简介
酪氨酸激酶促进细胞生长、存活和增殖，是肿瘤中常见致癌突变的靶点1,2八种酪氨酸激酶抑制剂已被批准用于临床，还有几十种处于后期开发阶段。作为其信号功能的关键部分，大多数酪氨酸激酶激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-K）家族的脂质激酶三PI3-K家族成员包括p110α，这是人类癌症中最常见的突变激酶4,5mTOR是细胞生长的中央调节器三此外，脂质磷酸酶PTEN是一种常见的灭活肿瘤抑制因子6这些观察结果激发了人们对PI3-K抑制剂治疗潜力的兴趣，第一批此类分子最近进入了临床试验7,8PI3-K和酪氨酸激酶共同定义了一组相互关联的癌基因，这些癌基因是密集药物研发工作的重点。
我们询问是否有可能发现能够有效抑制酪氨酸激酶和PI3-K的分子。这是由两条推理路线推动的。首先，PI3-K信号的重新激活是对酪氨酸激酶抑制剂耐药的常见机制9–12临床前研究表明，将这两个家族的抑制剂结合使用是有效的13–16因此，靶向酪氨酸激酶和PI3-K的分子可能具有强大的抗肿瘤活性。
其次，我们试图确定可能指导发现靶向这两个癌基因家族的分子的化学原理。虽然有许多多靶点激酶抑制剂的例子，但这些药物的靶点并不是随机分布在整个激酶组中2,17–19针对某些激酶组合而非其他激酶组合的药物往往会被反复发现。相反，根据靶点的生物功能合理设计滥交药物是可取的，但对于结构不同的蛋白质，这在多大程度上可以实现尚不清楚20.
蛋白激酶和PI3-K在进化早期就发生了分化21因此缺乏显著的序列相似性(). 尽管如此，这两个酶家族共享几个短基序（例如，协调Mg的DFG序列2+-ATP），其激酶结构域显示类似的两叶形结构22这些酶还使用一组类似的残基来催化磷酸转移反应，尽管关键结构元素的方向和大多数残基的身份已经发生了巨大的分歧().
酪氨酸激酶和PI3-K的结构和序列比较(一)c-Src激酶结构域的主干结构与Src家族酪氨酸激酶Hck（左）、受体酪氨酸激酶VEGFR2（中）和PI3-K p110γ（右）的激酶结构域对齐。成对序列标识和主干r.m.s.d.的统计如下所示。括号中显示了用于每次比对的残留物数量。(b条)酪氨酸激酶c-Src、Hck、VEGFR2和PI3-K p110γ的激酶结构域的序列比对。与c-Src相关的保守残基被染成红色。p110γ序列通过两个叠加关键二级结构元素的蛋白质的x射线结构手动与c-Srch对齐。省略了含有残基944–1001的VEGFR2插入物。
与这些结构差异一致的是，已知蛋白激酶抑制剂和PI3-K之间的重叠有限。最近一项关于激酶抑制剂选择性的综合分析测试了37种针对p110α的有效且结构多样的蛋白激酶抑制剂，发现没有一种具有活性19; 在同一研究中，p110α抑制剂PI-103(1)对300多种蛋白激酶几乎没有活性19我们发现，临床批准的蛋白激酶抑制剂与主要靶点的结合能力是任何PI3-K的10000倍以上(补充表1在线）。尽管如此，泛特异性蛋白激酶抑制剂如staurosporine(2)和槲皮素(三)已证明在微摩尔浓度下抑制PI3-K23此外，至少有两份报告表明PI3-K抑制剂和蛋白激酶沃特曼蛋白之间存在高亲和力相互作用(4)抑制丝氨酸-苏氨酸激酶PLK124和咪唑并喹啉(5)抑制丝氨酸-苏氨酸激酶PDK125这些相互作用的结构基础尚不清楚。
我们在这里描述了系统地发现了能够有效抑制酪氨酸激酶和PI3-K的小分子。我们将这些分子的独特选择性追溯到疏水囊中的相互作用，疏水囊在两个酶类之间是保守的。我们证明了一个这样的分子，PP121(6)，通过直接抑制致癌酪氨酸激酶和PI3-Ks来阻止肿瘤细胞的增殖，并且该分子通过对这两个家族成员的过度抑制来规避常见的耐药机制。
结果
双酪氨酸激酶/PI3-K抑制剂的发现
我们筛选了一个酪氨酸激酶抑制剂库，用于对抗PI3-K p110α的活性。这个筛网产生了两个吡唑并嘧啶，S1(7)和S2(8)在低微摩尔浓度下抑制几个PI3-K(和补充表1在线）。结构-活性关系（SAR）数据揭示了PI3-K抑制所需的这些命中的关键因素。例如，用N个-甲基消除了对PI3-K的活性，表明该氨基可能作为氢键供体(). 在R2位置，甲基和异丙基，但不是t吨-丁基取代基是可以容忍的，这对该区域的取代形成了空间位阻。
吡唑并嘧啶抑制剂的生化靶选择性(一)发现双重抑制剂和IC的实验策略50针对14个酪氨酸和磷脂酰肌醇激酶（10µM ATP）测试的八个分子的值（µM）。集成电路50小于0.1µM的值被涂成红色。吡唑并嘧啶N4和N5被标记为与激酶形成氢键。(b条)本研究中的7种抑制剂（右栏）和5种参考化合物（左栏）对84种酪氨酸激酶和135种丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制百分比。PP抑制剂在1µM药物和通常10µM ATP下进行测试。来自Invitrogen SelectScreen分析的数据。(c（c）)172种吡唑并嘧啶抑制剂和8种参考化合物的目标选择性主成分分析。关键化合物已标记。
吡唑并嘧啶是酪氨酸激酶抑制的一个特征良好的核26–28我们分析了S1和S2与200多种蛋白激酶的关系(). 这些分子显示出类似于经典吡唑并嘧啶激酶抑制剂PP1的选择性模式(9；)，抑制Src家族激酶、Abl和几种受体酪氨酸激酶（例如PDGFR和Ret），但对丝氨酸-三氨酸激酶组具有高度选择性。
基于这些数据，我们试图优化S1和S2的效力和选择性。通过R1和R2取代基的多样化，迭代合成了200多个类似物(补充表1在线）。该化学的进展是通过对每种新化合物进行14种酪氨酸激酶和PI3-K的测试来指导的，监测这一广泛的SAR，以确定有利于结合两种靶类的化学特征，然后将这些特征纳入后续的类似物中(补充图1在线）。
通过这项工作，我们在这两个家族中鉴定出了具有新靶向结构的分子，以对抗激酶(). 这包括双重抑制剂，如PP121和PP487(10)在纳米摩尔浓度下抑制PI3-K（例如p110α和mTOR）和酪氨酸激酶（例如Src、Abl和VEGF受体）。我们分析了PP121和PP487对200多种蛋白激酶的作用，发现它们抑制酪氨酸激酶的模式，类似于临床批准的药物，如达沙替尼(11)和舒尼替尼(12)但对丝氨酸-三氢嘌呤激基体保持高度选择性(). 因此，这些分子能够有效地抑制酪氨酸激酶和PI3-K，而不会不加区分地针对所有激酶。
一种选择性mTOR抑制剂及其他新型靶向药物
尽管我们的目标是鉴定同时抑制酪氨酸激酶和PI3Ks的分子，但我们发现了具有不同和意想不到的选择性的化合物(). 其中一种分子是PP242(13)，有效抑制mTOR（IC50=8 nM），但对其他PI3-K家族成员的活性要低得多(). 该化合物对219种蛋白激酶的测试显示出相对于蛋白激酶组的显著选择性：浓度为其IC的100倍50对于mTOR，PP242仅抑制一个激酶90%以上（Ret），仅抑制三个激酶75%以上（PKCα、PKCβII和JAK2 V617F；和补充表2在线）。mTOR已成为一个重要的药物靶点，而PP242是已被描述的mTOR的第一个选择性和ATP竞争性抑制剂。与雷帕霉素不同，PP242靶向mTOR复合物，因此可用于探索mTORC2的信号传导。我们用PP242处理BT549细胞，发现该分子抑制Akt、mTOR底物p70S6K及其下游靶点S6的磷酸化(补充图2在线）。这些数据与Akt磷酸化中mTOR激酶活性的要求一致29，我们已经使用PP242剖析了mTOR信号（提交的手稿）。
我们惊讶于吡唑并嘧啶化学型中的结构变异可以实现靶区的多样性(). 在许多情况下，结构上的微小变化会导致选择性的显著变化。例如，DNA-PK选择性抑制剂PP162(14)而多靶向双抑制剂PP121仅在R1环中氮原子的排列上有所不同(). 相反，高选择性p110δ抑制剂PIK-294(15)包含嵌入不相关化学系列衍生结构中的吡唑并嘧啶核18(). 当PIK-294与酪氨酸激酶选择性吡唑并嘧啶（如PP20）进行比较时(16)，这两个分子跨度超过108-折叠相对靶选择性().
为了全面了解这些分子的靶选择性，我们根据IC比较了172种吡唑并嘧啶50使用主成分分析（PCA）对13个酪氨酸激酶和PI3-K的值(). 化合物在这个二维空间中的接近性提供了它们与13个激酶靶点的相似性的直观表示，我们将四个临床批准的酪氨酸激酶抑制剂（索拉非尼）作为参考化合物(17)，吉非替尼(18)、达沙替尼和舒尼替尼）和四种广泛使用的PI3-K抑制剂（沃特曼，PI-103，IC87114(19)、和PIK-90(20)). 该分析表明，大多数吡唑并嘧啶占据选择性PI3-K和酪氨酸激酶抑制剂之间的选择性空间区域()与这些化合物的靶向特征一致。相比之下，优先抑制PI3-K或酪氨酸激酶的吡唑并嘧啶，如PP20和PIK294，与对任一家族选择性的参考化合物共定位(). 这提供了这些不同类别抑制剂的目标轮廓的无偏见表示。
与p110γ结合的吡唑并嘧啶的结构
我们测定了S1和S2与p110γ结合的晶体结构，以了解这种化学型如何与PI3-K结合(). 在这些结构中，吡唑并嘧啶N4和N5氮素分别与激酶铰链残基Glu880和Val882形成氢键(). 腺嘌呤在ATP结合结构中形成类似的氢键22这些相互作用解释了SAR，表明N4处的外环胺是PI3-K的氢键供体。
与人p110γ结合的S1和S2的晶体结构(一)S1与p110γ的结合模式，从ATP结合袋入口（左）和ATP结合袋上方（右）观察。虚线表示氢键。(b条)S2与p110γ的结合方式。
S1和S2的R1芳基取代基投射到p110γ中更深的口袋中，该口袋延伸到ATP占据的区域之外。在该区域中米-S1中的苯酚与催化赖氨酸（p110γ中的Lys833）形成氢键，而S2中的2-萘基则产生广泛的疏水相互作用(). 我们之前已经证明，化学上不同的PI3-K抑制剂在这个口袋中进行相互作用，这是高亲和力结合所必需的18.
蛋白激酶而非PI3-K的守门人
我们试图了解PP121等分子如何能有效抑制酪氨酸激酶和PI3-K，但不能抑制丝氨酸-三氢嘌呤激酶。酪氨酸和丝氨酸-三氢嘌呤激酶彼此密切相关，但仅与PI3-K家族遥远相关21因此，令人惊讶的是，我们能够拓宽吡唑并嘧啶对PI3-K的选择性，而不引入对更多丝氨酸-三烯酮激酶的活性。为了解释这一点，我们寻找了PI3-K和酪氨酸激酶之间保守的结构特征，并可能被这些分子用来实现其选择性。
在蛋白激酶家族中，吡唑并嘧啶的选择性由一个被称为“守门人”的单一氨基酸的大小控制27,28大多数酪氨酸激酶在这个位置有一个小残基（苏氨酸或缬氨酸），对这些药物更敏感，而大多数丝氨酸-苏氨酸激酶有一个较大的残基（如异亮氨酸或蛋氨酸），并且不太敏感。我们针对酪氨酸激酶Src的T338I门控突变对我们小组中的化合物进行了测试，发现这种突变足以产生广泛的抑制剂耐药性(). 因此，门卫残基的大小通过阻止与大多数丝氨酸-苏氨酸激酶结合来控制这些药物的蛋白激酶选择性。
吡唑并嘧啶与酪氨酸激酶和PI3-Ks结合的结构比较(一)IC之间的相关性50针对Src（x轴）和Hck或门卫突变型Src T338I（y轴）的抑制剂值。(b条)S1相对于c-Src（顶部）和p110γ（底部）中ATP的结合方向。(c（c）)与c-Src（蛋白色红色，药物橙色：S1、PP102、PP121和PP494）和p110γ（蛋白蓝，化合物灰色：S1和S2）结合的抑制剂的共晶结构重叠。看门人残基Thr338（c-Src）和Ile879（p110γ）被突出显示。(d日)（上图）催化赖氨酸（Lys295）在活性c-Src中与Glu310形成氢键。（中心）螺旋C和Glu310在含有PP102的C-Src结构中无序。（底部）PP121与Glu310形成氢键，并在与C-Src结合时排列螺旋C。
PI3-K在结构上类似于PI3-K家族中的门卫的位置具有异亮氨酸(). 因此，吡唑并嘧啶化学型对PI3-K的有效抑制令人惊讶。我们测定了与c-Src（S1、PP121、PP102）结合的四种化合物的晶体结构(21)，PP494(22))并将其与S1和S2与p110γ结合的结构进行了比较。因为c-Src和p110γ在结构的许多方面不同()，我们首先只分析了门卫残基、ATP腺嘌呤和每个激酶活性部位内药物的相对取向。
在Src结构中，吡唑并嘧啶与ATP的腺嘌呤重叠，使药物的R1芳基取代基穿过门控（Thr338）投射到疏水口袋中(). 这与之前报道的与酪氨酸激酶结合的吡唑并嘧啶的结构一致28当我们将其与PI3-K结构进行比较时，我们注意到PI3-K（Ile879）中类似于看门人的残基相对于蛋白激酶中的对应物在垂直和水平方向上都发生了移动(). 这种结构差异伴随着药物结合模式的改变：吡唑并嘧啶核与ATP的排列发生位移，R1芳基取代基旋转90°(). 这些结构差异和复合运动的综合作用是，在PI3-K结构中，药物的R1取代基投射在守门人侧链的下方，而不是邻近侧链(). 这使得这些分子能够与PI3Ks中更深的疏水口袋进行相互作用，尽管在看门人位置存在空间要求很高的异亮氨酸。这为吡唑并嘧啶化学型抑制PI3-Ks而非丝氨酸-三氢嘌呤激酶提供了结构上的理论基础。
有效的双抑制剂靶向保守的催化残基
我们合成了许多吡唑并嘧啶，但只有少数，如PP121和PP487，能有效抑制酪氨酸激酶和PI3-K。我们分析了这些化合物和相关化合物的共晶结构，以确定可能有助于其独特双重效力的相互作用。
所有蛋白激酶都含有一种保守的谷氨酸（Src中的Glu310），该谷氨酸与催化赖氨酸（Src中的Lys295）形成氢键。这种相互作用组织了催化活性位点，并使螺旋C稳定在活性构象中(，顶部面板）。这些残基的重要性强调了它们在与蛋白激酶超家族没有序列同源性的各种激酶中的功能保守性21与蛋白激酶结合的吡唑并嘧啶的结构表明，这些药物破坏了Glu310和Lys295之间的相互作用，导致螺旋C采用无序或非活性构象(，中央面板）。然而，在与Src结合的PP121的晶体结构中，该分子与Glu310形成氢键，有效地替代了催化赖氨酸的结构作用(，底部面板）。这种相互作用对激酶的结构有显著影响，导致螺旋C的有序化和活性构象的稳定(和补充电影). 很可能，这种相互作用有助于PP121对酪氨酸激酶的更有效抑制，而PP121与紧密相关的分子（如PP102）则无法形成相同的氢键。
我们尚未获得PP121与p110γ结合的晶体结构，但在PI3-Ks中可能存在结构类似的氢键(补充图3在线）。这表明PP121通过靶向一个在激酶家族之间结构上保守的残基（Src中的Glu310）来实现其双重效力。有趣的是，化合物S1与每个激酶家族中也高度保守的两个残基形成氢键：PI3-K中的催化赖氨酸和酪氨酸激酶中的守门苏氨酸。
基于这些数据，我们提出PP121等分子通过结合两个分子识别步骤实现其双重选择性。首先，门控器的大小起到了过滤器的作用，阻止吡唑并嘧啶与大多数丝氨酸-三氢嘌呤激酶的结合。这个过滤器不会阻止与PI3-K的结合，因为门控者在这个激酶家族中处于不同的方向。其次，最有效的双抑制剂使特定氢键结合到一小部分残基上，例如Src中的Lys295和Glu310，这些残基在蛋白质和脂类激酶之间保守，并与门卫口袋相邻。
PP121抑制肿瘤细胞中的PI3-Ks和mTOR
接下来，我们探讨了双重抑制剂PP121的细胞效应。我们的目标是将该化合物的活性分解为不同的组分，这些组分是直接抑制单个PI3-K（例如p110α和mTOR）或酪氨酸激酶（例如Src、Abl、Ret和VEGF受体）而产生的。为此，我们系统地比较了PP121和六种参考化合物(). 该小组包括三种PI3-K抑制剂（PIK-90、PI7-103和PP102）和三种酪氨酸激酶抑制剂（PP1、索拉非尼和伊马替尼(23))在这两个家族中，每个家族都抑制不同的激酶亚群。
PP121直接抑制p110α/mTOR(一)酪氨酸激酶下游信号传导示意图。并非所有箭头都表示直接的物理交互。强调了本研究中使用的药物及其关键靶点。(b条)LN229和(c（c）)用PP102或PP121（0.040至10µM）处理血清中的U87胶质母细胞瘤细胞（10%）。细胞被裂解，信号蛋白的磷酸化被western blotting探测。pS6（Ser235/236），pErk（Thr202/Tyr204）。(d日)用PP102、PP121、PI-103、PIK-90或索拉非尼（0.040至10µM）治疗72小时后，测量肿瘤细胞的增殖。在三种血清浓度（0.5%、2%和10%）下测试每个细胞系。(e（电子）)使用PP121或PI-103（2.5µM）或载体（0.1%二甲基亚砜）治疗24小时后，通过流式细胞仪进行细胞周期分析。
我们首先在两个胶质母细胞瘤细胞系U87和LN229中测量了这些药物通过PI3-K、mTOR和MAPK通路的信号传导作用(). PP121和PP102能有效且剂量依赖性地阻断这些细胞中Akt、p70S6K和S6的磷酸化(). 这种抑制作用在LN229细胞中更有效，与U87细胞不同，LN229表达功能性PTEN30(). 我们在这两种细胞系中观察到PI3-K抑制剂PIK-90和PI-103的剂量变化相似31.
与有效阻断PI3-K/mTOR信号相反，PP121和PP102在高达10µM的浓度下对Erk的磷酸化没有影响(). 这表明PP121和PP102通过直接抑制这些细胞中的PI3-K/mTOR而不是通过抑制上游酪氨酸激酶来阻断PI3-K通路。酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼与PP121（如PDGFR、Ret和VEGFR2）共有几个靶点，对这些细胞中的PI3-K/mTOR信号传导没有影响，这一事实支持了这一结论().
接下来，我们测试了PP121阻止含有PI3-K通路成分突变的多种肿瘤细胞系增殖的能力私人PIK3CA，或RAS系统。在三种血清浓度下对每个细胞系进行分析，以探讨在生长因子缺乏的条件下PI3-K信号的需求增加的可能性32.
PP121能有效抑制这些细胞系的一个子集的增殖，其抗增殖活性模式与PI3-K/mTOR抑制剂PI-103非常相似(，顶部面板）。这两种结构无关的分子的平行活性强烈表明，它们通过抑制一个共同的靶点来阻止细胞增殖。相比之下，酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼在很大程度上是不活跃的().
我们通过流式细胞术进行细胞周期分析，以确定这些药物引起的增殖阻滞的性质。PP121诱导了G0G公司1大多数肿瘤细胞阻滞(). 这种阻滞与PI-103治疗的效果相似()其特征是在这些细胞中同时抑制PI3-K和mTOR31总之，这些数据表明，PP121通过直接抑制PI3-K和mTOR来阻止含有PI3-K途径突变的肿瘤细胞系的增殖。
直接抑制mTOR可能对PP121的抗增殖活性特别重要。PI3-K抑制剂PP102和PIK-90对mTOR活性较低，在这些细胞中也表现出较少的抗增殖活性(，底部）。此外，我们之前已经证明，不同PI3-K家族抑制剂对细胞增殖的强效阻断需要直接mTOR抑制16,31尽管如此，这种差异的分子基础仍然是个谜，因为PI3-K抑制剂如PP102和PIK-90可以通过上游PI3-K抑制间接阻断mTOR底物（如Akt和p70S6K）的磷酸化31(). 在这方面，值得注意的是，首批进入临床试验的两种PI3-K抑制剂NVP-BEZ235(24)和XL765(25)，也是有效的直接mTOR抑制剂33.
PP121抑制致癌Src和Ret
PP121抑制几种酪氨酸激酶，这些激酶是主要的癌症药物靶点，包括Bcr-Abl、Src、Ret和VEGF受体(). 因此，我们探索了表达这些酪氨酸激酶的细胞中PP121的活性，以了解该活性如何与PI3-Ks和mTOR的抑制协同作用。
病毒癌基因v-Src对成纤维细胞的转化导致酪氨酸磷酸化和细胞骨架重排失调。As PP121有效抑制Src在体外（集成电路50=14毫微米；)，我们测试了PP121逆转v-Src介导的细胞转化的能力。PP121阻断了v-Src诱导的酪氨酸磷酸化并恢复了肌动蛋白应激纤维染色，这些作用的程度与Src家族激酶抑制剂PP1的治疗相似(). 相反，PI-103通过PI3-K/mTOR途径抑制信号传导，但对磷酸酪氨酸水平或细胞形态没有影响(). 因此，PP121直接抑制细胞中的Src并逆转其生化和形态效应。
PP121直接抑制Src(一)用v-Src（Thr338）转化的NIH3T3细胞用指示浓度的每种抑制剂处理（2 h），溶解并印迹指示蛋白。分子量与磷酸酪氨酸（pTyr）印迹相邻。(b条)用指示的抑制剂处理v-Src（Thr338）转化的NIH3T3细胞（2.5µM，24 h），然后用FITC-指骨磷脂（肌动蛋白）和DAPI（DNA）染色。获得肌动蛋白应力纤维的细胞百分比通过计数进行量化，而不考虑样本身份。
甲状腺肿瘤中经常发现Ret受体酪氨酸激酶的致癌突变34PP121能有效抑制Ret激酶结构域在体外（集成电路50<1 nM）。因此，我们探索了这种化合物在表达C634W致癌Ret突变的TT甲状腺癌细胞中的活性35PP121在低纳摩尔浓度下抑制细胞中的Ret自磷酸化(). 这与索拉非尼的作用类似()目前正在对甲状腺癌进行临床测试，部分基于其对Ret激酶的活性34,36相反，PI3-K/mTOR抑制剂PI-103阻断了S6的磷酸化，但对Ret的自动磷酸化没有影响().
PP121直接抑制Ret(一)用每种抑制剂的指定浓度处理TT甲状腺癌细胞（2小时），溶解并印迹指定蛋白。pRet（Tyr905）。(b条)用每种抑制剂的剂量反应（0.040至10µM）处理TT细胞，并在13天后对细胞数量进行定量。每三天补充一次药物。
我们比较了这些化合物阻止TT甲状腺癌细胞增殖的能力(). PP121在低纳米摩尔浓度（IC）下抑制这些细胞的增殖50=50nM），而Ret抑制剂索拉非尼（IC50=780 nM）和PI3-K/mTOR抑制剂PI-103（IC50≈800 nM）的效力显著降低(). PI3-K抑制剂PIK-90（IC50=1.4µM）和PP102（IC50=2.2µM）仅在微摩尔浓度下有效(). PP121同时抑制Ret、PI3-Ks和mTOR的独特能力可能有助于其在这种情况下发挥非凡的效力。
PP121直接抑制VEGF受体
VEGF受体（VEGFR2）是两种临床批准的小分子药物（舒尼替尼和索拉非尼）的关键靶点，PI3-K/mTOR信号对VEGF介导的血管生成至关重要37,38As PP121能有效抑制VEGFR2激酶结构域在体外（集成电路50=12毫微米；)，我们测试了PP121阻断内源性表达VEGFR2的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中VEGF信号的能力。PP121能有效阻断VEGF刺激的PI3-K和MAPK通路的激活(补充图4在线）。此外，PP121在低纳米摩尔浓度下抑制了VEGFR2的自磷酸化，证实该分子直接靶向细胞中的VEGFR2。
我们比较了PP121和密切相关的吡唑并嘧啶PP102的作用。该化合物对VEGFR2的效力低于PP121在体外但对PI3-K具有类似活性(). 与这一选择性特征一致，PP102在低纳米摩尔浓度下抑制细胞中Akt和S6的磷酸化，但在阻断VEGFR2和Erk的磷酸化方面作用较弱(补充图4在线）。我们测量了这些化合物对用完全培养基或VEGF单独刺激的内皮细胞增殖的影响。PP121和PP102在微摩尔浓度下均抑制HUVEC在完整培养基中的增殖，但PP121对仅用VEGF刺激的细胞表现出选择性增强的效力（IC50=41 nM；补充图4在线）。这些数据与PP121相对于类似物（如PP102）对VEGFR2的更强抑制作用相一致。
血管生成是一个涉及内皮细胞增殖、迁移和细胞外基质（ECM）重塑的多步骤过程。因此，我们在功能性血管生成试验中测试了这些化合物，该试验测量了HUVEC在肿瘤衍生ECM内形成三维管的能力。PP121在本试验中有效阻止了试管形成（IC50=0.31 nM），而PI-103和索拉非尼的活性稍低（IC50分别为0.60和0.59 nM）。选择性PI3-K抑制剂PIK-90和PP102仅在微摩尔浓度下抑制试管形成(补充图4在线）。这种活性谱与酪氨酸激酶、PI3-Ks和mTOR在血管生成信号传导中的多级协作一致。
PP121通过冗余目标覆盖CML中的阻力
慢性粒细胞白血病（CML）是由产生Bcr-Abl癌基因的染色体易位引起的39三种临床批准的药物以酪氨酸激酶为靶点，每种药物都对重叠但不同的Bcr-Abl耐药突变敏感40,41PP121抑制Abl激酶在体外（集成电路50=18 nM；)PI3-K/mTOR信号与Bcr-Abl协同驱动CML细胞增殖15因此，我们测量了正常和耐药CML细胞模型中PP121的活性，以研究这种情况下Bcr-Abl、PI3-K和mTOR之间的相互作用。
PP121抑制K562细胞和表达Bcr-Abl的BaF3细胞中Bcr-Abl诱导的酪氨酸磷酸化，PP121的效力与临床批准的药物伊马替尼相似(和补充图5在线）。与这种生化活性一致，PP121强烈阻止了两种细胞系的增殖(和补充图5在线）。这是药物诱导K562细胞凋亡以及表达Bcr-Abl的BaF3细胞凋亡和细胞周期阻滞的结果().
PP121在CML细胞中重复靶向Bcr-Abl和PI3-K/mTOR(一)用PP121、PI-103或伊马替尼（0.080至20µM）处理表达Bcr-Abl（左柱）或Bcr-Abl T315I（右柱）的BaF3细胞120分钟。裂解细胞并通过western blotting检测信号蛋白的磷酸化。(b条)BaF3 Bcr-Abl和BaF3 B-Cr-Abl T315I细胞对所选药物（2.5µM）的增殖。(c（c）)药物治疗导致细胞凋亡的百分比。BaF3 Bcr-Abl细胞（2.5µM，36小时）、BaF3 Bcr-Abl T315I和K562细胞（5µM，72小时）。(d日)c组处理后剩余活细胞的细胞周期分析。
与PP121相比，PI-103没有阻断Bcr-Abl介导的酪氨酸磷酸化，但通过mTOR途径抑制信号传导(). 相应地，PI-103诱导细胞周期阻滞而非凋亡(). PI3-K抑制剂PIK-90和PP102对细胞增殖几乎没有影响()与其他设置中的活动一致。总之，这些数据表明PP121，而不是其他PI3-K或mTOR抑制剂，直接抑制Bcr-Abl，从而杀死CML细胞。
Bcr-Abl抑制剂治疗的临床耐药性是由阻止药物结合的激酶突变引起的40,41最常见的抗性突变是Bcr-Abl T315I，它将守门人残基从苏氨酸增加到异亮氨酸。这种突变阻断了所有临床批准的激酶抑制剂的结合，并对PP121（IC50>1µM；补充表2在线）。我们测试了表达Bcr-Abl T315I的BaF3细胞中的PP121，发现这种突变消除了PP121抑制细胞酪氨酸磷酸化的能力()诱导细胞凋亡(). 这证实了PP121在CML细胞中的细胞毒性是Bcr-Abl直接抑制的结果；我们用伊马替尼也得到了类似的结果().
然而，与伊马替尼不同，PP121保留了有效阻止Bcr-Abl T315I表达细胞增殖的能力(). 这种增殖性阻滞是由于G0G公司1与PI-103治疗效果相似的细胞周期阻滞(). 与这种阻滞一致，PP121甚至在表达Bcr-Abl T315I的细胞中也能有效抑制S6的磷酸化(). 我们将S6磷酸化的这种残余抑制归因于PP121对PI3-K/mTOR的直接抑制，而PP121不受Bcr-Abl突变的影响。因此，PP121能够通过冗余靶向两条途径来规避单个激酶突变引起的耐药性：Bcr-Abl介导的细胞存活和PI3-K/mTOR介导的增殖。这种作用机制是对正在进行的识别靶向特异性Bcr-Abl突变等位基因抑制剂的努力的补充42.
讨论
许多癌症的有效治疗需要同时抑制多种致癌激酶9,10,31,42,43这是因为肿瘤细胞通过突变靶点来阻止药物结合，从而迅速对单个激酶抑制剂产生耐药性40,41，激活替代激酶以替代药物靶点9或调节通路成分以缓冲不完全抑制10。即使没有获得性耐药性，也很少有选择性激酶抑制剂作为单一疗法具有实质性抗肿瘤活性，这表明需要抑制其他靶点1,43.
多靶向药物将是应对这一挑战的重要工具44–46，但尚不清楚这些分子的选择性在多大程度上可以合理设计，特别是对于结构不同的靶点组合2,20为了实现这一目标，需要发现连接重要药物靶点类别的化学和结构特征，并利用这些特征指导具有定制选择性特征的混杂药物的设计。这种靶向性多药的化学原理基本上还不清楚，但单靶向激酶抑制剂的成功研制提供了乐观的理由。在这种情况下，关键选择性决定因素的早期识别，如非活性构象44,45，变构位点46，活性半胱氨酸残基47,48和守门人27,28，现在已导致针对这些特征的分子的系统设计。
我们询问是否有可能发现针对酪氨酸激酶和PI3-K的分子。这两个蛋白家族是最受追捧的癌症药物靶点之一，但与多靶点药物的典型靶点相比，它们的差异更大。我们在此表明，有可能识别针对这两个致癌激酶家族的有效、选择性和类药物分子，并且我们进一步阐明了控制这些分子独特选择性的结构特征。这扩大了合理药物设计可获得的靶点选择性的范围。由于一些临床批准的激酶抑制剂被认为通过偶然的靶组合发挥作用，探索这种化学空间可能是发现具有涌现性质的分子的有效策略。
