突触后F-actin组织的关键步骤：aPKC和PTEN对Baz/Par-3定位的调节

RNAi菌株的产生

aPKC-RNAi转基因是针对dapkc公司基因组区域。Baz-RNAi转基因是针对巴兹基因组区域。RNAi构建如(卡利达斯和史密斯，2002年). 转基因被亚克隆到pUAST载体中，并送往Genetic Services Inc.（马萨诸塞州剑桥）进行生殖系转化。

免疫细胞化学

在Ca中解剖了三龄幼虫的体壁肌肉⁺⁺-游离盐水(1976年1月和1月)用4%多聚甲醛固定30分钟，或用非酒精Bouin固定15分钟。抗Baz(Wodarz等人，2000年)（1:500）、抗PTEN（1:200；见下文）、抗磷酸化-Baz（1:100；见下图）、抗α-spectrin（1:30；发育研究杂交瘤库[DSHB]）、抗GluRIIA（1:10；DSHB）、抗-GluRIIB和抗-GluRIII(Marrus等人，2004年)（分别为1:500和1:200），抗DLG_浦东新区(Koh等人，1999年)（1:20000）和防划线(Roche等人，2002年)（1:1000）、抗aPKC（1:1000，Sigma，Santa Cruz，CA）、德克萨斯红或Cy5结合抗HRP（1:200；Jackson Immunoresearch，West grove，PA）用作主要抗体。突触后肌动蛋白和肌肉肌动蛋白用罗丹明结合的指骨肽（1:50–1:100；分子探针）标记。谷氨酸受体染色采用额外一轮抗FITC扩增（1:800；Sigma，Santa Cruz，CA）。作为二级抗体，FITC-、TxRed-和Alexa 647-结合抗体（宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson Immunoresearch）的使用比例为1:200。

PTEN和磷酸化Baz抗体的产生

通过Biosource（也称为QCB；马萨诸塞州霍普金顿）在兔中培养针对肽CLGRRSISEK的亲和纯化的磷酸化-Baz抗体，其中第一丝氨酸残基（CLGRRpSISEK）磷酸化。针对两种不同的肽，即CIRNVVSKRIRYKEKGYD和CISVLHDSATENAKPDRLK，通过QCB在兔子体内共注射，制备了抗PTEN的亲和纯化抗体。通过在肌肉中表达特异性RNAi转基因以及使用免疫细胞化学和Western blot分析转染的S2细胞来测试抗体的特异性。

共焦显微镜和形态定量

使用蔡司（德国Oberkochen）共焦显微镜，使用63X物镜（1.4数值孔径）获取图像。为了进行基因型之间的比较，从同时处理的样品中收集共聚焦堆栈，并使用相同的共聚焦采集参数成像。荧光信号强度的量化是通过使用Volocity 4.0软件（Improvision，Waltham，MA）通过共焦叠加对原始数据进行体积测量来实现的。为了测量突触后体积（V）和强度（I），我们选择单个神经束作为Volocity的三维体积进行分析。根据NMJ处的强度与背景强度的差异，通过强度阈值分割出酒石桶周围的标记区域。体积和荧光强度表示低于阈值的每个体素的体积或强度之和。通过计算与抗HRP标记物（突触前波顿体积）所占体积重叠的感兴趣标记物所占体积或强度来测量突触前体积或强度。为了获得突触后的体积或强度，从总体积或强度中减去抗HRP体积。突触后体积和强度表示为V（V）_{post-vol或int}/V（V）_布顿为了量化肌肉中的磷酸化-Baz、aPKC或PTEN信号强度，选择肌肉6的特定区域，并根据大小和强度量化点子。一旦穿孔被分割，测量其平均强度和大小。对于GluRIIA、GluRIIB和GluRIII量化，使用Volocity软件计算单个簇的体积、平均强度和总强度。数据被归一化为野生型样本。对于F-actin，在肌肉12/13处进行共焦成像和量化，此处突触后F-actin和收缩器内F-actin之间的距离相对较大（参见图1C)从而可以在不受强肌原纤维背景干扰的情况下获取NMJ F-actin的图像。所有其他量化均在6/7肌肉处进行。为了测定I型肉芽的数量，用抗HRP和抗Dlg双重染色体壁肌肉制剂。测量取自腹部第3段肌肉6和7。在所有实验中，将突变表型的量化标准化为在同一实验阶段使用共焦显微镜解剖和成像的野生型对照样品。为了进行统计分析，对实验样本和同时处理的野生型对照进行了未配对Student t检验。如果样本之间的方差是显著的，则采用韦尔奇校正的非配对t检验(Frank和Althoen，1994年)执行。直方图中的数字表示平均值±SEM。*=p<0.05，**=p<0.001，***=p<0.0001。

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图1

突触后F-actin和SSR的排列与收缩器的关系

(A类)显示突触后F-肌动蛋白/血影蛋白、aPKC、微管、SSR和收缩器的相对位置的NMJ图。N=原子核。

(B类)肌肉12处野生乔木的三维共焦图像，标记有抗HRP（蓝色）和罗丹明-球蛋白（红色）(左侧面板; 另请参见补充电影1)X-Y-Z三维等值面绘制显示，单个NMJ分支包含突触束（蓝色），周围是位于肌肉收缩装置（红色）上方的突触后富含F-actin-结构域（红色）。在右侧面板，相同的图像现在显示为Y–Z平面，显示突触后F-actin（红色）围绕突触束（蓝色），在收缩器处与F-actin分离（距离由双向箭头标记）。箭头和箭头指向突触后肌动蛋白。

(C类)通过肌肉12（m12）处NMJ分支的透射电子显微照片显示了几根发条（Ib，Is，III）和NMJ分支点附近的收缩器区域。红色双向箭头表示SSR和这些过度收缩肌肉中收缩器肌原纤维之间的距离。

(D–F型)肌原纤维区的高倍视图显示(D类)穿孔Z带(E类)肌球蛋白-肌动蛋白晶格和肌浆网（sr），以及(F类)二联体由t小管和sr室组成。

(G公司)从肌肉13（m13）到肌肉12以及肌肉12处的NMJ分支点的神经视图。在这个区域，SSR和肌肉收缩器（双向箭头）之间的距离较大。N=核；Z=穿孔Z带；mi=线粒体；ssr=突触下网。

校准棒B为3.5μm，C、G为0.4μm，D–F为80 nm。

西方印记

将全长Baz、PKM和dPTEN2 cDNA亚克隆到pAcV5.1/HisA或-B载体（Invitrogen，Carlsbad，CA）中，用于转染到果蝇属施耐德-2（S2）电池。使用QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit（Strategene，La Jolla，CA）对dPTEN2构造进行突变，消除脂质（G137E）和蛋白质（C132A）磷酸酶活性。细胞培养物在1000g×5min离心，颗粒在裂解缓冲液（20mM Tris HCL pH 7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1%NP-40，25μM MG132，蛋白酶抑制剂鸡尾酒(托马斯等人，1997年)和磷酸酶抑制剂I和II混合物（Calbiochem，San Diego，CA）用于激酶分析，PTEN脱磷酸化分析不含磷酸酶抑制剂，然后用含有10%DTT和5%巯基乙醇的样品缓冲液煮沸。蛋白质在5%的SDS-PAGE凝胶上分离，转移到PVDF或硝化纤维素膜上，然后依次用抗磷-Baz（1:5000）、抗Baz（1:2000）和抗α-spectrin（1:1000）进行免疫印迹。对于lambda磷酸酶分析，将蛋白质转移到硝化纤维素膜上，并在含有1%BSA、0.1%Triton X-100、2 mM MnCl的Tris缓冲盐（TBS）中培养₂和400μl/ml的lambda磷酸酶（Upstate，Lake Placid，NY）在室温下保持1小时，然后用0.1%Tween20的TBS洗涤，并依次用抗磷酸Baz（1:5000）和抗Baz（1:2000）探测。用化学发光法（Amersham，Piscataway，NJ）观察带。使用图像J测量归一化的P-Baz/Baz带强度。调整负载（spectrin）控制并减去非转染对照提供的背景后，将Baz转染细胞的值归一化为Baz或P-Baz，并计算P-Baz/Baz比率。

透射电子显微镜

为TEM准备体壁肌肉(贾等人，1993年;Packard等人，2002年). SSR厚度分析如下(Budnik等人，1996年). 为了分析SSR外边界与肌肉12处肌原纤维之间的距离，使用了3种制剂中的15个发球。比较野生型和aPKC-RNAi-post动物的SSR厚度，从3只野生型（在bouton中线测得9个bouton）和3只aPKC-RNA i-post动物（在booton中线测得了6个boutons）进行。为了进行统计分析，对实验样本和野生型对照进行了未配对的Student t检验。

aPKC底物Baz调节突触后F-肌动蛋白丰富区的大小

上述结果表明，spectrin对突触后F-actin组织至关重要，但似乎不是唯一的决定因素。为了寻找F-actin和spectrin的其他调节因子，这些调节因子可能是aPKC在突触后区域作用的基础，我们重点研究了已知的aPKC底物Baz/Par-3，它也存在于NMJ(Nagai-Tamai等人，2002年;Ruiz-Canada等人，2004年). Baz与哺乳动物上皮细胞中基于肌动蛋白的细胞连接的形成有关(Lin等人，2000年;蒙罗，2006). 在幼体NMJ，Baz在突触后F-actin区域高度富集(Ruiz-Canada等人，2004年)，但在微管富集区也以点状模式存在(图3A)aPKC本地化的位置(Ruiz-Canada等人，2004年). 因此，我们确定aPKC对突触后F-actin和spectrin的调节是否与Baz有关。与这一观点一致的是，通过在肌肉中表达aPKC RNAi，单独降低肌肉中的aPKC活性，导致突触后区域Baz定位的减少，与F-肌动蛋白面积的减少完全一致(图3B，I). 突触后区域Baz、spectrin和F-actin的减少是非常特殊的，因为它没有伴随着该区域其他蛋白质的水平或定位的显著降低，例如支架蛋白DLG和Scrib(补充图2B，C). 因此，aPKC可能部分通过Baz调节突触后F-actin。

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图3

Baz在F-actin区域富集，Baz水平降低

三龄幼虫NMJ的单共焦切片，

(A–B)用抗HRP（蓝色）、抗Baz（绿色）和罗丹明-球蛋白（红色）三重染色（A）野生型或（B）aPKC-RNAi-Post（肌肉12）。

(C–D类)用抗HRP（蓝色）和抗Baz（绿色）双重染色（C）野生型和（D） 巴兹/+; Baz RNAi-post（肌肉6或7）。

（东-西）抗HRP双重染色（蓝色）和（E–F）罗丹明-球蛋白（红色），或（G–H）抗α-spectrin（绿色）in(E、 G）野生型(F、 H（H）)巴兹/+; Baz RNAi-post（肌肉12/13用于F-actin，肌肉6/7用于spectrin）

(I–M公司)量化(我)标准化突触后Baz强度（“n”表示波顿数“(J型)标准化突触后F-actin（黑条，肌肉12/13）和spectrin（白条，肌肉6/7）强度（“n”表示波顿数），（K）标准化突触后体积（n与J相同）(L（左）)布顿数（n表示乔木数量），以及(M（M）)所示基因型中的波顿体积（n表示波顿数）。

校准棒A、B为15μm，C为10μm–H。

通过确定肌肉中Baz的下调是否模拟了aPKC降低对NMJ结构和突触蛋白定位的影响，来检验上述可能性。中的空突变巴兹由于该蛋白在建立细胞极性中的作用，导致胚胎死亡(Izumi等人，1998年;Lin等人，2000年;Nagai Tamai等人，2002年). 因此，为了下调Baz，我们使用UAS-Gal4系统在肌肉中表达Baz-RAi。为了支持观察到的效应不是由于非靶向RNAi效应的观点，我们使用了两种不同的RNAi株，其中RNAi针对Baz mRNA的两个不同区域，以及Baz-RNAi针对Baz的两个区域巴兹/+杂合背景。在上述所有基因型中，Baz的免疫反应性均显著降低(图3C、D;补充图3). 此外，下调巴兹在所有基因型中，导致表型与肌肉中aPKC下调观察到的表型完全重叠。首先，富含精蛋白和F-肌动蛋白的突触后区域的体积和强度急剧减少(图3E–H、J、K). 其次，突触突数量显著减少，形态异常，体积显著增加，类似于aPKC RNAi后(图3L、M). 在改变突触细胞骨架的其他条件下，也观察到突触波顿数的类似减少(Pielage等人，2006年;科赫等人，2008年). 在UAS线或肌肉特异性Gal4线中未观察到bouton数的减少，这表明这些插入本身不会影响NMJ形态或bouton数量(补充图4). 因此，下调巴兹或dapkc公司导致相同的表型。

磷蛋白Baz被排除在富含F-actin/spectrin的突触后区域之外

上述结果提出了一些重要问题。例如，内源性aPKC并不定位于突触后富含F-actin的区域，而是存在于该区域外的点状突起中(Ruiz-Canada等人，2004年)（请参见图1A). 因此，如果aPKC通过磷酸化Baz来调节F-actin，那么这个事件一定发生在富含F-actin的突触后区域之外。通过检测磷酸化Baz的定位以及Baz磷酸化对aPKC活性的依赖性，解决了这种可能性。针对含有丝氨酸残基的保守肽（Baz中的S980），提出了磷酸特异性Baz抗体，该保守肽在哺乳动物和苍蝇中被aPKC磷酸化(Nagai-Tamai等人，2002年;本顿和圣约翰斯顿，2003年). 令人惊讶的是，我们发现突触后肌肉中磷酸化-Baz免疫反应在肌肉中呈点状(图4A)实际上被排除在F-actin/spectrin富集区之外(图4D). 此外，突触前神经束内存在磷酸化硼(图4D). 这一免疫反应是特异性的，并且依赖于aPKC的Baz磷酸化，四条证据表明。首先，在肌肉中表达组成性活性aPKC形式PKM，增加了磷酸化-Baz免疫反应性肌肉点状突起的整体大小和强度(图4B、F). 其次，通过表达aPKC-RNAi降低肌肉中的aPKC水平，导致点状突起的大小和强度显著降低(图4E，F). 第三步将抗体与用作免疫原的磷酸肽预孵育，完全消除免疫反应性(补充图5A、B). 最后，磷酸化-Baz免疫反应性在巴兹/+; 幼虫后Baz RNAi(图4C、F).

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图4

Baz在肌肉中被aPKC磷酸化，并且在突触后富含F-肌动蛋白的区域中缺失

(A–E)在标记有抗磷Baz（绿色）和抗HRP（蓝色）的制剂中，第3龄肌肉区域和肌肉6或7处的NMJ(A、 D类)野生型(B类)PKM岗位(C类)baz/+；Baz-RNAi-post和(E类)aPKC-RNAi-post。箭头在D类指向突触后富含F-肌动蛋白的区域，该区域由一条白线勾勒，没有磷酸化-Baz。

(F类)野生型、aPKC-RNAi-post和PKM-post肌肉中磷酸化-Baz点刺的体积和强度的量化。数据被标准化为野生型值（n代表肌肉数量）。

(G、 我)制剂中肌肉区域的共焦图像(G公司)用P-Baz（绿色）和Baz（红色）抗体依次标记，显示每个P-Baz点刺与一个Baz点（箭头）共定位，并且只有Baz点的一个子集包含磷酸化的P-Baz，（箭头指向没有P-Baz免疫反应性的Baz点），和(我)处理方法与G相似，但在实验中省略了抗Baz抗体，以确保第一个二级抗体（FITC 2^第)饱和所有抗P-Baz位点，在与TxR-2孵育后缺乏信号在I2中观察到^第抗体。

(H、 J型)S2细胞提取物转染有上述印迹结构的蛋白质印迹，并用左图所示抗体依次探测，显示(H（H）)通过PKM和(J型)lambda磷酸酶测定。Untrans=未转染细胞。

校准棒A、B、C、E为14μm，D为5μm，G为2μm。

为了确定肌肉皮层中的内源性P-Baz点是否与内源性Baz点的子集共定位，我们进行了顺序免疫标记（培养：P-Baz初级→洗涤→FITC-次级→洗涤→Baz初级>洗涤→TxR-次级→wash），因为抗P-Baz和抗Baz抗体都是在兔子身上制备的，排除了同时使用双标记技术(图4G). 为了确保第一轮兔子次级（FITC-次级）在P-Baz抗体中的结合位点完全饱和，我们进行了一项对照，其中样品在FITC-二级抗体后与TxR-次级孵育（孵育：P-Baz初级→洗涤→FITC-次→洗涤→TxR-secondary→洗涤）(图4I). 在这些条件下，在红色通道中未发现标记，表明FITC-二次孵育后抗P-Baz抗体结合位点完全饱和(图4I2). 我们发现每个P-Baz punta都与Baz putta精确地位于同一位置(图4G，箭头）。然而，只有Baz punta的子集与P-Baz putta共定位(图4G，箭头），表明并非每个Baz点都会内源性磷酸化。这一结果通过在野生型肌肉中表达GFP标记的Baz转基因（Baz-GFP）得到了证实，该基因与Baz putta的一个子集共定位(补充图6A; 黄色箭头）。当Baz-GFP-post样本用P-Baz抗体双重标记时，我们观察到一个点状细胞亚群，它对GFP和磷酸化-Baz免疫反应均呈阳性(补充图6B; 黄色箭头）。为了确定这种共定位是否是Baz、P-Baz和GFP通道中的点之间简单随机重合的结果，我们将GFP通道旋转90°。如果共定位只是巧合，那么这个旋转不应该影响共定位的点的数量。然而，在90°旋转时，GFP和Baz或P-Baz斑点之间几乎没有共定位(补充图6C、D)，证明Baz-GFP和P-Baz或Baz-GPP和Baz显示出真正的同位化。因此，Baz在S980被突触后F-actin/spectrin-rich区域外的aPKC磷酸化，因此在突触后F actin/sspectrin-rrich区域观察到的Baz蛋白很可能与判定元件磷酸化Baz。

aPKC磷酸化Baz的能力也在单转染或双转染aPKC和/或Baz的Schneider-2（S2）细胞中得到证实。Baz在S2细胞中内源性表达，但水平较低，因此在未转染细胞中观察到非常微弱的磷酸化-Baz带(图4H)，很可能是由于内源性aPKC的活性。不同通道中磷酸化-Baz水平与Baz水平的比率比较表明，单独转染Baz或单独转染PKM的细胞显示该条带的强度略有增加(图4H;补充图7A). 然而，这种增加与Baz的绝对水平无关，部分是由于存在内源性蛋白质。相比之下，转染Baz和PKM的细胞的磷酸化-Baz带强度显著增强（100%增加）(图4H;补充图7A). 用lambda磷酸酶处理Western blots可逆转这种效应，从而消除Baz和PKM双转染细胞中P-Baz带水平的增加(图4J).

PTEN是一种定位于富含F-肌动蛋白的突触后区域的磷酸酶，是突触后Baz定位所必需的

上述观察结果表明，Baz在突触后F-actin/spectrin富集区外被aPKC磷酸化。此外，他们还表明突触后F-actin/富含光谱蛋白区域的Baz蛋白代表判定元件磷酸化Baz。这就提出了一个问题，即为什么aPKC活性的降低（导致Baz磷酸化的降低）实际上会导致减少F-actin/spectrin富集区的Baz。一个可能的模型是，Baz磷酸化是Baz正确运输或靶向F-actin/spectrin富集区所必需的，但Baz在此位置的保留需要去磷酸化事件(图5A). 为了测试这个模型，我们使用了一种候选方法来识别可能介导Baz去磷酸化的磷酸酶。

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图5

PTEN定位于突触后富含F-肌动蛋白的区域

(A类)NMJ的Baz贩运模型。详见正文。

(B–C类)量化（B）所示基因型的标准化突触后PTEN荧光强度（黑条）和标准化体积（白条）（C）所示基因型中的标准化皮层PTEN强度（n表示肌肉的数量）。

(D–E型)制备中肌肉6或7处的三龄NMJ用抗PTEN（绿色）和抗HRP（红色）双重染色（D）野生型和（E） pten（聚四氟乙烯）/+; PTEN RNAi后。

（F）野生型三龄NMJ三重标记罗丹明-球蛋白（红色）、抗PTEN（绿色）和抗HRP（蓝色）。

D的校准棒为14μm–F、。

最近对苍蝇的研究表明，Baz与脂类和蛋白磷酸酶PTEN相互作用(von Stein等人，2005年;Pinal等人，2006年)Baz需要将PTEN募集到肌动蛋白重塑区域(Pinal等人，2006年). 因此，一个有吸引力的Baz磷酸酶候选物是PTEN。我们假设的三个预测(图5A)是（1）PTEN应该定位于F-actin/富含光谱蛋白的突触后区域，其中判定元件磷酸化-Baz是局部的，（2）pten（聚四氟乙烯）应减少判定元件磷酸化-Baz定位于F-actin/spectrin-rich区域，（3）PTEN突变应增加肌肉皮层（F-actin/spectrin-rich区域外）的P-Baz数量。为了测试这些预测，我们产生了一种识别所有PTEN剪接变体（PTEN1-3）的抗肽PTEN抗体(Pinal等人，2006年)；补充图5C、D). 正如预测的那样，在野生型幼虫中，PTEN在F-actin/spectrin区域高度富集，根据其在该区域与F-actin的精确共定位测定，PTEN与Baz准确共定位(图5D、F). PTEN免疫染色具有特异性，在野生型肌肉（PTEN-RNAi-post）或pten（聚四氟乙烯）/+杂合背景导致突触后和肌皮质PTEN水平急剧下降(图5E、B、C). 这个pten（聚四氟乙烯）本研究中使用的突变体（参见方法）先前被鉴定为pten（聚四氟乙烯）这是由于F元素的插入完全消除了磷酸酶结构域，从而导致胚胎死亡(Gao等人，2000年). 此外，将抗体与用作免疫原的肽预先孵育，实际上消除了肌肉皮层的免疫反应性(补充图5C、D).

Baz和PTEN之间的共定位，以及之前报道的这两种蛋白质之间的相互作用，使PTEN成为在F-actin/富含光谱的突触后区域介导Baz去磷酸化的有力候选者，并且根据我们的模型，在该区域保留Baz。因此，我们接下来研究了下调PTEN是否会导致Baz在周突区的定位发生变化。正如预测的那样，下调PTEN导致突触后F-肌动蛋白富集区Baz定位的急剧减少(图6A、B、K)在两种蛋白中都观察到类似的减少(图6C、D、I、J)以及F-actin区域(图6I，J). F-actin/spectrin区域的其他标记物，如DLG和Scrib没有改变(补充图2B，C).

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图6

PTEN诱导Bazooka去磷酸化并影响突触后肌动蛋白谱区

(A–B)肌肉6或7处的三龄NMJ用抗HRP（红色）和抗Baz（绿色）双重染色(A）野生型(B）PTEN-RNAi-post公司。注意，与野生型相比，PTEN-RNAi-post突触后Baz减少，如A3、B3中的箭头所示。

（C–F）用抗HRP染色的三龄NMJ（红色）和（C、D）抗α-spectrin（绿色），或（E、F）抗磷黄（绿色）（C、E）野生型和（D、F）PTEN-RNAi-Post公司。

（G–H）抗HRP（红色）和抗PTEN（绿色）染色的三龄NMJ（G）野生型和(H（H）)巴兹/+; Baz-RNAi-post公司。

(I、 J)量化(我)归一化体积和(J型)所示基因型中α-精蛋白（黑条；肌肉6或7）和F-actin（白条，肌肉12）的归一化强度。n代表波顿数，n与I和J相同。

(K（K）)所示基因型中标准化突触后Baz体积（黑条）和标准化突触后Baz荧光强度（白条）的量化。n表示波顿数。

（L）野生型、PTEN RNAi-post和pten/+；PTEN RNAi-post公司。n表示肌肉的数量。

(M（M）)对转染了上述印迹基因的细胞的S2细胞提取物进行Western印迹，并用左侧所示抗体依次进行探测，显示了PTEN对Baz的去磷酸化作用。

A1–2、B1–2、C的校准棒为7μm–A3、B3为H和3.5μm。

与我们的假设一致，肌肉中PTEN的下调也导致突触后F-actin丰富区外肌肉P-Baz点的显著增加(图6E、F、L). 总之，这些结果提供了令人信服的证据，证明PTEN在S980诱导Baz去磷酸化，磷酸化的Baz不保留在突触后区域。有趣的是，下调Baz也导致PTEN在周突区的定位降低(图6G、H)与之前在感光细胞中的观察一致，Baz在向细胞膜募集PTEN中起作用(Pinal等人，2006年).

在转染Baz和PTEN变体的S2细胞中，也测试了PTEN参与Baz去磷酸化的可能性。鉴于Baz已被证明与PTEN2特异性相互作用，而不是与PTEN的其他亚型相互作用(von Stein等人，2005年;Pinal等人，2006年)用野生型和突变的PTEN2 cDNA转染S2细胞。用Baz转染表明，如P-Baz抗体所示，Baz在S2细胞中内源性磷酸化(图6M;补充图7B). 相反，在双转染Baz和PTEN2的细胞中，P-Baz磷酸化水平显著降低(图6M;补充图7B)证明PTEN参与Baz的去磷酸化。此外，改变PTEN2的PDZ结合域，使其与Baz的PDZ2-3相互作用，完全阻止了这种去磷酸化(图6M;补充图7B)表明Baz脱磷需要Baz和PTEN2之间的直接相互作用。这一观察进一步提高了PTEN可能直接去磷酸化P-Baz的可能性。

PTEN具有脂类和蛋白磷酸酶酶活性(Lee等人，1999年). 因此，我们接下来测试了P-Baz脱磷所需的这些活性。特别是，我们生成了一个PTEN2变体，PTEN2^132A元蛋白质磷酸酶和脂质磷酸酶活性都需要保守的半胱氨酸（哺乳动物为C124，苍蝇为C132）(Cai等人，2005年)，突变为丙氨酸。此外，我们还生成了PTEN2变体PTEN2^G137E号其中一个保守的甘氨酸（哺乳动物中为G129，苍蝇中为G137），仅对脂类磷酸酶活性是必需的(Cai等人，2005年)，突变为谷氨酸。如预期，阻断PTEN2中的脂质磷酸酶活性^G137E号，不影响PTEN2去磷酸化P-Baz的能力(图6M;补充图7B). 相反，阻断PTEN2中的蛋白质和脂质磷酸酶活性^132A元完全阻断的P-Baz脱磷(图6M;补充图7B). 结合观察到Baz在突触周围区域的正常定位依赖于PTEN，PTEN与去磷酸Baz共定位，上述结果与PTEN对Baz的去磷酸化需要将Baz保留在突触后区域的模型一致，Baz去磷酸化需要与PTEN直接相互作用，并取决于PTEN的蛋白磷酸酶活性。

PTEN的下调部分模拟了巴兹两种基因相互作用

除了PTEN下调时Baz、Spec和F-actin的变化，这些变化与通过减少肌肉中的Baz或aPKC观察到的变化相同，我们还发现其他常见表型也存在。例如，在两者中pten（聚四氟乙烯）/+; PTEN-RNAi-post或PTEN-RNAi-post单独存在时，突触束的数量显著减少(图7A). 此外，PTEN-RAi后幼虫的肉芽体积显著增加(图7B).

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图7

PTEN下调影响波顿数和波顿体积

（A–C）量化（A、C）所示基因型中的布顿数（n代表乔木数量），以及（B）归一化波顿体积（n表示波顿数）。

为了进一步支持PTEN与Baz在NMJ中的发育途径相同的观点，我们对零突变杂合子进行了经典的遗传测试(Anholt和Mackay，2004年;格林斯潘，2006;Pawson等人，2008年). 杂合子pten公司/+或巴兹/+幼虫体内的NMJ与野生型无法区分(图7C). 然而，转杂合子显示突触波顿的数量显著减少，这有力地表明了基因间的相互作用pten（聚四氟乙烯）和巴兹（纯加性相互作用的突触波顿数预计减少19%，而纯杂合子减少30%；图7C).

我们要感谢肖恩·斯佩斯博士对手稿的有益评论，以及巴德尼克实验室成员的讨论。我们还感谢Ricardo Medina博士在磷酸化分析中提供的有益建议，感谢Daniel St.Johnston博士、Ronald Dubreil博士、Graeme Davis博士、Duojia Pan博士和Bloomington库存中心提供的果蝇库存。这项工作得到了NIH拨款R01 NS030072至V.B.的支持。还使用了糖尿病内分泌研究中心拨款DK32520支持的核心资源。