哺乳动物转录网络的无偏重建介导对病原体的差异反应

摘要

介绍

控制基因表达的调控网络充当细胞内的决策回路。例如，当免疫树突状细胞接触到病毒、细菌或真菌时，它们会产生针对每种病原体的转录程序(1)并对建立适当的免疫学结果至关重要(2). 这些反应是通过特定受体启动的，例如Toll样受体（TLR），这些受体区分广泛的病原体类别，并通过特征良好的信号级联传播(2). 然而，转录网络是如何连接以产生特定输出的，这在很大程度上尚不清楚。

两种主要的观察策略将调节器与基因组尺度上的假定目标相关联(三):顺式-调控模型依赖于靶基因启动子中预测的转录因子结合位点的存在(三-5)，而反式-调控模型基于调控因子和目标表达之间的相关性(三-5), (6). 由于启动子结合位点和相关表达是功能调节器-靶点连接的弱预测因子，因此这些方法在生成可靠的转录网络模型方面的能力有限(三). 一种补充策略是系统地干扰每个调节输入并测量其对基因目标表达的影响。该策略已成功应用于酵母(7-9)和海胆(10)但不适用于哺乳动物。

一种基于扰动的网络重构策略

我们开发了一种扰动策略来重建哺乳动物细胞中的转录网络，并将其应用于确定控制DC对病原体反应的网络(图1). 首先，我们分析了五种病原衍生成分刺激后九个时间点的基因表达，并确定了对每个刺激作出反应的特定和共享基因(图S1A). 我们使用这些特征来确定144个候选调控因子，这些调控因子的表达会因至少一个刺激而改变(标准操作手册) (图S1B，顶部). 我们还鉴定了118个标记基因的特征(图S1B，底部)它捕捉到了响应的复杂性。我们为144个候选调控因子中的125个生成了一个经验证的慢病毒shRNA文库(图S1C，顶部)，用它系统地干扰DC中的每个调节器，用病原体成分刺激细胞，并分析118个基因特征的表达(11) (图S1C，底部). 最后，我们使用扰动细胞的测量值来推导调节网络的验证模型(图S1D).

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图1

网络重建的系统策略

该战略包括四个步骤，从左至右(1)使用阵列进行状态测量(2)选择监管机构和响应签名(三)shRNAs对每个调节器的网络扰动，然后测量特征基因，以及(4)从扰动数据重建网络。

TLR激动剂应答的基因表达程序

我们测量了接触PAM3CSK4（“PAM”）的DC的全基因组表达谱，PAM是细菌脂肽的合成模拟物，polyI:C是一种病毒样dsRNA，LPS是革兰氏阴性菌的纯化成分大肠杆菌、小分子激动剂加季莫德和合成ssDNA CpG。这些化合物分别是已知的TLR2、TLR3、TLR4、TLR7和TLR9的激动剂。PolyI:C也激活MDA-5，LPS也可以通过CD14等共受体发挥作用。因此，为了清楚起见，我们指的是配体而不是受体。基于试点实验(图S2，SOM)，我们在用这些病原体成分刺激后0.5、1、2、4、6、8、12、16和24小时测量了mRNA的表达。

观察到的转录反应分为“PAM样”程序和“polyI:C样”程序，以及共享反应（PAM/polyI:C/LPS共享24.5%）。LPS响应(图2A、B,图S3)主要是“PAM-like”和“polyI:C-like”程序的结合。这部分是由这些激动剂激活的已知信号通路解释的。PAM通过MYD88途径结合TLR2和信号；polyI:C分别通过TRIF和IPS-1途径结合TLR3和MDA-5并发出信号；LPS结合TLR4和共受体并使用这两种途径(12). 它也与已知的polyI:C和LPS诱导抗病毒反应相一致(13). “类PAM”程序富含NFκB和炎症反应基因(P（P）<6.1*10^-8)而“polyI:C-like”程序则针对IRF、病毒和干扰素反应基因（ISG、，P（P）<8.3*10^-24). 因此，我们将其称为“类炎症”和“类抗病毒”项目。少数基因对单一刺激物具有特异性。例如，～250个基因是polyI:C特异性的（1250个与LPS共享），包括几个I型干扰素(例如IFNA2、IFNA4、，图2a). 令人惊讶的是，82%的加的莫德（TLR7）和CpG（TLR9）反应与LPS反应相同，但抗病毒成分较弱(图S4). 鉴于其不同的信号机制，这一观察结果出乎意料(14)，但具有高度的重现性和健壮性(图S4，SOM).

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图2

病原成分的基因表达反应

A类，在0、0.5、1、2、4、6、8、12、16、24小时的病原体成分刺激的CD11c+树突状细胞中至少一个时间点的两个副本中，1800个基因的mRNA表达被诱导至基线水平的至少1.7倍（勾号；GRD–gardiquimod）。复制品崩塌，基因分层聚集。行-基因，列-实验，红色-基线诱导，蓝色-基线抑制，白色-基线不变。B类，模型说明了控制抗病毒（“polyI:C样”）和炎症（“PAM-样”）程序的差异网络。

候选监管机构的识别和响应签名

为了选择调节观察到的转录反应的潜在调节器，我们重点研究了在病原体感应期间其表达发生变化的调节器基因（对于许多哺乳动物的反应来说，这是一个合理的假设(15,16)包括病原感应(1,4). 首先，我们重建了一个观测反式-基因调控模型(图S1B，顶部，S5A，SOM)将80个共同调控基因模块与608个预测调控因子关联(4,17,18)（SOM，图S5B)，从3287个候选监管机构中自动选出(标准操作手册). 在至少一次实验中，筛选出117个高于最小表达信号的调节器(图S5B). 其中包括来自NFKB、STAT和IRF家族的已知调节因子，以及诸如昼夜节律调节因子Timeless和DNA甲基转移酶Dnmt3a等意外候选因子。其次，我们增加了5个组成表达的监管机构顺式-反应基因中富含调节元件(标准操作手册). 第三，为了捕捉延迟反应或非线性关系，我们纳入了22个表达至少有2倍变化的调控因子。这导致了144个候选调控因子，其表达模式的分布与一般反应相似(图S6、S7、S8和表S1)，DC和功能相似的巨噬细胞在LPS下的调节蛋白表达是保守的（Pearson相关性r～0.9，图S9A)以及人类巨噬细胞和小鼠DC之间（2小时时r～0.6，图S9B)支持调节因子转录的功能相关性。

为了识别信息量高的报告基因，以监测干扰调节器的影响，我们设计了基因选择器(图S10A，表S2，SOM). GeneSelector递增地选择基因（从我们的完整表达数据集中），这些基因的表达谱提高了我们对给定先前选择的基因的刺激的辨别能力。使用这种方法，我们确定了最佳时间点（激活后6小时，图S10B)以及一组81个区分刺激的基因(标准操作手册). 我们添加了37个候选调控因子，在6小时时可检测到表达，创建了118个基因的特征。最后，我们添加了10个控制基因，其表达水平在所有刺激下都保持不变，但其（恒定）基础水平从很低到很高不等。

扰动、剖面和建模

我们产生了经验证的慢病毒shRNAs，它将144个候选调控因子中的125个的表达降低了至少75%(图S11，表S3，SOM)和32个没有已知基因靶点的shRNAs作为骨髓DC的对照(图S12、图S13、表S4、SOM). 为了进行我们的扰动研究，我们选择了一种单一的治疗方法，即LPS，它可以激活大多数“类炎症”和“类抗病毒”程序。在用LPS刺激shRNA干扰的DC 6小时后，我们使用n计数器(11)计算118个报告基因和10个控制基因的转录本。

每个shRNA感染引起的特征基因表达的变化被用于构建一个模型，该模型将调节因子与其靶点相关联。我们预计，阻遏物被击倒的报告基因的转录水平会增加，而激活物被击落的报告基因转录水平会降低。我们的基于错误发现（FDR）的模型估计了感染特定shRNA的DC转录物变化的重要性(标准操作手册). 我们通过与对照shRNAs干扰后每个基因表达的变化进行比较来控制基因特异性噪声(图3A)，以及通过与给定shRNA扰动后对照基因表达的变化进行比较来检测shRNA特异性噪声(图3B). 我们估计了来自37个监管机构的电话的敏感性，这些监管机构也被列为目标记者(图S14，SOM).

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图3

控制病原体成分反应的基因调控程序

A、 B类一种策略，用于最小化因调控基因敲除而导致输出目标基因发生重大变化的错误发现（FDR）调用。A类，第一个FDR程序(顶部)比较基因在受到调节子shRNA干扰后的表达（右）和受到32个非靶向shRNA干扰时的表达（左）。虚线表示基于基因特异性FDR的诱导阈值（蓝线）和抑制阈值（红线）。重要调用的离散向量(底部)来自原始数据（蓝色-调节器抑制目标基因；红色-调节器诱导目标基因）。B类，第二个FDR程序(顶部)使用相同的shRNA对目标基因和八个控制（目标）基因的表达进行扰动比较。在所示示例中，该基因的诱导(左边)与对照靶基因之间的表达差异显著相关，导致高分(底部，深蓝色），但其抑制作用与对照组没有显著差异，导致得分较低(底部，较弱的红色）。C类。监管机构（列）和目标（行）之间的所有重要（95%置信度）关系，颜色如B类.灰色条（右侧）表示每个目标基因基于NMF的调用；黑色-抗病毒程序；深灰色-炎症程序；浅灰色-控制基因。底部栏显示了调节器对每个程序的影响程度，该程度由调节器扰动剖面的NMF投影确定。（黄色-正效应，绿色-负效应；NMF分数平均正常化）。

根据这些结果，我们确定了一个具有2322个重要调控联系的紧密重叠网络，包括1728个激活和594个抑制(图3B，分别为红色和蓝色，置信度为95%表S5、S6和S7). 在接受测试的125个监管机构中，我们自信地确定了100个至少有四个目标。其中有24个中枢调节器，预计在118个被测基因中调节25%以上，以及76个特定调节器，每个调节器影响4到25个基因的表达。平均而言，～14（±8 stdv）调节器激活一个靶基因，5（±5.8）调节器抑制它。间接效应可能是我们针对每个靶点观察到的大量调节器的原因。

我们的扰动模型捕捉到了反应的已知调节特征，但也识别出了新的调节器。报告基因根据对扰动的反应分为两大类(图3B,图S15A)：“类抗病毒（polyI:C）”节目记者(例如CXCL10、ISG15、IFIT1）和“炎症（PAM）样”项目记者(例如IL1b、CXCL2、IL6、IL12b），与表达数据一致。我们还发现了许多已知的调节关系，例如转录因子NFκB家族（Rel、Rela、Relb、Nfkb1、Nfkm2和Nfkbiz）调节其已知的炎症基因靶点。我们的网络提供了证据，证明至少有68个额外的监管机构参与了对病原体的反应，其中11个是以前与该系统无关的中心。有趣的是，12家监管机构确定(例如在全基因组关联研究中，Hhex、Fus、Bat5、Pa2g4）与与自身免疫性疾病和相关疾病相关的SNP处于连锁不平衡状态(表S8).

核心炎症和抗病毒项目

接下来，我们讨论了每个调节器如何促进特定细胞状态的生成。我们首先使用非负矩阵分解（NMF）自动定义由五种病原体成分诱导的两种主要状态(19)和原始数组数据(标准操作手册). 该程序确定了两个主要的表达成分（称为“后基因”）：一个主要由“类炎症”程序中的基因决定，另一个由“类抗病毒”程序中基因决定(图2a). 接下来，我们量化了每个监管机构倒闭对这两种状态的影响(图3B,图S15A，表S9)通过对调节器扰动后的n计数器表达式测量值进行分类(19,20).

最后，我们使用了监管机构排名得分(标准操作手册)分配33个（8个已知）基因作为炎症状态的调节器，33个（15个已知）基因组作为抗病毒状态的调节者。这准确地分类了已知的炎症反应激活物(例如NFκB因子Rela、Nfkbiz、Nflb1、，图3B,炎症后基因中的黄色)和抗病毒反应(例如统计1、统计2、统计4、Irf8、Irf9图3B,病毒后基因中的黄色). 虽然所有的扰动实验都是在LPS刺激（一种细菌成分）下进行的，但我们正确地分类了已知的调节对其他刺激的反应的因素。34个额外的调节因子与这两种反应相关，这表明单个调节因子可以控制任何一种状态下的基因，这取决于调节因子激活的不同时间、其水平或组合调节。值得注意的是，在检测的12个转录因子中，我们发现顺式-适当后基因中的调控元件(标准操作手册).

根据NMF分数(表S9)，我们发现了一个炎症子网络(图S15B)，一个抗病毒子网(图4A,S15C型)以及几个微调子网络，它们影响两种反应中数量较少的基因(图S15D、S16、SOM). 炎症子网络(图S15B)由三种调控模式组成：优势激活物（Cebpb、Bcl3、Cited2）诱导的炎症靶点多于抗病毒靶点；在抑制抗病毒基因的同时诱导炎症基因的交叉抑制剂（Nfkbiz、Nfkb1、Atf4、Pnrc2），以及只针对炎症基因的特异性激活剂（Runx1、Plagl2）。我们观察到，显性激活剂主要调节效应器，而调节器主要由交叉抑制剂控制。

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图4

控制炎症和抗病毒反应的核心调节电路

A类抗病毒子网络显示了核心抗病毒调节因子（蓝色节点，顶部)、他们的目标（方框、，底部)以及炎症调节因子（绿色节点，右上角). 两个最高监管机构Stat1和2激活所有抗病毒目标（蓝色虚线箭头）。二级监管机构启动子目标集（紫色虚线箭头）。B类，网络中识别的前馈循环类的示例，每个类的分数。C类炎症和抗病毒程序的核心调节网络，由最独特的调节器组成，以及它们和配体和受体的关系(顶部). 尖头箭头–感应；钝箭——压制；绿色卵圆形-炎症调节因子；蓝色椭圆–抗病毒调节剂。注意到目标基因示例。D类.靶基因（行）的反向表达谱，用shRNAs干扰病毒调节子集（列），然后用LPS刺激(左边)或polyI:C(正确的). 所有数值均通过感染对照shRNA的细胞在相同刺激（shCtl）下的表达进行标准化。

专注于网络架构，我们在这种反应中发现了多个前馈电路，其中上游调节器通过次级调节器直接和间接控制目标基因(21)(例如 图4B、和表S10、S11). 大多数（76%，6444个前馈电路中的4892个）被发现是相干的(21); 对调节基因具有相同的直接和间接作用。绝大多数（80%）为I型回路(22)全方位积极监管(例如NFKBIZ激活E2F5，两者都激活IL6）。这种前馈电路对持续刺激而非瞬时刺激作出反应，保护系统免受虚假信号的影响，正如LPS刺激巨噬细胞中的一个电路所示(23). 我们的发现表明，相干前馈环路，尤其是I类前馈环路(21)，是该系统的一般设计原则，可能会对该响应产生生理影响。

在抗病毒子网络中，我们确定了一个结合前馈和反馈回路的双层调节电路(图4A,表S11). 该电路的最高级别是抗病毒监管机构Stat1和Stat2，它们监管着大量的抗病毒记者。二级调节器Timeless、Rbl1和Hhex由Stat1和2控制，很可能形成针对特定基因子集的连贯前馈回路。永恒、Rbl1和Hhex还反馈并促进Stat调节器的表达。该电路通过细胞周期调节器和RNA结合蛋白Fus被抑制(24)作为43个病毒基因的单一显性抑制剂。

最后，根据每个监管机构影响的目标数量、规模和逻辑，我们推导出了一个核心网络，其中包括对每个响应影响最大的监管机构(标准操作手册). 核心网络(图4C)有24个调节器，其中13个以前被确定为调节炎症或抗病毒反应的关键因素，而11个以前没有牵涉到这两种反应。其中，19种是转录因子，3种是染色质修饰因子，2种是RNA结合蛋白。监管机构显然通过交叉抑制来区分这两个程序(图4C，灰线）或主导激活(图4C). 核心网络还解释了分泌因子的差异表达是如何被指定的，从而导致不同病原体相应细胞类型的激活和迁移(25) (图S17，SOM).

嵌入许多已知的抗病毒反应调节器中(图4C,S15C型)，我们发现了一大批此前与此反应无关的监管机构。其中包括几个已知的细胞周期和昼夜节律调节器，包括Rbl1、Jun、RB、E2F5、E2F8、Nmi、Fus和Timeless，其中几个位于我们的核心网络中。这表明细胞周期调控电路在树突状细胞的抗病毒反应中发挥作用（对细胞周期进展没有明显影响，图S18). 由于我们在使用细菌成分LPS刺激的DC的扰动实验中确定了这些抗病毒调节关系，我们在暴露于病毒成分polyI:C后沉默了四个调节器（TIMELESS、RBL1、JUN和NMI）。这四个调控器中的每一个都强烈影响抗病毒程序，比LPS刺激下观察到的更多(图4D)和受影响的基因(例如I型干扰素），其表达为polyI:C特异性。Nmi影响了一组较小的基因，这与模型的预测一致。这些结果证明了我们在未观察到的情况下正确预测功能的能力。

虽然大多数抗病毒基因是在细菌成分LPS刺激后诱导的，但一些关键基因在polyI:C刺激中特异表达，或在每个刺激中遵循不同的模式。在对病毒感染细胞的反应中，诱导产生干扰素β1（IFNB1），这是抗病毒反应的关键介质。因为如果受到特定细菌的感染，高水平的IFNB1可能对宿主有害(26)，我们预测特定的机制将IFNB1的调节与LPS的反应隔离开来。事实上，尽管IFNB1表达在LPS刺激的前两个小时被诱导，但与polyI:C处理后的持续诱导相比，该表达在随后的时间点下降(图5A). 我们的模型表明，已知三种调节因子影响染色质重塑(24,27,28)LPS中是否有IFNB1阻遏物(图5B)：Polycomb复合物亚单位Cbx4(27)，保险丝(24)和DNA甲基转移酶Dnmt3a(28). Cbx4似乎赋予IFNB1诱导的抗病毒特异性，因为它是在PAM和LPS治疗的前两小时内诱导的，而不是由polyI:C诱导的(图5C)在LPS治疗期间，Cbx4敲除导致IFNB1 mRNA和蛋白的诱导(图5D,图S19A)，但对趋化因子Cxcl10（polyI:C和LPS诱导的基因）的诱导没有影响(图S19B). 在PAM激活期间，Cbx4敲除不影响IFNB1(图5E)当未诱导抗病毒反应时。结合Ifnb1位点及其最近邻基因Ptplad2周围染色质变化的证据(图S20A)对Cbx4有类似的依赖性，这些数据与Cbx3对局部染色质组织的影响一致(图S20B、C). Cbx4敲除影响少数基因（～120上调和～120下调全基因组，表S12). 因为大多数上调基因在未受干扰的细胞中显示出与Cbx4类似的精确时间模式，所以它们很快被诱导并在2-4小时后恢复到基础水平(图S21 A-F)我们得出结论，染色质修饰物可以像转录因子一样控制调控程序中特定基因的精确表达。

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图5

多梳组分Cbx4在细菌扰动下选择性地限制IFNB1的产生

A、 C类LPS（红色）、polyI:C（蓝色）和PAM（绿色）诱导ifnb1的表达(A类)和cbx4(C类)从中的数据导出图2A.B。针对125个调节器中的每一个调节器（格式如图3B).D类LPS治疗后未分类小鼠骨髓DC中Ifnb1 mRNA水平（通过qRT-PCT），这些DC受到针对Cbx4（黑色）或对照shRNA（灰色）的shRNA干扰；信号是相对于t=0的。E类用抗Cbx4的shRNA或三种对照shRNA中的一种干扰骨髓树突状细胞LPS或PAM后6小时的ifnb1 mRNA水平（通过n计数器）。F类Cbx4对ifnb1的细菌特异性抑制模型：polyI:C和LPS都能早期诱导ifnb1表达(左边)，但只有LPS诱导Cbx4，后者随后会抑制ifnb1基因座(右侧，顶部).

总之，我们的结果提出了一种转录负反馈环的模型，控制LPS刺激中IFNB1的表达，其中诱导的促炎调节因子和染色质修饰因子Cbx4通过修饰IFNB1基因座中的染色质来抑制转录，产生驱动炎症反应与抗病毒反应所需的特异性(图5F). 由Cbx4和Dnmt3a构成的I型相干前馈环(图4B)与IFNB1的延迟抑制相一致。由于这两个调控因子都不携带序列特异性DNA结合域，因此导致其导向Ifnb1位点的因素仍然未知。

讨论

我们研究的中心目标是解决病原特异性反应的机制基础。与之前的研究一致(13)，我们区分了两个关键程序，一个是PAM（TLR2）样炎症反应，另一个是polyI:C（TLR3/MDA-5）样抗病毒反应，这两个程序是由LPS、革兰氏阴性细菌成分和TLR4-l干扰素共同诱导的。这些程序反映了所需功能反应之间的定性和定量差异，并与某些细菌和病毒感染之间的交叉保护相一致(13). LPS的广泛影响使我们能够专注于单一刺激和时间点，但带有其他刺激的屏幕可能会识别出其他独特的调节器。

我们发现这两种反应由两个相应的调控臂控制，揭示了观察到的转录反应的机制基础。这两个分支被整合到一个由24个调节器组成的核心网络中，该网络通过显性激活和交叉抑制平衡特定和共享响应。在炎症反应中，我们发现了几个前馈回路，可以确保只对持续性而非偶发性信号作出反应。在抗病毒反应中，我们发现了一个包含反馈和前馈回路的双层电路，涉及一个细胞周期调节器模块（Jun、Rbl1、Timeless和Nmi），我们直接验证了该模块。超过75个额外的基因可以进一步微调基因靶点的调控。这种扰动模型确定了许多非系统方法所忽略的监管关系。

虽然我们受益于DC系统的特定特征，但我们的工作为哺乳动物细胞的网络重建建立了一个公正、直接和通用的框架(标准操作手册). 特别是，我们开发了几种策略来利用shRNA进行基因调控的研究。这种方法可以以可观的规模和合理的成本执行，并与破译哺乳动物中的多种调控系统的挑战相兼容。可以将其扩展为导出越来越详细的模型，并区分直接目标和间接目标。

我们的研究将有助于开发新的计算方法来推断监管模型。虽然许多计算方法试图推导观测模型，但其质量难以评估(三). 这里生成的数据包括用于训练模型的表达式配置文件和用于测试其质量的扰动无偏屏幕（Web门户；ftp://ftp.broadinstitute.org/pub/papers/dc网络/). 当我们将扰动模型与观测模型进行比较时，我们发现在这两种模型中，许多候选调节器都被正确识别(图S5、S22). 然而，在观察模型中也有许多假阳性关系，这归因于正确的调节器和许多其他调节器都有不可区分的表达(图S22、S23).

我们构建的高分辨率地图具有重要的生物医学意义。通过识别调节特定基因对差异控制的调节器（例如IL-23与IL-12，图S17)和整个监管部门(例如病毒与炎症），它为控制疾病或提高疫苗效力的特定途径的治疗靶向开辟了道路。此外，我们的12个调控因子位于与自身免疫性疾病和相关疾病相关的SNP连锁不平衡的遗传位点。确定的基因及其对树突状细胞的影响提供了假说，有助于解释级联基因的等位基因如何改变人类对特定感染或免疫疾病的易感性。

补充材料

致谢

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