介绍
蛋白多糖聚合蛋白对脊椎动物神经肌肉接头（NMJ）的发育和维持至关重要[1],[2]它也可能在中枢神经系统中具有促进突触的功能[3]–[8]脊椎动物农业蛋白存在于几种通过选择性剪接产生的同种型中(). agrin基因第一外显子的差异转录导致分泌型通过其层粘连蛋白结合N末端NtA结构域与基底膜结合，或不含NtA域的较短亚型作为II型跨膜蛋白附着在细胞质膜上。agrin的II型跨膜亚型在大脑中占主导地位，而分泌型变体是运动神经元表达的主导形式。分泌的agrin从运动神经元的神经末梢释放到神经肌肉接头的突触缝隙中，在那里它成为突触基底膜的一个重要组成部分。
农业综合企业的领域架构。不同结构域类型的agrin有：N末端agrin结构域，NtA（NtA；浅紫色）；卵泡抑素域（FS；蓝色）、层粘连蛋白-EGF域（LE；浅棕色）、SEA-域（SEA；紫色）；EGF结构域（E；橙色）、层粘连蛋白G结构域（LG；浅红色）。脊椎动物agrins（此处以褐家鼠agrin）有两个可选的N末端。分泌型具有一个信号序列（SP；橙色）和一个层粘连蛋白结合N末端agrin结构域，而膜结合型具有短的细胞内区域和跨膜螺旋（垂直黑条）。脊椎动物agrin在B/z位点C末端部分的选择性剪接产生了不同于聚集乙酰胆碱受体能力的agrin亚型。两个箭头表示脊椎动物agrins的神经胰蛋白酶切割位点（α和β位点）。注意，神经胰蛋白酶裂解位点在无脊椎动物聚集蛋白中并不保守。实心红线表示本研究中使用的重组Agrin_Nterm的结构域。图的下半部分显示了代表Urochordates的无脊椎动物物种的agrin结构(肠蝉)、回声节点(紫斑圆线虫)，节肢动物(蜜蜂)、线虫(秀丽隐杆线虫)和普拉科索亚(丝盘虫); 有关详细信息，请参见表S1注意节肢动物的agrin栗Tribolium castaneum具有与agrin相同的域体系结构蜜蜂.
所有形式的脊椎动物聚集蛋白的N末端由九个卵泡抑素相关和两个层粘连蛋白EGF样模块组成[9]，中间部分包含SEA模块[10]C末端含有四个表皮生长因子和三个层粘连蛋白球状结构域(). 利用C末端层粘连蛋白G域运动神经元衍生的聚合蛋白，通过与肌肉膜中由MuSK（肌肉特异性激酶）和LRP4（低密度脂蛋白受体相关蛋白4）组成的受体复合体结合，影响NMJ的形成和维持[11],[12].
在脊椎动物中，C末端保守部位的选择性剪接()产生在聚集乙酰胆碱受体（AChRs）中具有显著不同活性的agrin亚型。运动神经元表达的亚型在该位点含有8、11或19个氨基酸的插入物，在AChR聚集中很活跃，而肌肉表达的agrin在该位点没有插入物，也不聚集AChR[1],[13]最近，在神经元蛋白酶神经肽从其亲本agrin中释放活性依赖性蛋白水解酶后，发现agrin的C末端层粘连蛋白G结构域有助于树突状丝状伪足对海马神经元的活性依赖性促进[6]与NMJ形成相反，树突状丝状伪足的活性依赖性促进不需要在层粘连蛋白G结构域中的B/z剪接位点插入[6].
关于agrin N末端区域的功能知之甚少。基于与卵泡抑素的同源性，我们先前提出，该区域可能与TGFβ家族的生长因子结合，它与所有agrin亚型共同存在[9]在本研究中，我们制备并纯化了agrin-Nterm的重组N末端片段，并用表面等离子共振和报告分析方法研究了其与TGFβ家族不同成员的相互作用。SPR研究表明，Agrin-Nterm对BMP2、BMP4和TGFβ1具有相对较高的亲和力，在报告基因分析中，它抑制BMP2和BMP4的活性，但增强TGFβ1的活性。我们发现Agrin-Nterm结合TGFβ家族成员可能对这些生长因子在调节突触发生中的作用以及无法诱导乙酰胆碱受体聚集的Agrin亚型的作用具有重要意义。
材料和方法
试剂、酶、PCR引物、蛋白质、细菌菌株、细胞系和培养基
限制性内切酶、T4 DNA连接酶和Klenow聚合酶是新英格兰生物实验室的产品（美国马萨诸塞州贝弗利）。PCR引物来自Integrated DNA Technologies（Coralville，IA，USA）。对于扩增反应，我们使用了来自Fermentas（立陶宛维尔纽斯）的Taq聚合酶或校对的耐热聚合酶Accuzyme（英国伦敦Bioline）。DNA纯化使用Nucleospin Extract PCR纯化试剂盒（德国杜伦市Macherey-Nagel）进行。大肠杆菌在DNA操作步骤中，使用JM109菌株进行DNA繁殖。成熟的人类BMP2、BMP4、TGFβ1和TGF-βsRII（对应于TGF-？RII的胞外结构域）购自R&D Systems（德国威斯巴登）。CM5传感器芯片和用于将蛋白质偶联到芯片的试剂来自Biacore AB（瑞典乌普萨拉）。人类BMPR1A的胞外结构域（ECD-BMPR1A）是按照另一份出版物（Szláma、Kondás、Trexler和Patthy，提交给JBC的手稿）中的描述生成的。
萤火虫荧光素酶试剂盒来自Biotium（美国加利福尼亚州海沃德）。稳定转染截短PAI-1启动子/萤火虫荧光素酶构建物（MLEC-clone32）的水貂肺上皮细胞[14]以及用BRE-luc报告基因构建体稳定转染的HepG2 BRA细胞[15]由丹尼尔·里夫金教授（纽约大学）慷慨提供。培养基DMEM和热灭活FBS来自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。
大鼠agrin N末端区的克隆与表达
大鼠agrin（agrin-Nterm）的编码残基Asp65-Gln865的cDNA片段用5′-GCAGATCTGATGTATGCAGGGAATGTGTGG-3′感觉和5′-GCTCTAGACTGGCAGGACCAAACCTG-3′使用大鼠agrin cDNA的反义引物（NCBI参考序列：NM_175754.1）。
扩增的DNA用BglII和XbaI限制性内切酶消化并连接到果蝇属表达载体pMT/BiP/V5-H是用相同的酶消化的A。结扎混合物转化为大肠杆菌在含有100 mg/ml氨苄西林的LB培养基上选择JM109细胞和重组体。从转化子中分离质粒并分析插入物的存在。克隆DNA的序列在两条链上都得到了验证。
黑腹果蝇根据制造商推荐的方案，使用Cellfectin试剂（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市Invitrogen），用4µg pMT/BiP/V5-His A表达质粒转染S2细胞（美国印第安纳州布卢明顿市DGRC印第安纳大学），该表达质粒含有编码Agrin-Nterm的cDNA和16µg p CoHygro选择载体。为了选择稳定的转染剂，将细胞悬浮在施耐德氏培养基中果蝇属培养基（Invitrogen，Carlsbad，美国加利福尼亚州），补充10%胎牛血清（Sigma-Aldrich）和300µg/ml潮霉素B（Invit罗gen，美国加利福尼亚洲卡尔斯巴德）。用潮霉素B筛选5周后，建立了稳定转化的多克隆系。
为了诱导蛋白质，在无血清培养基（Invitrogen，Carlsbad，CA USA）中培养稳定的转染体，细胞密度为2–3×106/添加CuSO可诱导ml和蛋白质表达4最终浓度为400µmol。诱导1周后，离心培养物，收集条件培养基，将细胞悬浮在新鲜诱导培养基中，开始另一轮诱导。通常用相同的细胞进行三轮诱导。在25 mM Tris pH 7.5缓冲液中透析从三轮诱导中收集的培养基。
Agrin Nterm的纯化
将透析培养液应用于镍亲和柱（Amersham Biosciences UK）。用10个柱体积的20 mM Tris-HCl缓冲液清洗柱，pH 7.9含有500 mM NaCl和5 mM咪唑，然后用5个柱体积20 mM Tris-HCl缓冲液、pH 7.9含500 mM NaCl和30 mM咪唑啉清洗柱，用20 mM Tris-HCl缓冲器洗脱结合蛋白，pH7.9含有300 mM咪哒唑(). 洗脱的蛋白质在Sephadex G-25柱上脱盐，与100 mM碳酸氢铵、pH 8.0缓冲液平衡，并冻干。使用与100 mM碳酸氢铵缓冲液（pH 8.0）平衡的Superdex凝胶过滤柱（HiLoad 10/300 Superdex-200 GL），利用AKTA净化器10系统（瑞典乌普萨拉GE Healthcare）进一步纯化重组蛋白(). 收集0.5 ml的组分，通过SDS–PAGE分析样品，合并含有纯Agrin-Nterm的组分并冷冻干燥。纯化蛋白的平均产量为每升组织培养液1.0–1.5毫克。
亲和层析分离Agrin-Nterm。的透析培养液黑腹果蝇将表达重组Agrin_Nterm的S2细胞应用于镍亲和柱上，用10个20 mM Tris-HCl缓冲液柱体积、pH 7.9（含500 mM NaCl和5 mM咪唑）洗涤柱，然后用5个20 mM-Tris-HCl缓冲液柱体体积、pH值7.9（含有500 mM氯化钠和30 mM咪唑）洗涤柱（第一个箭头）用20 mM Tris-HCl缓冲液洗脱结合蛋白，pH 7.9，含300 mM咪唑（第二个箭头）。右侧面板显示亲和层析的SDS-PAGE，St表示低分子量校准试剂盒的模式（瑞典乌普萨拉Amersham Pharmacia Biotech；Mr值：14400、20100、30000、45000、66000和97000）。水平条表示含有Agrin Nterm的合并馏分。
用凝胶色谱法纯化Agrin-Nterm。通过镍亲和层析分离的重组蛋白（参见使用Superdex凝胶过滤柱（HiLoad 10/300 Superdex-200 GL）在AKTA净化器10系统上进行色谱分析，并合并含有纯Agrin-Nterm（水平条）的馏分。插页的a栏显示了AKTA色谱组合中Agrin-Nterm的SDS-PAGE，b栏显示了低分子量校准试剂盒的模式（Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden；Mr值：14400、20100、30000、45000、66000和97000）。
蛋白质分析
在还原和非还原条件下，使用6–16%线性聚丙烯酰胺梯度板凝胶通过SDS–PAGE分析蛋白质样品的组成。凝胶用考马斯亮蓝G-250染色。在SDS-PAGE上，重组Agrin-Nterm表现为广泛的高分子涂片（M第页>90 kDa）蛋白多糖的特性。重组Agrin-Nterm的计算分子量为88054Da；预测和观察到的Agrin-Nterm分子量的差异是由于该部分Agrin-Ntem中多个位点的糖基化所致[16].
利用45475 M−1 cm−1的消光系数测定重组蛋白的浓度。消光系数是用ExPASy的ProtParam工具测定的(http://us.expasy.org/tools/portparam.html).
利用在线ABI120A PTH氨基酸分析仪在Applied Biosystems 471A蛋白质测序仪上进行N末端测序。Agrin-Nterm的N末端序列为RSDVCRGMLCGF公司（粗体下划线中的残基对应于大鼠agrin的残基65–74）。
表面等离子体共振分析
基本上如前所述，在BIAcore X仪器（瑞典斯德哥尔摩GE Healthcare）上进行表面等离子体共振测量[17].
重组人蛋白（BMP2、BMP4、TGFβ1、TGF？sRII）按照制造商的说明溶解（德国威斯巴登研发系统公司）。将蛋白质在最终浓度为0.04µg/ml（TGFβ1和BMPs）、pH为4.5的50 mM醋酸钠缓冲液中稀释，并按照制造商的说明将50µl这些溶液以5µl/min的流速注入CM5传感器芯片（Biacore AB，Uppsala，Sweden）中10分钟，该传感器芯片由胺偶联方法激活。ECD-BMPRI-传感器芯片的制备方法类似，只是蛋白质溶解在50 mM的醋酸钠中，pH值为4.2（Szláma、Kondás、Trexler和Patthy，提交给JBC的手稿）。对于相互作用测量，将含有不同浓度分析物的70µl样品以20µl/min的流速注入传感器芯片，然后用缓冲液以20µl/min的流速洗涤。
在20 mM HEPES、150 mM NaCl、5 mM EDTA、0.005%吐温20、pH 7.5缓冲液中进行结合和洗涤。在每个循环后，通过在传感器芯片上注入40µl 20 mM HEPES、150 mM NaCl、5 mM EDTA、0.005%吐温20、pH 7.5缓冲液（含8 M尿素），对芯片表面进行再生。所有实验至少重复两次。参考细胞用于获得控制传感器图，显示与表面的非特异性结合以及溶液体积特性变化引起的折射率变化。在仅存在偶联缓冲液的情况下，通过执行偶联反应制备参考流动池。从固定化配体获得的传感器图中减去参考传感器图。为了校正反应表面和参考表面之间的差异，我们还减去了空白运行缓冲液注入获得的传感器图的平均值。
动力学参数（k一–关联率常数；k个d日——离解速率常数；K（K）D类 = k个d日/k个一–平衡解离常数）通过使用BIA估值软件4.1对实验数据进行全局拟合来确定每种相互作用，拟合的紧密性用χ表示2值。仅适用于χ2低于Rmax的5%的值被接受。数据拟合为1∶1朗缪尔相互作用模型。
在溶液竞争分析中，在室温下将恒定浓度的生长因子与不断增加的Agrin-Nterm在20 mM HEPES、150 mM NaCl、5 mM EDTA、0.005%吐温20 pH 7.5缓冲液中培养30分钟，然后注射到带有生长因子受体固定ECD的芯片上。
细胞培养
水貂肺上皮细胞和HepG2-BRA细胞在补充有10%FBS、青霉素（100 U/ml）、链霉素（100µg/ml）和基因素的DMEM中培养，浓度为200µg/ml（MLEC-clone32）或700µg/m1（HepG2-BRA），温度为37°C，浓度为5%CO2.
报告者分析
TGFβ1活性用MLEC-clone32细胞测定，而BMP2和BMP4活性用HEPG2-BRA细胞监测，使用96周的组织培养皿。在这些报告人分析中，MLEC-clone32细胞（1.6×104细胞/孔）或HEPG2-BRA细胞（5×10三细胞/孔）分别附着3小时或24小时，然后将培养基更换为补充0.1%BSA的DMEM，青霉素（100 U/ml）链霉素（100µg/ml），含有16 pM TGFβ1、250 pM BMP2或250 pM BMP4，用不同浓度的Agrin-Nterm预培养30分钟。除了没有添加生长因子外，对照实验也进行了类似的操作。
在37°C、5%CO下孵育17小时后2在100µl裂解缓冲液中对细胞进行裂解，并使用Appliskan光度计上的Biotium萤火虫荧光素酶检测试剂盒（美国马萨诸塞州热电公司）测定样品的荧光素酶活性。样品的蛋白质含量采用Bio-Rad蛋白质测定法（美国Biorad）测定，荧光素酶活性标准化为微孔的蛋白质含量。
结果
Agrin结合BMP2、BMP4和TGFβ1
表面等离子体共振分析表明，可溶性Agrin-Nterm与固定化BMP2、BMP4和TGFβ1具有亲和力(). 传感器图的评估表明，Agrin-Nterm与固定化TGFβ家族成员相互作用的平衡离解常数为：TGFβ1，KD类 = 5,15×10−8M；骨形态发生蛋白2，KD类 = 2,62×10−7M；骨形态发生蛋白4，KD类 = 2,57×10−7M、 分别(). 这些相对较高的亲和力增加了Agrin生长因子相互作用可能具有生物学重要性的可能性。为了评估这些相互作用的生物学相关性，我们研究了Agrin-Nterm以溶液竞争形式使用SPR以及荧光素酶报告分析阻止生长因子与其受体结合的能力。
通过SPR分析表征BMP2、BMP4和TGFβ1与Agrin-Nterm的相互作用。（A）Agrin Nterm（660、1320、1980、2640和3300 nM）与BMP2相互作用的传感图；（B） Agrin-Nterm（660、1320、2640、3960和5280 nM），含BMP4；（C） Agrin-Nterm（360、900、1800、2160和2700 nM）和TGFβ1。将不同浓度的Agrin-Nterm注入20 mM HEPES缓冲液（pH 7.5）中，该缓冲液含有150 mM NaCl、5 mM EDTA、0.005%吐温20，通过固定在CM5传感器芯片上的TGFβ1或BMPs注入。对于每种类型的实验，都显示了一组具有代表性的三个平行数据。为了清楚起见，面板中未显示Agrin-Nterm的浓度；在每种情况下，SPR反应都随着Agrin-Nterm浓度的增加而增加。
表1
Agrin-Nterm与TGFβ家族不同成员相互作用的动力学参数。
| 相互作用蛋白质 | K（K）D类（百万） | k个一（1/米） | k个d日（1/s） |
| Agrin-Nterm–转化生长因子β1*
| 5,15×10−8
| 3,34×10三
| 1,72×10−4
|
| Agrin-Nterm–骨形态发生蛋白2*
| 2,62×10−7
| 1,09×10三
| 2,86×10−4
|
| Agrin-Nterm–骨形态发生蛋白4*
| 2,57×10−7
| 1,61×10三
| 4,12×10−4
|
Agrin-Nterm对BMP2、BMP4和TGFβ1与其同源受体胞外区结合的影响
如所示BMP2的预培养()或BMP4()随着Agrin-Nterm浓度的增加，记录的SPR反应和观察到的结合率有效降低，表明BMP2-Agrin-Nterm和BMP4-Agrin-Nterm复合物形成，并且这些复合物无法与受体蛋白BMPR1A的ECD结合。采用Nieba等人的方法对数据进行分析。[22]发现Agrin-Nterm导致观察到的关联率下降50%（k光突发事件)BMP2和BMP4的ECD分别为12 nM和345 nM。在TGFβ1的情况下()Agrin-Nterm使观察到的TGFβ1与TGF-βsRII在～2µM时的ECD的结合率降低了50%。
通过表面等离子共振监测Agrin-Nterm对BMP2、BMP4和TGFβ1与其同源受体胞外区结合的影响。A） BMPRIA的固定化ECD与40 nm BMP2与0 nm、12 nm、29 nm、58 nm、88 nm、146 nm和293 nm Agrin-Nterm预培养相互作用的传感器组图。B） BMPRIA固定化ECD与40 nm BMP4相互作用的传感器组图，BMPRIA与0 nm、220 nm、440 nm、660 nm和880 nm的Agrin-Nterm预先孵育。C） TGF-βsRII的固定化ECD与4 nm TGFβ1与0 nm、912 nm、1824 nm、2736 nm和4560 nm Agrin Nterm预孵育的相互作用的传感图。生长因子与Agrin-Nterm在20 mM HEPES缓冲液中预先孵育，pH值为7.5，含有150 mM NaCl、5 mM EDTA、0.005%吐温20，室温下孵育30分钟，并通过含有固定化受体ECD的CM5传感器芯片注入。为了清楚起见，面板中未显示Agrin-Nterm的浓度；在每种情况下，SPR反应都随着Agrin-Nterm浓度的增加而降低。右边的面板显示了Agrin-Nterm抑制作用的浓度依赖性，通过观察到的关联率的变化来监测，k光突发事件.
我们希望指出，SPR分析中确定的亲和力之间存在分歧，其中一个相互作用的伙伴被固定（参见)以及在溶液竞争分析格式中确定的亲和力。由于通过开速率和关速率测定结合常数的标准方法可能无法重现溶液中的结合常数[22]，我们假设从后面的实验中得出的结论具有更大的生物学相关性。
为了检查Agrin-Nterm与BMP2、BMP4和TGFβ1的相互作用是否干扰这些生长因子的信号传递活性，我们研究了Agrin-Nterm在报告分析中的影响。
Agrin-Nterm对BMP2、BMP4和TGFβ1生长因子活性的影响
如所示，Agrin-Nterm能有效抑制BMP2的活性()和BMP4()在荧光素酶报告物分析中，分别通过～0.5µM和～0.6µM Agrin-Nterm达到一半最大抑制。
Agrin-Nterm对生长因子活性的影响。A组）HepG2-BRA细胞与不同浓度Agrin-Nterm预孵育的250 pM BMP2孵育17小时。B组）HepG2-BRA细胞与不同浓度Agrin-Nterm预孵育的250 pM BMP4孵育17小时。C组）水貂肺上皮细胞MLEC-clone32与不同浓度Agrin-Nterm预孵育的16 pM TGFβ1孵育17小时；荧光素酶活性归一化为微孔的蛋白质含量，并减去从对照细胞获得的背景值。图中显示了三个平行实验的平均值。
与BMP2和BMP4相比，在TGFβ1的情况下，Agrin-Nterm即使在使用的最高浓度（1µM）下也不能引起抑制；有趣的是，Agrin-Nterm使TGFβ1活性略有增加().
农业基因进化史
我们已经证明，脊椎动物agrin的真正同源基因存在于Placozoa的基因组中(丝盘虫)，线虫(秀丽隐杆线虫,线虫)，一些节肢动物(蜜蜂,栗Tribolium castaneum)、回声节点(紫斑圆线虫)和尿脊索动物(肠蝉); 看见表S1有趣的是，在完全测序的黑腹果蝇和假牛果蝇.
农业综合征存在于丝盘虫以及线虫和节肢动物表明，agrin的共同祖先出现在Placozoa和Bilateria的分化之前。不同后生动物群agrin结构域的比较（参见)表明这些聚合蛋白的共同祖先已经有一个N末端层粘连蛋白结合域、卵泡抑素-结构域、EGF结构域和层粘连素G结构域。卵泡抑素结构域的串联复制、层粘连蛋白EGF和SEA结构域的获得导致了脊椎动物聚集蛋白的结构域组织特征（参见和图S1,S2系列,第3章,S4系列,第5章,S6系列).
无脊椎动物和脊椎动物agrin序列的比较也表明，脊椎动物aglin的AchR聚集活性所必需的序列基序在脊椎动物agins中高度保守，但在无脊椎动物agnis中不保守（参见,图S7和图S8)这表明在脊椎动物进化的基础上，agrin的生物功能发生了重大变化。
类似地，神经胰蛋白酶裂解位点在脊椎动物中高度保守[23]在无脊椎动物中不保守。脊椎动物agrins中含有所谓的α神经胰蛋白酶切割位点的区域(图S9)在无脊椎动物agrins中没有等效物（参见). 脊椎动物agrins的β神经胰蛋白酶裂解位点位于第四EGF和第三LaminingG结构域之间的C末端区域（参见). 平衡区的排列显示只有脊椎动物的β神经胰蛋白酶裂解位点具有高度的保守性(图S8). 必须指出的是，无脊椎动物中神经胰蛋白酶裂解位点缺乏保护，这与神经胰蛋白酶仅限于脊椎动物这一事实是一致的[24]因此，这些结果表明，神经胰蛋白酶对agrin生物功能的控制仅在脊椎动物中进化，与agrin AchR聚集活性的进化平行。
讨论
agrin的N末端结合TGFβ家族成员
我们观察到agrin与BMP2、BMP4和TGFβ1结合，扩大了与TGFβ家族成员有亲和力的含卵泡抑素域蛋白的列表。卵泡抑素及其相关基因（FLRG）编码的蛋白结合并抑制激活素和GDF8/肌抑素[25]–[28]这些蛋白质与其他TGFβ家族成员（包括TGFβ1、BMP4、BMP6和BMP7）相比，对激活素表现出强烈的优先结合[29],[30]多域蛋白WFIKN1和WFIKN2的卵泡抑制素域似乎对GDF8/myostatin和密切相关的GDF11具有特异性[17],[31]而对于agrin，首选配体是BMP2、BMP4和TGFβ1。
结合生长因子的蛋白质可能以多种方式控制其作用：如果它们阻止与细胞受体的结合，则它们可能充当抑制剂，它们可能充当生长因子的贮存器，它们可能将其作用定位在结合蛋白附近。这些效应之间的相互作用取决于各种相互作用伙伴的亲和力和浓度。因此，我们认为脊椎动物agrin结合生长因子可能具有多种功能：agrin可能是这些生长因子的储存库，可能定位其作用，也可能抑制其促生长活性。
agrin生长因子相互作用对神经肌肉接头和CNS突触发育的影响
显然，只有当TGFβ家族的生长因子也在控制突触发生中起作用时，agrin的生长因子结合活性才与其在神经肌肉接头的发育和维持中的作用相关。虽然对TGFβs在脊椎动物突触发生中的作用知之甚少，但值得注意的是爪蟾，雪旺细胞通过TGFβ1促进神经肌肉接头处的突触发生[32]在大鼠中，BMP2与交感神经元生长的调节有关[33]。根据我们的研究结果，似乎可以假设，作为生长因子结合蛋白的agrin可能会影响这些过程。同样，我们的发现可能与观察到的agrin的N末端半部分与agrin抑制神经突起生长的能力有关[16],[34]; 突触成功建立后，agrin的N末端半结合并抑制生长因子的促生长活性，从而抑制进一步的突起生长，这似乎是可能的。
就一些无脊椎动物而言，有明确证据表明TGFβ家族成员的信号传导在NMJ的形成中起着关键作用[35]。最具特征的信号通路，定义于果蝇属由Glass bottom boat（Gbb）触发，后者是一种与脊椎动物BMP相关的节肢动物蛋白。Gbb作为肌源性逆行信号，突触前激活TGFβ途径；这种途径包括II型受体的愿望思维、I型受体的粗静脉和萨克斯管。阻断该通路的突变导致小突触形态异常，功能严重受损。
我们的结果表明，在最近报道的agrin的这一区域在促进树突状和轴突丝状伪足（被认为是新突触的前体）方面的作用背景下，agrin结合生长因子的N末端部分可能特别有趣。对培养的神经元和非神经元细胞的研究表明，跨膜锚定的agrin促进丝状突起的形成[3],[4],[7],[8]并将这种作用的活性区域定位于含有卵泡抑素结构域的agrin的N末端[4],[8]人们很容易推测，agrin N末端部分的丝足类促进作用是由结合在该区域的生长因子介导的。
我们的发现是，agrin结合生长因子的N末端部分也可能对神经蛋白酶分解脊椎动物agrin具有重要的功能后果[23].神经蛋白酶对脊椎动物agrin的裂解（参见)将C末端区域（参与NMJ处的AchR聚集和中枢神经系统中树突状丝足的活性依赖性促进）与N末端部分分离（抑制神经突起生长，促进轴突和树突状丝足，此处显示参与生长因子结合）。通过活性依赖性蛋白水解切割来分离与这些区域相关的特定功能可能会改变农业蛋白不同调节功能之间的平衡。
脊椎动物的非神经组织，如肌肉、心脏、肾脏也表达agrin（在AchR聚集中不活跃的亚型），但对这些组织中agrin的功能知之甚少。我们认为这些agrin亚型可能作为生长因子结合蛋白发挥作用。
我们发现，agrin结合生长因子的N末端部分也对agrin在无脊椎动物中的生物学作用具有重要意义。尽管agrin起源于古代，但对其在无脊椎动物中的作用几乎一无所知。事实上黑腹果蝇和拟暗果蝇缺乏agrin基因（尽管其他节肢动物的基因组，如蜜蜂和栗Tribolium castaneum确实有典型的agrin）表明昆虫agrin对于突触发生过程是不可或缺的。
最近的结论是秀丽线虫agrin不参与突触发生[36]还警告说，分配给脊椎动物agrin的功能不一定对无脊椎动物aglin有效。在这方面值得注意的是，虽然在脊椎动物中高度保守，但在无脊椎动物中没有发现与AchR聚集活性有关的agrin亚型序列基序（参见,图S7和图S8). 同样，无脊椎动物的神经胰蛋白酶裂解位点缺失（参见和图S8)表明神经蛋白酶对agrin生物功能的控制仅在脊椎动物中进化，与agrin AchR聚集活性的进化平行。
事实上，在Placozoan有一个agrin同源基因丝盘虫，一种没有神经和肌肉细胞的简单生物体[37]，清楚地表明古代agrin具有脊椎动物突触发生特征以外的功能。我们认为，agrin作为一种生长因子结合蛋白的生物学功能可能比其参与突触发生更古老、更普遍。应该注意的是丝盘虫具有TGFβ家族的多个成员，并且TGFβ信号通路的所有基本成分也存在于旋毛虫基因组中[37].
支持信息
表S1
无脊椎农业。该文件包含无脊椎动物物种序列分析丝盘虫,蜜蜂秀丽隐杆线虫,栗Tribolium castaneum,紫斑圆线虫,肠蝉根据正文中描述的标准，它们是脊椎动物农业蛋白的直系同源物。
（0.28 MB PDF格式）
图S1
agrins的NtA-域多重比对。缩写为：agrin_triad_nta-nta的agrin域丝盘虫; agrin_caeel_nta-的agrin的nta域秀丽隐杆线虫; agrin_strpu_nta-的agrin的nta域紫斑圆线虫; agrin_cioin_nta-的agrin的nta域肠蝉; agrin_danre_nta-的农业蛋白的nta结构域达尼奥雷里奥; agrin_chicken_nta-的agrin的nta域五倍子; agrin_mouse_nta-的agrin的nta域小家鼠; agrin_human_nta-的agrin的nta域智人.
（0.02百万PDF）
图S2
agrins卵泡抑素结构域的多重比对。缩写为：agrin_triad_fs1，agrin_trid_fs2-丝盘虫; agrin_caeel_fs1，agrin_ceael_fs2-的前两个follistatin域秀丽隐杆线虫; agrin_apime_fs1，agrin_apinme_fs2-的agrin的前两个follistatin域蜜蜂; agrin_strpu_fs1，agrin_stropu_fs2-的agrin的前两个follistatin域紫斑圆线虫; agrin_cioin_fs1，agrin_coin_fs2-的agrin的前两个follistatin域肠蝉; agrin_chick_fs1，agrin_cchick_fs2-的前两个卵泡抑制素域五倍子; agrin_rat_fs1，agrin_ras2-的agrin的前两个follistatin域褐家鼠.
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图S3
agrins EGF-结构域的多重比对。缩写为：agrin_triad_egf1、agrin_trid_egf2、agrin.triad_ecf3、agrin_triad_edf4-丝盘虫; agrin_strpu_egf1、agrin_stropu_egf2、agrin_strpu_ergf3-的agrin的EGF域紫斑圆线虫; agrin_cioin_egf1、agrin_coin_egf2、agrin_cioin_ergf3-的agrin的EGF域肠蝉; agrin_rat_egf1、agrin_rat_egf2、agrin_rat_egf3、agrin.rat_egf2-的agrin的EGF域褐家鼠.
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图S4
agrins层粘连蛋白G结构域的多重排列。缩写为：agrin_triad_lamg1、agrin_trid_lamg2、agrin_triad_lamg 3、agrin.triad_lamag4、agrin-triad_lamg5、agrin/triad_lamb6-丝盘虫; agrin_apime_lamg1、agrin_appime_lamg2、agrin_apime_lamg 3-的agrin的层粘连蛋白G结构域蜜蜂; agrin_strpu_lamg1、agrin_stropu_lamg 2、agrin_strpu_lemg 3-的agrin的层粘连蛋白G结构域紫色圆线虫; agrin_human_lamg1、agrin_uman_lamg2、agrin_numan_lemg3-的agrin的层粘连蛋白G域智人.
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图S5
agrins层粘连蛋白EGF结构域的多重比对。缩写为：agrin_caeel_lamegf1，agrin_ceael_lamesgf2-层粘连蛋白EGF-秀丽隐杆线虫; agrin_apime_lamegf1，agrin_appime_lamegf2-的层粘连蛋白EGF-结构域蜜蜂; agrin_strpu_lamegf1，agrin_stropu_lagegf2-的层粘连蛋白EGF-结构域紫斑圆线虫; agrin_cioin_lamegf1、agrin_cioin_lamegf2-肠蝉; agrin_chick_lamegf1，agrin_cchick_lagegf2-的层粘连蛋白EGF-结构域五倍子; agrin_rat_lamegf1，agrin_rat_lamegf2-的agrin层粘连蛋白EGF-结构域褐家鼠.
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图S6
农业蛋白SEA域的多重排列。缩写为：agrin_cioin_sea-的agrin的sea域肠蝉，agrin_disom_sea-的agrin的sea域发现commata; agrin_danre_sea-的sea域的agrin达尼奥雷里奥; agrin_chick_sea-的agrin的sea域五倍子; agrin_human_sea-的agrin的sea域智人.
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图S7
多重比对显示脊椎动物agrins中受选择性剪接影响的第二个LamG结构域的一个区域：a/y剪接位点（参见). 缩写为：agrin_triad-agrin of丝盘虫; agrin_caeel-的agrin秀丽隐杆线虫; agrin_caebr-的agrin线虫; agrin_apime-的agrin蜜蜂; agrintrica-的agrin栗Tribolium castaneum; agrin_strpu-的agrin紫斑圆线虫; agrin_cioin-的agrin肠蝉; agrin_disom-的agrin发现commata; agrin_chick-的agrin五倍子; agrin_rat-的agrin褐家鼠; agrin_human-的agrin智人注意，脊椎动物agrins在a/y剪接位点（带下划线的位置）包含一个保守的四残基插入物KSRK；对基因组序列的分析表明，该基序在无脊椎动物agrins中缺失。
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图S8
脊椎动物agrins中受选择性剪接和神经蛋白酶裂解影响的区域的多重排列：B/z剪接位点和β神经蛋白酶裂解位点（参见). 该比对包括第四EGF域的C端部分和第三LamG域的N端部分。缩写为：agrin_triad-agrin of丝盘虫; agrintrica-的agrin栗Tribolium castaneum; agrin_apime-的agrin蜜蜂; agrin_cioin-农业肠蝉; agrin_disom-的agrin发现commata; agrin_chick-的agrin五倍子; agrin_rat-的农业蛋白褐家鼠; agrin_human-的agrin智人注意，脊椎动物agrins在B/z剪接位点（带下划线的位置）包含一个保守的八位插入物xLxNEIPx；基因组序列分析表明，该基序在无脊椎动物agrins中缺失。该比对还包括脊椎动物agrin的β神经胰蛋白酶裂解位点（箭头）（参见). 注意，在脊椎动物聚集蛋白中，β神经胰蛋白酶裂解位点是保守的（双下划线位置）；基因组序列分析表明，该基序在无脊椎动物agrins中缺失。
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图S9
脊椎动物agrins中受神经胰蛋白酶裂解影响的区域的多重排列（箭头）：α位点（参见). 缩写为：agrin_disom-的agrin发现commata; agrin_danre-的agrin达尼奥雷里奥; agrin_chick-的agrin五倍子; agrin_rat-的agrin褐家鼠; agrin_human-的agrin智人注意，在脊椎动物聚集蛋白中，α神经肽裂解位点是保守的（双下划线位置）；基因组序列分析表明，该基序在无脊椎动物agrins中缺失。
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