循环和肝脏非经典CD14升高的功能贡献⁺CD16型⁺单核细胞与炎症和肝纤维化

肝内CD16⁺巨噬细胞在肝纤维化过程中主要增加

众所周知，巨噬细胞数量在慢性肝损伤和纤维化过程中增加[4]但肝内单核细胞衍生细胞的表型仍不明确。因此，我们测试了CD14⁺CD16型⁻和CD14⁺CD16型⁺肝内也存在单核细胞/巨噬细胞亚群。事实上，传统组织学已经确定肝硬化与正常肝脏的门脉区存在单核浸润(图3A)建立CD14和CD16的免疫组化联合染色，对肝内单核细胞/巨噬细胞进行分类(图3B). 我们观察到CD14显著增加⁺CD16型⁺肝硬化中的细胞（与F2-F3纤维化相比p=0.02，与F0-F1相比p=0.001），约占肝硬化肝内单核细胞/巨噬细胞总数的50%，但仅占非肝硬化肝脏的约10%，这主要解释了肝硬化中肝巨噬细胞总数增加的原因(图3C). 当将早期纤维化（由盲法病理学家对F0和F1进行评分）与进展性（F2-F3）和肝硬化（F4）疾病进行比较时，发现了类似的趋势(图3D).

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图3

肝内CD16⁺巨噬细胞在肝纤维化过程中主要增加。

（A） 来自正常肝脏（上图）和肝硬化（下图）的活检的代表性例子显示纤维化门周区域的单核炎症浸润（左：H&E染色，右：Ladewig染色，其中胶原染色为蓝色）。（B） CD14（红色）和CD16（绿色）的免疫荧光共染色可识别CD14⁺CD16型⁻和CD14⁺CD16型⁺人肝组织中的巨噬细胞（蓝色：细胞核用DAPI复染）。粗体箭头，CD14⁺CD16型⁻巨噬细胞；细箭头，CD14⁺CD16型⁺巨噬细胞。（C+D）CD14的半定量分析⁺CD16型⁻，CD14⁺CD16型⁺和总CD14⁺肝内细胞*p<0.05，**p<0.001。

我们接下来的目的是进一步描述这些肝内巨噬细胞亚群，并建立肝内和外周血单核细胞/巨噬细胞亚群之间的关系。与外周血不同(图2A)，从新获得的肝活检（n>30）中进行的FACS分析显示存在三个CD14⁺肝内单核细胞/巨噬细胞群(图4A)可以定义为CD14高表达细胞（CD14^你好CD16型⁻)、CD14低表达细胞和CD14/CD16双阳性巨噬细胞（CD14⁺CD16型⁺). CD14的特征^你好CD16型⁻肝细胞表达低HLA-DR和低DC-SIGN（CD209），与外周血CD14相似⁺CD16型⁻单核细胞。相反，肝内CD14⁺CD16型⁺细胞表达高HLA-DR和一些DC-SIGN（CD209），与外周血CD14相似⁺CD16型⁺单核细胞(图4A). 此外，我们发现CD14^洛CD16、HLA-DR和DC-SIGN均为阴性的细胞，因此可能代表静止的肝巨噬细胞（典型的库普弗细胞）。

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图4

肝内巨噬细胞由反映血单核细胞亚群的不同亚群组成。

（A） 根据30例以上新鲜肝活检，对肝内单核细胞/巨噬细胞进行FACS分析。将显示代表性绘图。在CD45中⁺肝内白细胞，三种不同的肝内CD14群体⁺巨噬细胞可以根据CD14和CD16的表达来区分，这两种表达在HLA-DR和DC-SIGN上也有显著差异。（B） 比较同一患者血液CD14中单核细胞/巨噬细胞活化和分化标记物的表达水平⁺CD16型⁻单核细胞（虚线）和肝脏CD14^你好CD16型⁻巨噬细胞（深灰色）和CD14⁺CD16型⁺单核细胞（虚线）和肝脏CD14⁺CD16型⁺巨噬细胞（浅灰色）；显示了F0纤维化（无纤维化，上面板）和F3纤维化（晚期纤维化，下面板）患者的代表性分析。同位素对照，黑线。在肝脏活检时抽血，同时用相同的FACS设置进行血液/肝脏样本检测。

为了进一步证实这些观察结果，在典型患者中，直接将肝内巨噬细胞亚群与外周血单核细胞亚群进行比较。尽管肝内CD14之间存在主要相似性⁺CD16型⁺和循环CD14⁺CD16型⁺细胞，肝内CD16⁺与血液中的巨噬细胞相比，巨噬细胞显示出上调的HLA-DR、DC-SIGN和（适度）CD56表达(图4B)从而表明该巨噬细胞群的肝内成熟。CD14^你好CD16型⁻另一方面，细胞表达与循环CD14相似水平的HLA-DR⁺CD16型⁻单核细胞，但差异在于显示较高水平的分化标记物DC-SIGN和CD56(图4B). 有趣的是，CD14上的HLA-DR表达似乎下调⁺CD16型⁺与早期或无纤维化患者相比，晚期纤维化患者的肝内巨噬细胞，而DC-SIGN上调，进一步表明晚期纤维化患者巨噬细胞亚群处于激活（促炎症）状态(图4B).

慢性肝病患者单核细胞相关趋化因子通路的激活

我们的数据显示CD16的显著积累⁺肝纤维化过程中的单核细胞，促使我们研究可能的趋化因子途径，这些途径在CLD中被激活，并可能介导单核细胞亚群浸润。在实验小鼠模型中，单核细胞亚群上差异表达的趋化因子受体CCR2、CCR1或CCR5与肝纤维化进展有关[6],[8],[11]在人类中，CCR2主要在CD14上表达⁺CD16型⁻单核细胞，而CD14⁺CD16型⁺单核细胞表面表达较高水平的CCR5；CCR1在两个亚群中均有表达，CD14中的水平较高⁺CD16型⁻单核细胞[13],[19],[20]肝纤维化不同阶段全肝组织的基因表达分析显示肝内明显上调趋化因子受体-2（F0-1与F4纤维化相比，p=0.021），趋化因子受体-5（F0-1与F4纤维化相比，p<0.0001）和立方厘米1（F0-1与F4纤维化相比，p=0.0008）(图5A)这与观察到的纤维化/肝硬化肝中单核细胞的积聚情况很吻合(图3). 不仅单核细胞/巨噬细胞，而且其他免疫细胞亚群或非实质性肝细胞也可能表达这些趋化因子受体[2]，我们对活检和手术切除后新鲜肝脏样本进行了FACS分析。CCR2表达主要见于肝单核细胞/巨噬细胞（定义为CD14⁺细胞）和（低水平）肝内NKT细胞，但非NK或T细胞(图5B). 几乎所有CD14都高水平表达CCR1⁺细胞，也可通过T、NK和NKT细胞亚群(图5B). CCR5主要在T细胞和NK和NKT细胞亚群上表达，但肝单核细胞/巨噬细胞也在不同水平上表达CCR5(图5B).

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图5

慢性肝病中单核细胞相关趋化因子途径和单核细胞趋化因子受体的激活。

（A） 趋化因子受体的肝内基因表达水平。（B） 通过FACS评估单核细胞/巨噬细胞（CD14）上CCR2、CCR1和CCR5的表达⁺，绿色），T-（CD3⁺CD56型⁻，浅橙色），NK-（CD3⁻CD56型⁺，深橙色）和NKT细胞（CD3⁺CD56型⁺，红色）来自新鲜分离的肝组织。显示了具有代表性的直方图，同型控制为灰色。（C） 肝内趋化因子基因表达水平。（D） 慢性肝病患者和健康对照者的单核细胞相关趋化因子血清浓度。缩写为：HC，健康对照；慢性肝病；NC，无肝硬化；CIR、肝硬化*p<0.05，**p<0.001。

趋化因子在肝脏的mRNA表达ccl2（F0-1与F4纤维化相比，p=0.0088）和ccl5号机组（F0-1与F4纤维化相比，p<0.0001），但不是立方厘米，在纤维化中显著上调(图5C). 此外，在CLD患者中，CCR1/CCR5配体MIP1α（CCL3）和MIP1β（CCL4）的血清浓度显著增加，而CCR2配体MCP-1（CCL2）的血清浓度没有显著增加(图5D)表明这些趋化因子具有额外的全身作用。

考虑到肝单核细胞/巨噬细胞表达CCR2、CCR1和CCR5ccl2和ccl5型在整个肝脏和CCL3（健康对照组与CLD患者相比，p=0.0387）和CCL4（健康对照与CLD病人相比，p=0.0064），我们推测患者外周血单核细胞可能调节其趋化因子受体的表达，使其更容易在病变肝脏中积聚。因此，我们使用CD14-微球通过MACS方法从患者（n=113）和健康对照（n=32）中分离出纯度大于95%（未显示）的循环单核细胞。单细胞的立方厘米1（与慢性阻塞性肺病患者相比，健康对照组p=0.031），但不是趋化因子受体-2或趋化因子受体-5，患者外周血单核细胞表达增加(图6A)可能是因为血清CCL3和CCL4水平升高。就单核细胞亚群而言，CCR2主要在CD14上表达⁺CD16型⁻单核细胞(图6B). 在蛋白质水平上，CD14上CCR2表面表达适度下调⁺CD16型⁻与健康对照组相比，患者的单核细胞，但CD14上没有⁺CD16型⁺单元格(图6B). 肝脏内，CD14^你好CD16型⁻巨噬细胞表达CCR2的水平与循环CD14相似（高）⁺CD16型⁻单核细胞；肝CD14⁺CD16型⁺相反，巨噬细胞的水平低于CD14^你好CD16型⁻巨噬细胞，但CCR2表达高于血液CD14⁺CD16型⁺单核细胞，表明CD14⁺CD16型⁺肝内CCR2亚群上调（未显示详细数据）。这些结果共同表明，靶向CCR2和CCR1/CCR5的单核细胞相关趋化因子在CLD患者的肝内外室上调。

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图6

慢性肝病患者循环单核细胞趋化因子受体的调节。

（A） CD14微球纯化循环单核细胞后，实时PCR检测单核细胞趋化因子受体基因表达。（B） FACS检测血单核细胞亚群CCR2表达（MFI，平均荧光强度）。缩写为：HC，健康对照；慢性肝病；NC，无肝硬化；CIR，肝硬化。显示了具有代表性的直方图，比较了两个单核细胞亚群之间以及健康对照组和CLD患者外周血中两个单细胞亚群的CCR2表达水平*p<0.05，**p<0.001。

肝硬化患者单核细胞的功能及单核细胞亚群分泌细胞因子和趋化因子的差异

尽管我们一直在CLD患者中发现更多的循环单核细胞，并且与疾病进展密切相关(图1,表2)目前尚不清楚这些单核细胞是否具有完全的功能活性。此前曾有人推测，肝硬化患者的单核细胞活化可能受损，导致这些患者出现所谓的“免疫麻痹”[21],[22]因此，我们在补充自体血清的培养基中培养了晚期肝硬化患者（Child B/C，n=16）和匹配的健康对照组（n=20）的分离循环单核细胞，并评估了LPS刺激后促炎细胞因子和趋化因子的分泌。健康志愿者的单核细胞在LPS刺激下分泌大量促炎细胞因子（TNFα，IL6，IL1β）和趋化因子（MCP-1，MIP1α，MIP1-β）(图7A–B). LPS对趋化因子MIG的诱导作用不明显。从晚期肝硬化患者分离的单核细胞在基线检查或LPS刺激后分析的任何细胞因子或趋化因子方面没有差异(图7A–B)这表明CLD患者的循环单核细胞保持了其分泌促炎或抗炎介质的总体正常能力。

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图7

单核细胞在肝硬化中功能活跃，单核细胞亚群释放不同的细胞因子/趋化因子。

（A+B）单核细胞衍生巨噬细胞（培养2天）在无刺激（A）和用1 mg/ml LPS刺激后释放细胞因子/趋化因子（B）。（C） 无刺激培养5天后纯化单核细胞亚群的细胞因子/趋化因子释放*p<0.05，**p<0.001。

鉴于CD14在肝内的明显优先蓄积⁺CD16型⁺肝硬化中的单核细胞(图3)下一步，我们旨在确定该亚群在慢性肝脏炎症和纤维化发病机制中的可能功能。CD14号机组⁺CD16型⁻和CD14⁺CD16型⁺采用MACS方法分离单核细胞，在无额外刺激的情况下培养5天后测量细胞因子/趋化因子分泌。出于道德考虑（子集分离所需的大血容量），并基于刺激时单核细胞总分泌的相同细胞因子(图7A–B)，单核细胞亚群仅从健康志愿者中分离。引人注目的是，CD14⁺CD16型⁺单核细胞是TNFα、IL6（CD14）的主要产生者⁺CD16型⁺与CD14相比⁺CD16型⁻，p=0.038），干扰素γ（CD14⁺CD16型⁺与CD14相比⁺CD16型⁻，p=0.0242），MIP1α（CD14⁺CD16型⁺与CD14相比⁺CD16型⁻，p=0.0011）和MIP1β(图7C)表明它们主要通过释放促炎细胞因子和趋化因子来维持炎症过程。循环CD14之间的相关性证实了这一结论⁺CD16型⁺CLD患者的单核细胞计数和促炎性血清细胞因子水平（如TNFα、MIP1β）(表2).

CD14号机组⁺CD16型⁻另一方面，单核细胞是MCP-1（CD14）的主要产生者⁺CD16型⁺与CD14相比⁺CD16型⁻，p=0.0068），与MCP-1通过CCR2自分泌结合刺激MCP-1表达的观察结果一致[23]此外，CD14⁺CD16型⁻，但不是CD14⁺CD16型⁺单核细胞能够产生抗炎细胞因子IL10(图7C). 总的来说，这些数据意味着CD14⁺CD16型⁺积聚在纤维化/肝硬化肝脏中的单核细胞是促炎介质的重要来源，从而使肝脏的慢性炎症持续存在。

循环单核细胞亚群和肝内巨噬细胞的FACS分析

早上通过静脉穿刺从所有患者和对照组的EDTA分离管中采集新鲜血液样本，并使用LSM-1077（PAA，Pasching，Austria）和标准方案，通过Ficoll密度梯度立即应用于PBMC分离[13]在阻断非特异性结合后，使用以下单克隆抗体和适当的同型对照：CD14、CD16、CD56、HLA-DR、CD3、CD4、CD8、CD56，CD209/DC-SIGN、CD19和CD45（均为BD，德国海德堡）；CCR2、CCR1、CCR5（研发系统，明尼阿波利斯，明尼苏达州）。流式细胞术分析在FACS-Conto-II（BD）上进行，数据通过FlowJo软件（TreeStar，Ashland，OR）进行分析。为了排除FACS分析中细胞分离程序的差异对细胞计数的影响，使用FACS和不含PMN分数的自动白细胞计数的相对值计算循环细胞的绝对数。通过测定平均荧光强度减去相应的同型对照（“MFI-MFI_同型’). 为了对肝内单核细胞进行流式细胞术表征，在PBS中切碎一小块新鲜的肝活检柱，并在37°C下用IV型胶原酶（新泽西州莱克伍德市沃辛顿）消化30分钟，然后进行FACS染色[6].

单核细胞分离、RNA分离和基因表达分析

通过密度梯度分离PBMC后，使用CD14-微球和MACS分离技术纯化单核细胞总数（Miltenyi，Bergisch-Gladbach，德国）。FACS分析证实纯度>95%。通过pegGOLD（德国埃朗根peqLab）从纯化的血液单核细胞中分离出RNA，并从1µg RNA中生成互补DNA（德国曼海姆罗氏）。使用SYBR Green试剂（Invitrogen，Karlsruhe，德国）进行定量实时PCR。β-actin值用于使基因表达正常化。基因表达可以通过折叠诱导或任意相对表达来表达[14]可根据要求提供底漆序列。类似地进行来自肝组织的RNA和基因表达分析、细胞培养和共培养实验。

肝内单核细胞亚群的免疫荧光分析

在脱蜡和复水后，将载玻片在柠檬酸盐缓冲液中煮沸，并使用封闭溶液（加利福尼亚州伯林盖姆Vector Labs）。用二级抗兔Cy-3和抗鼠-FITC抗体（宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson ImmunoResearch）检测兔抗人CD14抗体（HPA001887；Sigma）、小鼠抗人CD16抗体（克隆2H7；MBL）或适当的同种对照抗体（加利福尼亚州圣克鲁斯Santa Cruz Biotechnology）。用DAPI（Vectashield，Vector Labs）对细胞核进行复染。然后用荧光显微镜对载玻片进行分析（德国耶拿蔡司）。每张幻灯片随机选择10个明亮区域进行定量分析。研究人员对纤维化阶段或实验数据一无所知。

体外单核细胞刺激

PBMC经密度梯度分离后，1×10⁶细胞/ml在含有1%青霉素-链霉素（PAA）和1.5%自体血清的2ml RPMI（Invitrogen）中溶解，并在培养皿中粘附35分钟。丢弃非粘附细胞。然后将细胞在2ml RPMI（5%自体血清，1%青霉素-链霉素）中培养24小时，然后用1mg/ml LPS（Sigma，Hamburg，Germany）刺激并额外孵育24小时。

人单核细胞亚群的细胞因子/趋化因子表达体外

用密度梯度法分离了三个不同健康献血者的PBMC。CD14号机组⁺CD16型⁻和CD14⁺CD16型⁺使用“单核细胞分离-Kit-II”和“CD16”通过MACS方法选择性纯化单核细胞⁺-“单核细胞-隔离-试剂盒”（Miltenyi）。在用抗CD14微球去除单核细胞后，从PBMC中分离出作为对照细胞的淋巴细胞。FACS分析证实纯度>90%。细胞在含有10%BSA和1%青霉素-链霉素（PAA）的RPMI中培养5天。

细胞因子和趋化因子检测

使用FlowCytomix（奥地利Bender Medsystems，维也纳）测量人血清或培养基上清液中细胞因子/趋化因子的释放。在50µL样品体积下重复进行测量。根据制造商的说明，通过细胞计数珠试验（BD）评估MCP-1、MIP1α和MIP1β的血清浓度。

单核细胞亚群与原代人星状细胞共培养

人类肝组织取自因结直肠癌转移性肝肿瘤而接受部分肝切除术的患者。在患者知情同意的情况下，根据当地伦理委员会的指导方针进行实验程序。如前所述，使用EGTA/胶原酶灌注和蛋白酶培养分离原发性人类HSC[35],[36]用阿拉伯半乳糖梯度超速离心法从其他非实质性肝细胞中分离出HSC，得到纯度大于90%且活的HSC。8×10⁴将HSC接种在无涂层的塑料皿上，并在添加10%FCS和100 IU/ml青霉素-链霉素的DMEM中培养。在培养的前4天每天更换培养基，然后每隔一天更换一次[37].

将三个不同健康供体的单核细胞合并，并如上所述分离单核细胞亚群。在预培养7天后，原代人HSC与CD14共培养5天⁺CD16型⁻，CD14⁺CD16型⁺或淋巴细胞（每个8×10⁵电池/板）。作为阳性对照，用5 ng/mL重组人TGFβ（R&D系统）刺激HSC。第1A列和学报2仅在HSC中表达（不在PMBC、单核细胞/巨噬细胞或淋巴细胞中表达），并且列1A，但不是学报2通过重组TGFβ在HSC中诱导。因此，列1AmRNA标准化为行动2表达，以便能够评估混合细胞群培养中HSC的激活。在一些共培养检测中，使用2 ng/ml多克隆抗人TGFβ-Ab（sc-146；Santa Cruz）[6].

作者感谢Aline Müller女士提供了出色的技术援助。