分化细胞的启动子DNA甲基化模式主要在祖细胞阶段编程

脂肪和肌源性分化

在含有10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基中培养ASC，并用0.5 mM 1-甲基-3异丁基黄嘌呤、1μM地塞米松、10μg/ml胰岛素和200μM吲哚美辛刺激3周(博奎斯特等。, 2005). 用Oil Red-O对细胞进行染色以观察脂滴。为了进行肌源性分化，70%汇合处的MPC在含有2%马血清的DMEM中培养6天(瑟伦森等。, 2009). 细胞核用苏木精和伊红染色。

亚硫酸氢盐测序

使用MethylEasy（澳大利亚悉尼人类遗传特征）对基因组DNA进行亚硫酸氢转化，并通过聚合酶链反应（PCR；补充表S1）进行扩增。PCR产物被克隆到细菌中并按前面所述进行测序(没有等。, 2006). 显示了大约五个细菌克隆的CpG甲基化信息。

甲基-DNA免疫沉淀（MeDIP）和微阵列杂交

如前所述，从4μg DNA中重复进行MeDIP(韦伯等。, 2007)，稍作修改(瑟伦森和科拉斯，2009年). 简言之，基因组DNA在37°C下用30μg/ml RNase A处理2小时，稀释至200μl，并通过冰上超声波破碎至约200–800碱基对，富集至约400碱基对片段。以糖原为载体，乙醇沉淀声波DNA，并溶解于60μl MilliQ H中₂O（Millipore，Billerica，MA）。将4微克声波DNA稀释在450μl TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0和1 mM EDTA）中，在沸水中变性10分钟，并立即在冰上冷冻10分钟。51微升10×免疫沉淀（IP）缓冲液（1×：140 mM NaCl，10 mM Na-phosphate，pH 7.0和0.05%Triton X-100）添加10μl 5-甲基胞嘧啶抗体（MAb-5MCYT；Diagenode，Liège，Belgium），并在4°C的转轮上培养2 h。添加预洗Dynabeads M-280绵羊抗鼠免疫球蛋白（Ig）G（Invitrogen，Oslo，Norway）于40μl 1×IP缓冲液中，并在旋转器上4°C培养2 h。通过磁性分离收集样品，清洗，免疫复合物用蛋白酶K在50°C下消化3 h。用酚氯仿异戊醇提取DNA，乙醇沉淀，并溶解在15μl H中₂O过夜。除未进行免疫沉淀步骤外，输入DNA按上述方法进行片段化和处理。使用WGA-2全基因组扩增试剂盒（密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）对沉淀和输入的DNA进行扩增，并使用MinElute PCR纯化试剂盒（德国希尔登QIAGEN）进行净化。

对于PCR分析，将扩增和纯化的MeDIP和输入DNA稀释至～25 ng/μl，并使用补充表S1中列出的引物通过PCR扩增1μl。PCR条件为95°C持续3分钟，30次95°C循环30秒，60°C持续30秒，72°C持续30s，然后在72°C下持续7分钟。PCR产物在1%琼脂糖凝胶中用溴化乙锭染色。

为了与微阵列杂交，分别用Cy3和Cy5标记输入和MeDIP DNA片段，并将其杂交到Roche-Nimblegen人类HG18 RefSeq启动子阵列上（C4226-00-01；Nimblegen，Madison，WI）。使用NimbleScan将信号强度数据集中于零(约翰逊等。, 2008). 根据缩放日志₂MeDIP/输入比，在每个连续的探针周围放置750个碱基对窗口，并应用单侧Kolmogorov–Smirnov（K-S）测试来确定探针是否来自强度对数的显著正分布₂与数组中其他部分的比率相比。每个探针的结果得分为对-该探针周围窗口测试的值。使用NimbleScan，甲基化峰值数据由对值，方法是使用对-值截止值为0.01或更小。使用Nimblegen SignalMap查看数据并保存在NCBI GEO下{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE19795”，“term_id”：“19795”}}1997年1月.

日志的相关性₂如前所述，使用MaxTen计算的值计算重复之间的MeDIP/输入DNA比率(奥金等。, 2006). 该算法通过找到最高平均对数对每个启动子进行评分₂每平铺区域10个连续探针之间的比率。绘制的MaxTen值是每种细胞类型两个MeDIP复制的平均值。如前所述，对平铺区域的平均甲基化富集进行了转基因计算(达尔等。, 2009)通过使用富集概率高的基因（K-S≤0.05）。

染色质免疫沉淀（ChIP）和微阵列杂交

ChIP基本上如前所述执行(Dahl和Collas，2007年). 简而言之，将细胞与1%甲醛交联8分钟，将裂解缓冲液添加至～120μl，并将样品在冰上培养5分钟。对细胞进行声波处理，产生约400个碱基对的片段。离心后，收集上清液，染色质稀释至0.5A类₂₆₀单位，100μl与2.4μg与磁性Dynabeads蛋白A（Invitrogen）偶联的抗体在4°C下孵育2小时。清洗ChIP材料后，向ChIP样品中添加5μg RNA酶A，用1%SDS和50μg/ml蛋白酶K在68°C下洗脱DNA 2 h，并将DNA溶解在10μl MilliQ水中。通过与MeDIP实验中使用的相同启动子阵列杂交来分析ChIP DNA。H3K9me3的抗体来自Diagenode（pAb-056-050），H3K27me3来自Millipore（07-449[注：ex-Upstate目录编号05-851]），而H3K4me3来自Abcam（英国剑桥；Ab8580）。

使用WGA4试剂盒（Sigma-Aldrich）扩增ChIP和输入DNA，如上所述进行清洁，并在30μl MilliQ水中洗脱。ChIP和输入DNA片段分别用Cy5和Cy3标记，并与上述启动子阵列杂交。使用NimbleScan分析数据(约翰逊等。, 2008)并可在NCBI GEO下访问{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE17053”，“term_id”：“17053”}}GSE17053标准。通过使用500碱基对滑动窗口搜索信号高于截止值的至少四个探针来检测峰值。比率数据随机20次以评估假阳性的概率，每个峰值的假发现率为0.1或更低。如前所述，由具有已鉴定峰值的基因进行元基因组装(达尔等。, 2009).

基因本体分析

使用Bioconductor GOstats计算目标基因集中的基因本体（GO）术语丰富度(《猎鹰与绅士》，2007年). GOstats识别所选基因的功能项，并通过提供一个p值来表示所识别的项在目标基因中富集的概率，该概率相对于根据属于该项的基因组中基因的数量所期望的概率，从而为该项的富集提供意义。

脂肪组织、骨髓和肌肉祖细胞共享大量高甲基化基因

我们发现在ASC和BMMSC中，相对于基因组平均甲基化，3300个启动子高度甲基化，2630个在MPC中，3902个在HPC中，具有高度显著性（K-S测试p值≤0.01，用于检测甲基化“峰值”）(图2A） ●●●●。这占阵列上所有RefSeq启动子的15-22%(图2A） ●●●●。杂交模式(图2B） 并计算了所有启动子甲基化强度的MaxTen值(图2C） 显示了ASC、BMMSC和MPC之间的高度相似性和重叠性。对至少有一个高甲基化峰的启动子的交叉分析表明，ASC和BMMSCs共有2486个高甲基基因（占这些细胞类型中所有高甲基化基因的74%；图2、C和D）。ASC和BMMSC分别与MPC共享1944（57%）和2053（61%）个高甲基化基因(图2、C和D）。我们还鉴定了1755个ASC、BMMSC和MPC常见的高甲基化基因的核心，代表了这些细胞类型中所有高甲基化的基因的52-66%(图2D） ●●●●。另外20-30%在三种细胞类型中的两种细胞中甲基化，而15-20%仅在一种细胞类型上甲基化(图2E） ●●●●。这些数据表明脂肪组织、骨髓和骨骼肌的祖细胞中启动子DNA甲基化模式高度相似。

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图2。

间充质祖细胞启动子DNA超甲基化的MeDIP芯片分析。（A） ASC、BMMSC、MPC和HPC中高甲基化RefSeq启动子的数量和百分比。（B） 甲基化图谱显示1号染色体两段上的甲基化（左）和非甲基化（右）启动子（log₂IP/输入）。（C） 一种细胞类型与另一种细胞的甲基化强度MaxTen值的二维散点图。绘制了两个MeDIP复制品的平均MaxTen值。数据点被着色以表示根据峰值调用算法进行的分类，以显示一种（紫色、绿色）或两种（蓝色）细胞类型中的高甲基化启动子。（D） ASC、BMMSC和MPC中高甲基化启动子的文氏图分析。（E） 从D。

为了确定高甲基化基因核心是否对间充质祖细胞具有特异性，我们还检测了骨髓来源的CD34⁺高性能混凝土。我们发现1755个核心高甲基化基因中有91%在HPC中也被高甲基化，而HPC中含有2302个高甲基化的基因，这些基因将其与间充质祖细胞区分开来(图3A） ●●●●。此外，仅在ASC、BMMSC或MPC中发现30-50%的基因甲基化过度(图2D、 新月体）在HPC中也被高度甲基化（补充图S3）。补充表S2提供了ASC、BMMSC和MPC中的这些高甲基化基因列表。

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图3。

MSCs和HPC中高甲基化基因的GO术语富集。（A） MSC甲基化核心与HPC中高甲基化基因的文氏图分析。（B） MSCs和HPC中高甲基化基因的丰富GO术语。（C） 在NPC和KPC中，发育调控启动子的一个子集被高度甲基化。指示基因启动子甲基化的MeDIP-PCR分析。IP、MeDIP；在中，输入。UBE2B型和H19型ASC和BMMSC中的ICR甲基化状态如所示图1E.公司。

这些结果共同表明，ASC、BMMSC和MPC之间的启动子甲基化特征相似但不相同，突出了这些间充质祖细胞之间的内在表观遗传特性。这些基因中的大多数在HPC中也被过甲基化，HPC中还包含一组额外的过甲基化基因。

间充质和非间充质祖细胞中早期发育调控基因甲基化

为了解决MeDIP-chip揭示的高甲基化基因的生物学意义，我们确定了这些基因中丰富的GO术语(图3B和补充表S3）。有趣的是，MSCs中的基因整体上高度甲基化，丰富了与早期胎儿发育相关的信号和发育功能。HPC中高甲基化的基因富含与感觉相关的信号功能，而MSC和HPC中的高甲基化基因除了信号、转录调节和代谢功能外，还与生殖过程相关(图3B） ●●●●。这一发现证实了MeDIP-chip之前使用类似启动子阵列显示的种系和体细胞的差异表观遗传编程(韦伯等。, 2007). 因此，GO分析表明，超甲基化针对的是在这里研究的祖细胞阶段被禁用的发育功能，以及晚期分化相关功能。

上述确定的早期发育基因的随机选择子集在NPC和KPC中也表现为高甲基化(图3C） 表明这些基因的超甲基化可能发生在中胚层和外胚层起源的前体中。尽管如此，在检查的基因中(待定3,ALX4型、和PAX5型)在NPC和/或KPC中被低甲基化（但正如我们的MeDIP-chip数据所预期的那样，在ASC和BMMSC中被高甲基化）(图3C） 这一模式可能与它们在神经发生和角质形成细胞功能中的作用有关(阿斯布雷克等。, 2002；诺哈尼等。, 2006；皮莱等。, 2007).

分化部分解决了间充质祖细胞常见的启动子甲基化模式

MeDIP-chip和亚硫酸氢盐测序数据表明，小鼠ES细胞体外分化为神经元前体细胞，随后分化为神经元，伴随着显著的少量甲基化变化，其中大多数发生在分化的第一步(迈斯纳等。, 2008；莫恩等。, 2008). 这预示着，至少在这个体外模型中，分化细胞的甲基化模式将在祖细胞阶段建立。为了解决初级祖细胞的这一问题，在体外将ASC分化为脂肪细胞，并将MPC分化为多核心肌细胞。通过脂肪细胞中油红O阳性脂质内含物的形成来评估分化(图4A） ，形成多核心肌细胞(图4A） 以及在微阵列表达分析中上调谱系特异性基因（补充表S4）。

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图4。

MSC分化部分解决启动子甲基化情况。（A） ASC体外分化为脂肪细胞（油红-O染色）和MPC体外分化为多核心肌细胞（血红染色）。棒材，100μm。（B） ASC或MPC中甲基化强度MaxTen值与差异对应物（ASCad和MPCmd）的二维散点图。绘制了两个MeDIP复制品的平均值。数据点被着色以表示根据峰值调用进行分类，以显示分化细胞（绿色）、未分化细胞（紫色）和两者共同的高甲基化启动子（蓝色）。ASCad，脂肪分化ASCs；MPCmd，肌原分化型MPC。（C） ASC和MPC脂肪和肌源性分化后低甲基化和高甲基化启动子的百分比。未分化与分化ASC和MPCs中的高甲基化启动子文氏图（D）以及分化ASC与MPCs之间的文氏图。

分化后启动子甲基化改变区分脂肪细胞与ASC和心肌细胞与MPC(图4B） ●●●●。然而，未分化细胞中的大多数（～80%）高甲基化启动子仍处于高甲基化状态(图4C） 这表明分化细胞中的甲基化状态主要建立在祖细胞阶段。此外，脂肪细胞中29%的甲基化启动子在ASC分化后被高甲基化，而ASC中15%的甲基化发起子被低甲基化(图4、C和D）。MPC分化后进行了类似的观察(图4、C和D）。因此，ASC和MPC分化伴随着甲基化改变，导致分化细胞中高甲基化启动子的数量增加（p<10⁻⁴; 带Yates修正的chi-square检验）。

这些数据与细胞分化时DNA甲基化增强的转录限制一致。为了解决这些甲基化变化的谱系特异性，我们交叉检查了脂肪细胞和肌细胞中甲基化的基因。分化后20%的基因高度甲基化在这两种细胞类型中都是常见的(图4E） ●●●●。这些基因的一个子集与代谢中的刺激依赖性变化有关，与分化诱导一致（补充图S4）。然而，80%的高甲基化基因是细胞类型特异性的(图4E） ●●●●。GO项富集分析表明，这些参与脂肪细胞核组装、核-细胞质转运和G蛋白信号的调控（与成熟脂肪细胞形成过程中发生的核重组的完成一致），以及肌细胞的细胞内-细胞相互作用和细胞外和感觉感知功能（补充图S4和补充表S5）。与ASC和MPC相比，脂肪细胞和心肌细胞之间的高甲基化基因重叠减少，反映了两种分化细胞类型之间的表观遗传差异大于其各自未分化细胞类型。

启动子甲基化与分化过程中基因表达的关系

接下来，我们确定了启动子甲基化中分化诱导的变化反映转录变化的程度。我们首先通过定义存在（表达）、边缘（弱表达）和缺失（未表达）细胞，使用Illumina表达阵列评估ASC、BMMSC和MPC中表达基因的比例。在每种细胞类型中，54-57%的高甲基化基因被检测为表达或弱表达。无论甲基化状态如何，这些百分比与在这些细胞类型中检测到的RefSeq基因表达比例相似（补充图S5）。因此，启动子甲基化与转录活性兼容（另请参见韦伯等。, 2007).

接下来，我们确定了与分化导致的启动子低甲基化或高甲基化相关的转录状态。在脂肪分化后，我们发现702个基因过度表达或诱导（补充表S4），其中645个包含在Nimblegen平台上。其中102例（16%）在未分化的ASC中发生过甲基化。在这些甲基化的基因中，15个被去甲基化，而87个保持甲基化状态。MPC肌源性分化后，444个基因被过度表达或诱导（补充表S4），其中417个被Nimblegen平台覆盖。其中49例（12%）在未分化的MPC中高甲基化。在这些甲基化的基因中，13个被去甲基化，而36个保持甲基化状态。这些结果表明，MSC分化后上调的大多数基因在未分化细胞中是DNA低甲基化的。此外，在高甲基化基因中，只有四分之一或更少的基因发生甲基化变化。

启动子甲基化富集图谱区分表达基因和非表达基因的启动子

接下来，我们研究了ASC、BMMSC和MPC中表达与非表达基因相对于TSS的不同区域是否发生甲基化。为此，我们通过计算所有高甲基化启动子的后基因图谱来确定平均甲基化。这些特征对于转录活性和非活性启动子是不同的(图5A和补充图S6）。在所有细胞类型中，表达基因的启动子甲基化富集幅度大于非表达基因（威尔士两个样本的p值t吨ASCs甲基化强度振幅测试：p<2.2×10⁻¹⁶; 骨髓间充质干细胞：p=1.34×10⁻¹⁴; 和MPCs：p=3.04×10⁻³)活性启动子的富集作用更强，但急剧下降至基因组平均值或TSS的立即5′以下。相反，在非活性启动子上，最大富集度较低，但通过增加500-1500个碱基对来更广泛地传播，以包括TSS，这是由半最大富集度时宽度的延伸决定的(图5、A和B以及补充图S6）。这些数据表明，甲基化覆盖情况区分了表达基因和非表达基因的启动子。然而，在表达和抑制的基因中，TSS处甲基化CpG的密度均低于上游，这证实了最近的基因组级亚硫酸氢盐测序数据(李斯特等。, 2009).

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图5。

表达基因与非表达基因启动子上不同的DNA甲基化富集谱。（A） ASC中表达和抑制基因的高甲基化启动子上平均DNA甲基化富集的元基因分析。（B） 表达基因和非表达基因启动子甲基化的碱基对覆盖率，显示为根据后基因图谱计算的半最大富集强度的宽度。还显示了每种细胞类型的表达基因和非表达基因在半最大富集强度下的宽度差异（右3列）。

甲基化优先针对中、低CpG含量启动子

启动子DNA甲基化和基因活性之间的关系已被证明取决于CpG含量(韦伯等。, 2007). 因此，我们询问在祖细胞平铺区域检测到的甲基化富集是否受启动子CpG含量的影响。先前基于CpG密度对人RefSeq启动子进行的分类揭示了观察到的/预期的CpG比率的双峰分布，确定了高（HCP）、中（ICP）和低（LCP）CpG启动子(韦伯等。, 2007). 我们应用了韦伯等。(2007)到阵列上代表的所有RefSeq启动子的平铺区域（相对于TSS为-2.5到+0.5 kb），我们鉴定出11511个HCP、3173个ICP和3246个LCP；这些数字与韦伯等。(2007).

在所有检测的细胞类型中，相对于基因组中ICP的比例，CpG甲基化针对的ICP比例更高(图6A；p<10⁻⁴; chi-square检验（Yates校正），以HCP为代价，HCP在甲基化启动子中的比例降低（p<10⁻³到10⁻⁴). 甲基化并不优先针对LCP，但甲基化LCP富集的造血祖细胞除外（p=0.0005）。因此，与CpG启动子在基因组中的比例相比，CpG甲基化针对的是较高比例的中低CpG基因启动子，这与增强CpG岛对甲基化的保护一致(韦伯等。, 2007；爱尔兰语等。, 2009；史陶斯曼等。, 2009).

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图6。

启动子CpG含量不同地影响甲基化靶向和甲基化诱导反应。（A） ASC、BMMSC、MPC、HCP中高甲基化基因中LCP、ICP和HCP的比例，以及所有人类RefSeq基因中的比例。分析中包含的基因数量显示在顶部**相对于RefSeq数据集，p≤0.0005。（B） 脂肪（左）和肌（右）分化后作为启动子CpG类功能的启动子甲基化的进化。“All”是指在图4D.**p≤0.0003，*p=0.033，和（*）p=0.077，相对于All数据集。

分化诱导的甲基化变化显著影响高和低CpG含量启动子

在确定甲基化对具有不同CpG含量的启动子有不同影响后，我们确定了脂肪或肌源性分化后甲基化改变的性质（低甲基化或高甲基化）在启动子类别之间是否存在差异。为此，甲基化变化在图4对HCP、ICP和LCP的D进行重新分析。图6B表明，在ASC中，相对于低甲基化基因的总数，HCP中富含低甲基化的基因（p=0.0003；Fisher精确检验），而ICP的损失为（p<10⁻⁴)和LCP（p=0.033）。此外，LCP中的高甲基化基因丰富（p=0.0004），而HCP和ICP没有受到影响（p>0.5）。在MPC中，我们还检测到HCP中的低甲基化基因富集趋势（p=0.077）和LCP中的高甲基化基因（p=0.05），而HCP和ICP没有显著影响(图6B） ●●●●。我们得出的结论是，分化引起的低甲基化主要影响甲基化的HCP，而高甲基化优先影响LCP。

谱系特异性启动子的甲基化状态不是分化能力的决定因素

我们之前的亚硫酸氢盐测序结果表明，基于少数谱系特异性启动子的甲基化状态，MSC分化能力无法预测(瑟伦森等。, 2009). 利用我们的MeDIP-chip数据，我们将ASC、BMMSC、MPC和HPC的分析扩展到200个与分化为中胚层、内胚层和外胚层谱系相关的谱系捕食基因（包括50个HCP和150个非HCP）（补充表S6）。其中包括107个最近报道在骨髓间充质干细胞中至少在某种水平上表达的谱系捕食基因(德洛姆等。, 2009). 我们在至少一种细胞类型中检测到57个高甲基化启动子（28.5%），其中8个（4%）在所有细胞类型中都是高甲基化的。对于给定的细胞类型，这些启动子的甲基化在任何特定的发育谱系中都没有发生，我们也没有观察到细胞（包括HPC）之间的高甲基化启动子比例有任何显著差异。事实上，大多数指定中胚层（成脂、成骨、成软骨、成肌和血管）、内胚层（胰腺、肝脏）和外胚层（神经、皮肤）分化的启动子没有过甲基化（补充图S7和补充表S6）。这些发现证实了甲基化状态与MSCs分化能力之间缺乏相关性。

ASCs中的DNA甲基化启动子大多在H3K4、H3K9或H3K27上未三甲基化

启动子DNA甲基化和MSC分化能力之间缺乏直接关系，这促使人们对启动子的额外表观遗传状态进行了质疑。我们用ChIP-on-ChIP检测了ASC中组蛋白H3（H3K4me3）的三甲基化赖氨酸4的启动子富集谱，这是一种转录许可修饰；H3K27me3，一个多囊介导的转录抑制标记；和H3K9me3，与受抑制启动子相关的异染色质标记(库扎里德斯，2007年).

我们发现3362个启动子富含H3K4me3，2321个启动子富集H3K27me3(图7A） ●●●●。GO项富集分析表明，H3K4me3标记基因与转录调控、大分子合成和代谢过程相关，而H3K27me3标记的基因在发育、分化和信号传递功能方面显著富集(图7B和补充表S7）。此外，25%的H3K4me3启动子在H3K27me3中共富集(图7（A和C），这些修饰的平均富集谱基本重叠，而启动子只含有这两个标记(图7D） ●●●●。虽然我们没有正式证据证明这些修饰与单个启动子共占，但后基因图谱与之前的序列ChIP结果(没有等。, 2009)暗示他们可能会。富含H3K4/K27me3基因的GO术语与转录调控、发育、分化和细胞粘附有关(图7B和补充表S7）。这些功能群与ESCs中H3K4/K27me3“二价”基因的功能群相似(伯恩斯坦等。, 2006；平移等。, 2007；赵等。, 2007)，在造血祖细胞中(崔等。, 2009)在胚胎中(达尔等。, 2010). 这些发现扩展了H3K4/K27me3共富集标记干细胞和祖细胞中发育重要启动子的概念。

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图7。

ASC中启动子DNA甲基化和翻译后组蛋白修饰之间的关系。（A） DNA甲基化、H3K4me3-、H3K27me3-和H3K9me3-富集启动子的文氏图分析。（B） GO术语富集基因，启动子富集于H3K4me3、H3K27me3或两个标记中。（C） 甲基化DNA和/或修饰组蛋白的指示组合中共同富集的启动子比例。（D） 显示组蛋白修饰的平均富集剖面的转基因分析。（E） 10号染色体上示例基因座的差异DNA甲基化和组蛋白修饰富集谱。

接下来，我们检查了与DNA甲基化启动子相关的组蛋白修饰（例如图7E） ●●●●。我们发现，在DNA甲基化启动子中，22%富集于H3K4me3，17%富集于H2K27me3，<7%在H3K9上三甲基化(图7、A和C）。在所有改良的RefSeq启动子中，这些比例明显低于富含H3K4me3-、H3K27me3-和H3K9me3-的启动子的比例（分别为37%、24%和17%；数据未显示；p<0.001；经Yates校正的纸方检验）。因此，DNA甲基化和H3K4、K9或K27三甲基化似乎至少在所检测的启动子区域中是完全排斥的。H3K4/K27me3共富集主要发生在弱甲基化或非甲基化启动子上(图7C） ，这一结构让人想起ES细胞中发育调节的二价启动子的DNA低甲基化状态(福斯等。, 2008；莫恩等。, 2008).

尽管如此，发现不可忽略比例的DNA甲基化启动子富含H3K4me3或H3K27me3(图7、A和C）。这些基因与转录调控、代谢和合成过程（H3K4me3）、早期发育和分化（H3K27me3）或转录和分化（H3K4/K27me3。这些功能类别类似于仅由H3K4或H3K27甲基化定义的功能类别（补充表S7），并且不受DNA甲基化状态的影响。此外，我们发现大多数（80到>90%）富含H3K27me3或H3K9me3的基因没有表达，而60%的H3K4me3基因表达（数据未显示）。这些百分比在DNA甲基化基因和所有带有这些标记的RefSeq基因中相似（数据未显示）；因此，DNA甲基化不会对含有任何组蛋白修饰的启动子产生额外的抑制作用。

我们感谢Jan Brinchmann博士（挪威奥斯陆奥斯陆大学医院）慷慨赠送的HPCs和BMMSC，感谢Joel Glover博士（挪威奥斯陆奥斯陆大学）赠送的神经元前体，感谢Pritinder Kaur博士（澳大利亚墨尔本PeterMac Callum癌症中心）赠送的角质形成细胞祖细胞。我们感谢Kristin Vekterud提供的专家技术援助。这项工作得到了挪威研究委员会的支持，并获得了奥斯陆大学（给B.M.J.）的博士学位。