨酸磷酸酶可促进（PRL PTPs(菲奥尔达利西等., 2006)，PTP1B(梁等., 2005))，并抑制（HD-PTP(卡斯蒂廖尼等., 2007;马里奥蒂等., 2009)，DEP-1(詹特等., 2003))细胞运动性和侵袭性已有报道。我们的结果证明，Eyes Absent酪氨酸磷酸酶家族促进细胞迁移、侵袭和转化，并且这些功能需要磷酸酶活性。这一观察结果对EYAs在胚胎发育期间的细胞脂肪测定以及可能在癌症转移中的作用具有重要意义。

EYA磷酸酶活性和细胞运动/侵袭性之间的联系补充了最近的一份报告，该报告表明，Abl对果蝇EYA的磷酸化将其穿梭到细胞质中，在细胞质中执行尚未定义的基本细胞功能(熊等., 2009). Eya对细胞运动和肌动蛋白细胞骨架的影响与Eya磷酸酶的细胞质功能一致，与最近报道的H2AX核去磷酸化不同(厨师等., 2009;克里希南等., 2009). Eya的细胞质底物尚待阐明，但与细胞功能（如细胞运动）的直接联系可以提供一个关键的读数，以便在确定此类靶点后进行验证。

Eyas的过度表达也促进细胞增殖。然而，我们的数据表明，细胞增殖并不依赖于磷酸酶活性，而Eya的反式激活功能可能是更重要的因素。与我们的观察结果一致，Kriebel等人最近报道了Xeya3在爪蟾导致神经板扩张，在尾芽期大脑结构和眼睛显著扩大(克里贝尔等., 2007). 此外，他们还表明，与野生型Xeya3相比，缺乏磷酸酶的Xeya 3增强了观察到的神经增生。埃亚过度表达也会导致组织过度生长果蝇属(博尼尼等., 1997). 与Eya在细胞增殖中的作用相一致的是以前的报道，细胞周期调节基因cyclin D1和cyclin A1(科莱塔等., 2004;于等., 2006)和原癌基因c-Myc(锂等., 2003)是哺乳动物Eya-Six蛋白复合物的转录靶点。虽然增殖并不依赖于酪氨酸磷酸酶活性，但转化试验中发现的细胞生长接触抑制减少取决于磷酸酶活性。虽然接触抑制的机制尚不完全清楚，但酪氨酸磷酸酶介导细胞转化有先例(阿加西等., 2003).

视网膜决定基因EYA，六岁和DACH公司在包括卵巢和乳腺肿瘤以及恶性外周神经鞘肿瘤在内的多种恶性疾病中均表现出协同失调。反复出现的趋势是EYA公司和六个表达增加DACH公司表达减少。在这种情况下，值得注意的是眼睛不见了此处报告的过表达在以下情况下被镜像腊肠犬乳腺癌细胞中的水平降低(吴等., 2008;吴等., 2006). 此外，已经注意到扩散的增加SIX1系列乳腺癌中的过度表达(克里斯滕森等., 2007;科莱塔等., 2004). 综上所述，这些观察结果表明，这种细胞-脂肪酸测定级联的错误部署可能会导致肿瘤恶性度增加和临床结果变差。

The ability of眼睛A2先前描述了在异种移植模型中促进肿瘤生长(张等., 2005). 有趣的是，尽管体内证据联系EYA2型具有高增殖率的过表达细胞眼睛A2过度表达对细胞周期或细胞增殖的影响在体外使用几种卵巢癌细胞系和MDA-MB-468(张等., 2005). 相反，我们的数据显示埃亚MCF7细胞的过度表达和细胞增殖。此外，EYA水平和细胞运动之间的正相关关系在这两个方面都是一致的在体外（细胞迁移）和体内（肿瘤转移）。总之，这些数据将EYA蛋白的每个生化活性、反式激活和酪氨酸磷酸酶与癌症表型联系起来。

最后，EYA的酪氨酸磷酸酶功能与癌相关细胞表型的关联增加了抑制EYA磷酸酶可能是一种有吸引力的靶向抗癌治疗新模式的明显可能性。作为抑制剂设计的靶点，EYAs具有明显的优势；它们在机械和结构上与传统的基于硫醇的PTP大家族不同，因此增加了选择性抑制的可行性。

补充材料

致谢

参考文献