自噬。作者手稿；PMC 2010年5月20日提供。
以最终编辑形式发布为：
预防性维修识别码：项目经理2873687
美国国立卫生研究院：尼姆斯202169
目标删除自噬相关5(第5天)在细胞模型和小鼠中损害脂肪生成
药理学系；新泽西医学与牙科大学罗伯特·伍德·约翰逊医学院；美国新泽西州皮斯卡塔韦
†这些作者为这项工作做出了同等贡献。
摘要
哺乳动物白色脂肪细胞具有独特的结构，几乎整个细胞体积都被一个大的脂滴占据，而周围的细胞质占据的空间极小。参与这种独特细胞结构形成的大量细胞质重塑过程尚不明确。自噬是一种膜运输过程，导致细胞质成分的溶酶体降解。在这里，我们研究了第5天，一种编码自噬、细胞模型和小鼠脂肪细胞分化所需基本蛋白的基因。当诱导野生型原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）分化为脂肪细胞时，大量自噬被激活。重要的是，自噬缺陷的原代第5天-/-MEF显示出脂肪生成效率显著降低。时间推移显微镜显示第5天-/-MEF最初看起来分化正常；然而，大多数差异化第5天-/-细胞最终未能进行进一步的形态转化，最终可能通过凋亡而死亡。与这些体外结果一致，组织学分析显示第5天-/-晚期胚胎和新生幼鼠皮下紫苏素A阳性脂肪细胞较少。一直以来，当用氯喹（一种功能性自噬抑制剂）治疗时，野生型MEF显示出脂肪细胞分化效率的显著降低。综上所述，这些发现表明Atg5参与了正常脂肪细胞的分化，表明自噬在脂肪生成中起着重要作用。
关键词：Atg5、自噬、脂肪生成、WAT、脂肪细胞分化
介绍
肥胖在美国和其他工业化国家已经成为一种流行病。肥胖的直接原因是脂肪组织的过度积累。人类和其他哺乳动物含有两种类型的脂肪组织：白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT）。WAT是主要类型，起着燃料储存库（以甘油三酯的形式）和全身能量平衡的基本调节器的作用。1相反，BAT的主要功能是消散能量和产生热量，这是抵御寒冷的重要防御机制。2肥胖主要与皮下和内脏WAT的扩张有关。
WAT由白色脂肪细胞组成，通常认为来源于中胚层。脂肪生成，即脂肪细胞从成纤维细胞样前脂肪细胞发育而来，已经得到了很好的研究。对白色前脂肪细胞系3T3-L1的广泛研究表明，脂肪生成过程由PPARγ起核心作用的转录因子网络协调调节。三-6激素诱导后，原代MEF经历与3T3-L1细胞非常相似的脂肪生成过程，最终形成具有一个或多个大脂滴的成熟脂肪细胞。来自不同遗传背景小鼠的主要MEF提供了一个额外有用的细胞模型，以确定感兴趣的基因在白色脂肪生成中的作用。7-10
虽然调控脂肪细胞分化的转录网络已被阐明，但有关脂肪生成的细胞过程以及它们在复杂分化过程中如何协调调控的情况尚不清楚。成熟哺乳动物的白色脂肪细胞具有高度独特的结构，其功能与其作为甘油三酯储存库的功能相一致，其中几乎整个细胞体积都被一个大的脂滴占据，而其他细胞成分，包括细胞核和细胞质，则位于外周并占据最小的空间。大量细胞重塑过程可能与脂肪生成有关，目前尚不明确。
自噬是一个主要的细胞降解过程。11,12它是由细胞质中出现的双膜结构引发的，该结构膨胀吞没并隔离部分细胞质，从而形成标志性的双膜自噬体。完全成熟的自噬体向溶酶体移位并与溶酶体融合。自噬体的货物随后被释放到溶酶体，在那里被降解。从酵母到人类，自噬的分子机制在进化上高度保守。13,14编码机器基本部件的基因被命名为自动变速箱(一u个t吨奥帕克y相关）基因已被鉴定。有针对性地删除自动变速箱基因，包括贝克林1(atg6),15,16 第5天,17,18和第7天,19,20已生成。这些小鼠模型表现出自噬缺陷，它们有助于确定哺乳动物自噬的各种功能，包括肿瘤抑制、神经元保护和在营养缺乏的新生儿期存活。最近的研究还表明，在某些细胞类型（如红细胞）的分化过程中，为了正常去除细胞器（如线粒体），需要自噬，21-23它参与肝细胞脂质滴的形成24和脂质代谢。25
自噬的降解功能促使我们假设自噬可能参与脂肪生成过程中的细胞质重塑。25年前，Novikoff等人用电子显微镜对分化的3T3-L1细胞进行形态学分析时，观察到自噬体水平增加，尽管当时无法对自噬进行分子表征。26在分子水平上对自噬机制的阐明以及各种小鼠遗传工具的可用性，使得确定各种自噬基因在脂肪生成中的功能作用成为可能。这个第5天该基因编码泛素样蛋白Atg12的受体蛋白Atg5。27Atg5与Atg12结合，形成多聚体结构，作为自噬膜成熟所需的平台。28在当前研究中，我们确定了目标删除对第5天MEF模型和体内脂肪生成。我们的研究表明第5天缺失干扰正常脂肪细胞分化，提示自噬在脂肪生成中起关键作用。
结果
脂肪细胞分化过程中野生型MEFs的自噬被激活
我们通过电子显微镜（EM）形态学研究以及自噬特异性标记物的分子特征分析了脂肪生成过程中原发性MEF中自噬的激活。类似于3T3-L1细胞中脂肪生成的诱导方案，最初的MEF首先生长到汇合处。汇合后两天，含有地塞米松（DEX）/3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）/曲格列酮/胰岛素的分化剂混合物5,29添加到培养基中诱导分化，时间记录为诱导的第0天。两天后（或诱导第2天），分化维持培养基（仅含胰岛素和曲格列酮）取代了原来的分化鸡尾酒。从那时起，每两天向细胞中添加一次新鲜的维持培养基，以替换旧培养基。用配有浮雕对比镜的显微镜监测细胞的分化情况，观察细胞的三维结构。如所示，野生型原代MEF中的脂肪生成动力学与3T3-L1细胞非常相似：在诱导的第2天，分离的细胞开始“膨胀”，从原来的扁平形态形成球状形态，微小的脂滴开始在球状细胞中积聚；在诱导分化的第6天，球状细胞形成小斑块，斑块中的每个细胞都含有许多小脂滴；随着分化的继续，更多的扁平细胞参与分化，呈现“膨胀”的球形形态；与此同时，小脂滴变大或相互融合；在第14天，大多数细胞形成“膨胀”的球状细胞斑块，其中许多含有一个或几个大的脂滴。
在脂肪生成过程中，自噬在野生型MEF中被激活。（A） 主要第5天+/+MEF被诱导用于脂肪生成。在指定的时间点，分析分化的进展。在配有浮雕对比物镜（低倍和高倍分别为10倍和40倍）的显微镜下观察细胞（Olympus IX70）。低放大率图片中的选定区域（在正方形内）以高放大率显示在下面。（B） 初级的电子显微镜分析第5天+/+如图所示，分化诱导后0、2或6天的MEF。上面板显示低倍率的显微照片，下面板显示上面板中选定区域（正方形）的高倍率。箭头表示自噬体。（C） 自噬体体积与细胞溶质的比值。如图所示，通过对分化诱导后0、2或6天细胞的15-20张显微照片进行点计数，确定自噬体和胞浆的体积***p<0.001。学生t-test。（D和E）。分化细胞的免疫印迹分析。在指定的时间点采集具有（D）或不具有（E）分化诱导的细胞，并使用LC3、Atg12、p62或RAN抗体进行免疫印迹分析，如图所示。RAN水平起到了装载控制的作用。这些数据是三个独立实验的代表性结果。
我们用电子显微镜分析了野生型原发性MEF脂肪生成过程中自噬体的形成。如所示用电镜分析分化诱导第0天、第2天和第6天细胞的超微结构，并定量自噬体的体积。诱导分化前（第0天），自噬体约占细胞质体积的1%。随着细胞脂肪生成，自噬体水平稳步增加。到第6天，自噬体占据了细胞质总体积（包括脂滴体积）的5%左右。
用特异性自噬分子标记物进一步分析了脂肪生成过程中的自噬激活。MAP-LC3是酵母Atg8蛋白的哺乳动物同源物。在自噬激活过程中，它在C末端被裂解，MAP-LC3的N末端部分与磷脂结合并转位到自噬体上。30被称为LC3-II的MAP-LC3加工形式的丰度反映了自噬体的稳态水平。30如所示（上图），LC3-II水平随着分化的进行而显著增加。为了证实自噬小体的增加也反映了功能性自噬降解的增加，通过测量p62的水平来分析自噬通量，p62是一种常见的自噬体货物，其降解反映了自噬流量的水平。30如所示脂肪生成诱导显著降低p62水平，表明自噬流量增加。
此外，我们还测量了与自噬相关的其他蛋白的水平。有趣的是，脂肪生成期间，Atg5-Atg12蛋白结合物的水平也显著增加(，中间）。重要的是，自噬小体形成、自噬通量和Atg5-Atg12结合的增加与脂肪生成特别相关。作为对照，当MEF未被诱导用于脂肪生成时，LC3-II水平随时间略有降低，ATG5-ATG12结合物水平和p62水平保持不变，如综上所述，这些结果表明，在经历脂肪生成的主要MEF中，自噬活性增加。
自噬缺陷原发性第5天-/-MEF在脂肪生成中的效率显著降低
然后，我们通过检测自噬对脂肪细胞分化的影响，研究了自噬在脂肪细胞分化中的功能作用第5天原发性MEF模型中脂肪生成缺失。纯合小鼠第5天删除(第5天-/-)发育过程中没有任何明显缺陷，出生时的孟德尔比率正常，但出生后第一天内死亡，部分原因是未能应对新生儿饥饿。18自噬的测量结果表明，正如预期的那样，自噬体的形成在肿瘤组织中不存在第5天-/-老鼠。18野生型和第5天-/-来自同一位孕妇E13.5胚胎的初级MEF被诱导用于脂肪生成。用浮雕对比镜显微镜监测分化进程。与野生型相比(第5天+/+)MEF经历了正常的脂肪生成，如图所示,第5天-/-细胞最初积累小脂滴，但在分化开始阶段后似乎变得惰性(). 这些具有小脂滴的细胞很难进入更高级阶段。在14天分化的任何给定时间，只有一小部分第5天-/-细胞表现出初始形态变化，呈球状形态，并有小到小的脂滴堆积。即使在14天分化结束时，也很少有细胞处于由一个或几个大的脂滴表示的更高级分化阶段。
自噬缺陷原发性第5天-/-MEF在脂肪生成中的效率降低。主要第5天+/+或第5天-/-MEF被诱导用于脂肪生成。在指定的时间点，分析分化的进展。（A） 在配有浮雕对比物镜（低倍和高倍分别为10倍和40倍）的显微镜下观察细胞（Olympus IX70）。低放大率图片中的选定区域（在正方形内）以高放大率显示在下面。（B） 细胞用脂质染料Bodipy 493/503染色，并在相差物镜（20X）下用显微镜观察。（C） 诱导分化后14天，用脂质染料油红O和苏木精对细胞进行染色，并在相差显微镜下观察。（D） 盖玻片上生长的细胞在指定的时间点用Oil Red-O染色，提取Oil Red-O并通过光谱测定。这些数据代表了来自三个独立繁殖亲本的四对独立胚胎的细胞实验结果。
脂肪堆积是脂肪细胞分化的标志。除了脂肪细胞分化的形态学特征外，我们还分析了第5天-/-诱导分化后的细胞及其野生型对应物。如所示在分化后的不同时间点，细胞被固定，并用Bodypy 493/503染色，这是一种荧光染料，专门染色细胞内的脂滴。随着分化的进行，在野生型细胞中观察到越来越多的脂质染色。相反第5天-/-即使在第14天，当大多数野生型细胞处于高级分化阶段时，也能观察到细胞。使用油红-O（Oil Red-O）对两种MEF之间的脂质积累差异进行量化，这是另一种能对脂滴进行特殊染色并可提取用于光谱测量的染料。如所示在分化14天结束时，观察到野生型和突变型细胞之间的油红-O染色存在非常显著的差异。在不同的时间点进行油红-O染色，并从细胞中提取染料以通过光谱进行定量。总结如下，的第5天-/-MEF在诱导分化时表现出明显的脂滴积累缺陷，这与形态学分析完全一致( 和 ).
在这些患者中观察到的脂肪生成缺陷第5天-/-细胞没有克隆特异性效应。在来自三对独立的育种亲本的四对MEF中观察到相同的表型。早期传代（第三代至第五代）的主要MEF用于脂肪细胞分化实验。我们还测试了前几段（第1至第2段）的MEF，以及后几段的MEF（第6至第8段）。虽然在野生型细胞和第5天-/-有趣的是，在所有传代细胞中，自噬缺陷对脂肪生成的抑制作用在早期传代细胞比晚期传代细胞要小（数据未显示）。这些结果表明，自噬缺陷继发的事件可能会随着时间的推移而累积，这可能会加剧自噬不足对脂肪细胞分化的直接影响。
分化野生型和非野生型的基因表达分析第5天-/-MEF公司
将诱导分化前细胞中基因的mRNA水平与诱导分化6天后野生型和第5天-/-MEF公司。首先，我们用寡核苷酸微阵列进行了基因表达谱分析实验。参与脂肪细胞分化的基因在野生型和第5天-/-单元格（未显示数据）。通过定量PCR分析确认了这些基因子集的表达水平，如野生型细胞中上调的大多数基因似乎也在第5天-/-细胞；然而，基因激活的程度在第5天-/-细胞。此外，脂肪生成的后期转录事件，如工厂4和脂滴包被蛋白基因，在第5天-/-细胞与早期转录事件相比，例如PPAR（购电协议）γ和化学需氧量α上调。尽管这些结果没有明确指出自噬与脂肪生成相互作用的特定事件，但他们确实在分子水平上证实了第5天-/-细胞发生脂肪生成。
脂肪生成标记基因子集表达的定量PCR分析。mRNA提取自第5天+/+和第5天-/-分化第0天或第6天的细胞，并通过定量PCR进行分析。图示显示了与正常化基因Wbp11NORM相比，每个脂肪生成相关基因的相对表达水平。*表示无法检测到的值。误差线表示一个标准偏差。
时间推移显微镜显示，脂肪细胞分化在初级阶段停滞第5天-/-MEF公司
为了确定脂肪细胞分化受到影响的阶段和缺陷的可能原因，我们制作了积极分化的电影第5天+/+和第5天-/-使用延时显微镜的MEF。显示从第三天开始的分化野生型细胞的两天电影（补充材料1和2）中选择的相框。在这段时间内，小的脂滴出现并积极融合并固结成较大的脂滴。是电影中的相框吗第5天-/-MEF与图中显示的野生型细胞在同一时间范围内与正在分化的野生型细胞相比，大多数正在分化第5天-/-电影开始时（第三天），细胞只积累了大量的微脂滴。引人注目的是，这些差异化第5天-/-细胞在此阶段停滞，无法在形态学上进一步进展。最终，这些细胞慢慢地失去了对邻近细胞的固定，开始在培养基中自由旋转，最终死亡(和补充材料3和4）。值得注意的是，在电影中，只有第5天-/-早期分化的细胞死亡，而未分化的细胞保持正常和存活。这些结果表明第5天在积累微小的脂滴时，功能可能不是脂肪生成开始所必需的，但它对脂肪生成的有效进展至关重要。因此，第5天缺失常常导致分化中止。
脂肪生成的时间推移显微镜分析第5天+/+和第5天-/-MEF公司。对原代MEF进行处理以诱导脂肪细胞分化。诱导后第三天，进行带浮雕对比镜的延时显微镜检查，以监测分化的进展。（A–D）是从两天的电影剪辑（分别补充材料1–4）中拍摄的画面，显示分化过程中持续的形态学变化。下面放大了（A和C）的正方形区域中的区域，以分别显示（B和D）中的细节。（B）中的白色箭头指向不断增长的脂滴；（C）和（D）中的黑色箭头指向正在进行流产分化的细胞。数据代表了三对独立MEF的实验结果。
差异化第5天-/-细胞的凋亡水平高于野生型细胞
为了确定分化过程中流产的细胞是否死于凋亡，我们进行了TUNEL分析，检测DNA断裂/碎片化，这是凋亡的标志。如所示、野生型和第5天-/-采用TUNEL法分析脂肪生成过程中不同时间点的主要MEF。这些细胞还与Bodypy 493/503共同染色，以监测脂肪生成。有趣的是，基本上所有TUNEL阳性细胞也是Bodypy 493/503阳性()这表明只有开始脂肪生成并开始积聚脂滴的细胞才容易发生凋亡。对于野生型细胞，在分化早期（第2天），有一小部分分化细胞发生了凋亡，如图所示随着分化的进行，经历凋亡的细胞减少。相反，差异化的百分比第5天-/-第6天发生凋亡的细胞明显高于野生型细胞。此外，凋亡细胞在分化细胞中所占的百分比在随后的时间点继续增加第5天-/-单元格。这些观察结果与并提示在细胞脂肪生成模型系统中，未能成熟的分化细胞最终会死于凋亡。
差异化第5天-/-MEF表现出较高的凋亡率。（A） 主要第5天+/+或第5天-/-MEF被诱导用于脂肪生成。分别用Bodypy 493/503染色（绿色）、DAPI染色（蓝色）和TUNEL分析（红色）分析分化和凋亡细胞死亡的进展。图片显示细胞在分化后第6天诱导。显示了具有代表性的低（比例尺为50μm）和高（比例杆为10μm）放大图片。（B） 在指定的时间点，TUNEL阳性细胞在Bodypy 493/503阳性细胞中的百分比定量。统计随机选取的区域中Body493/503阳性细胞总数、TUNEL阳性细胞总数和Body493/403阳性细胞总数，并计算百分比。这些数据是三个独立实验的代表性结果**p<0.01；学生t-test。
这个第5天-/-晚期胚胎和新生幼鼠皮下脂肪细胞较少
确定是否第5天缺失影响体内脂肪生成，我们分析了第5天-/-晚期胚胎和新生幼崽及其野生型对应物。如前所述第5天-/-小鼠在整个妊娠期发育正常，但总是在出生的第一天内死亡，部分原因是这些小鼠无法调动足够的内部营养物质来度过新生儿饥饿期。18我们分析了E18.5的脂肪细胞第5天+/+和第5天-/-胚胎以及出生后12小时内的幼崽。啮齿动物出生时的白色脂肪组织发育不良；然而，皮下区域可以观察到分散的白色脂肪细胞。在肩胛骨水平切割小鼠的横切面，在那里可以分析皮下白色脂肪细胞。用免疫荧光显微镜对组织进行检测，并检测其抗紫苏素A的抗体，紫苏素是一种定位于脂肪细胞脂滴膜上的蛋白质。显示胚胎皮下组织的免疫染色。这个第5天-/-与野生型脂肪细胞相比，胚胎相应皮下区域的紫苏素A阳性脂肪细胞仅占15%()，表明白色脂肪细胞的脂肪生成显著减少。同样，新生儿第5天-/-与野生型同窝幼崽相比，幼崽相应皮下区域的紫苏皂苷A阳性脂肪细胞显著减少(). 总之，这些结果表明第5天缺失影响体内脂肪生成。
这个第5天-/-小鼠皮下脂肪细胞较少。第5天-/-取胚胎（E18.5）和新生幼崽（出生后12小时内）及其野生型同窝幼崽，用免疫荧光显微镜分析肩胛骨水平的横切面，并用抗紫苏素A一级抗体和FITC-结合二级抗体进行分析。（A） 显示紫苏素A阳性脂肪细胞的胚胎皮下区域。（B） 新生幼鼠皮下区域显示紫苏糖苷A阳性脂肪细胞。（C） 量化（A）。统计并平均三个相邻肩胛骨切片皮下区域的周苷A阳性细胞总数。（D） 量化（B）。统计并平均三个相邻肩胛骨切片皮下区域的周苷A阳性细胞总数。这些数据是由两对独立的父母所生的三对独立的幼崽和三对父母所生三对胚胎得出的具有代表性的结果**p＜0.01***p<0.001。学生t-test。
自噬抑制剂氯喹阻断原发性MEF脂肪细胞分化
氯喹是FDA批准的一种治疗疟疾和类风湿关节炎的药物，它以溶酶体为靶点，并阻止自噬体与溶酶体的融合。31,32氯喹是一种有效的自噬抑制剂，在临床试验和实验室研究中广泛用于抑制自噬。31,32我们测定了氯喹对原代MEF脂肪细胞分化的影响。在含有或不含有10μM氯喹的情况下，对野生型原发性MEF进行处理以诱导脂肪生成，氯喹浓度可抑制自噬体与溶酶体的融合（从而增加自噬小体的细胞内水平，但抑制自噬通量（参考文献。32和)). 在此浓度下，氯喹对MEF几乎没有细胞毒性作用(). 如所示，通过形态学分析检测到氯喹显著抑制正常脂肪细胞分化。始终使用Bodypy 493/503进行脂质堆积分析()或油红-O()染色显示氯喹对脂肪细胞分化的抑制作用相同。总之，这些结果表明氯喹有效地抑制了原发性MEF模型中的脂肪生成。
氯喹显著降低了原发性MEF的脂肪生成效率。在联合或不联合治疗10μM氯喹（CQ）的情况下，诱导野生型原发性MEF进行脂肪生成。然后通过以下方法监测分化进程：（A）显微镜分析；（B） Bodypy 493/503染色脂质分析（诱导分化后14天）；（C） 通过油红-O染色光谱法进行脂质分析（诱导分化后14天）。（D和E）为对照组，表明氯喹无毒（D），在实验浓度下可有效抑制自噬体与溶酶体的融合，并抑制自吞噬通量（E）。（D） 与未经氯喹处理的细胞相比，用10μM氯喹治疗4天的野生型MEF进行Tunel分析。用10μM staurosporine（STS）处理6小时的细胞作为阳性对照。（E） 采集在不同时间点用或不用10μM氯喹处理的细胞，如图所示，用LC3、p62或RAN抗体进行免疫印迹分析。RAN水平起到了装载控制的作用。结果代表三个独立的实验*p<0.05；学生t检验。
讨论
白色脂肪细胞从成纤维细胞样前脂肪细胞分化而来，它们具有独特的细胞结构，其中几乎整个细胞都被一个大的脂滴占据。然而，在脂肪生成过程中参与细胞质重塑的细胞过程尚不清楚。在当前的研究中，我们使用一种白色脂肪生成细胞模型——初级MEF，证明了脂肪生成过程中诱导了大量自噬。此外，通过使用从第5天击倒老鼠，我们证明了第5天缺乏显著降低脂肪生成效率。我们进一步表明第5天缺失似乎没有显著影响脂肪生成的早期事件，包括PPAR-γ和CEBP基因的上调以及微小脂滴的积聚。然而，第5天缺失可能导致后期脂肪生成停滞，最终导致分化细胞凋亡。最后，我们证明了第5天缺乏影响体内脂肪生成。这些数据表明第5天功能对脂肪生成很重要，提示自噬参与脂肪生成。与这一概念一致，氯喹对自噬功能的药物抑制在细胞模型中阻止脂肪生成。
Atg5缺失导致脂肪生成流产的确切机制尚不清楚。脂肪生成后期的分化停滞和随后分化细胞的死亡可能是成功去除细胞质成分（包括线粒体）失败的结果。然而，最近的报道表明，Atg8可以定位于肝细胞脂滴表面24,25并可能促进脂滴的融合。24我们不能排除以下可能性：依赖于Atg5的Atg8脂质氧化和向脂肪细胞脂滴移位的缺陷可能导致液滴融合效率低下，这反过来又导致细胞模型中脂肪生成的缺陷。
如本文所述，脂肪生成可能是自噬活性极高的少数几个生理过程之一。诱导分化后第6天，电镜超微结构研究表明，分化细胞的细胞质体积中有5%以上是自噬体。如果从总细胞质体积中减去当时占细胞质50%以上的脂滴“惰性”体积，则分化细胞细胞质体积的10%以上是自噬体。与自噬体水平升高相一致，自噬通量增加。自噬被激活的机制尚不清楚。有趣的是，我们观察到分化细胞中Atg5-Atg12偶联物的显著增加。通常，Atg5-Atg12结合物不是一个速率限制因子，从基础水平增加自噬活性并不一定需要增加Atg5-Attg12结合体。30Atg5-Atg12结合物的急剧增加可能反映了这些分化细胞中自噬活性的大量增加，这可能已经超过了正常细胞水平的Atg5-Attg12结合体支持自噬体形成的能力。研究Atg5-Atg12结合物在脂肪细胞分化诱导后上调和/或稳定的机制将很有意义。
总之，我们首次证明了一个重要的自噬基因的缺失，第5天，在细胞模型和体内对正常脂肪生成的影响。这为深入了解脂肪生成过程中剧烈细胞质重塑的分子和细胞过程提供了新的机制。肥胖是脂肪细胞过度积累和膨胀直接导致的。有趣的是，脂肪细胞在整个成年期都会不断更新。33我们的结果是，灭活Atg5以及使用功能性自噬抑制剂氯喹治疗，可以显著减少细胞模型中的脂肪生成，也可能为调节脂肪组织的大小和细胞结构提供新的场所，从而干扰脂肪相关功能。
材料和方法
原发性MEF的脂肪细胞分化
MEF是由13.5天的胚胎第5天+/+,第5天-/-小鼠符合标准方案。简单地说，从子宫中取出整只小鼠胚胎，进行解剖，并取出头部、尾部、四肢和所有内脏器官。将胴体切碎，在PBS中洗涤，然后在2 ml 0.05%胰蛋白酶-EDTA（目录号25300-054，Invitrogen）中于37°C下振荡孵育20分钟。将消化后的细胞置于含有10%胎牛血清（FCS，100-106，Gemini Bio-Products）的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM，cat n°11960-069，Invitrogen）中的100-mm培养皿上，并在37°C的含5%CO的湿空气中培养2细胞生长24小时，直至培养物90%融合，然后分裂并传代。第三代至第五代的原代MEF细胞按照标准方案处理以诱导脂肪细胞分化。29简单地说，细胞接种在带有盖玻片的六孔板中，并繁殖到汇合处。48小时后（指定为第0天），使用含有10%胎牛血清、5μg/ml胰岛素（类别号I5500，Sigma）、1μM地塞米松（类别号D4902，Sigma-）、0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX，类别号I7018，Sigma.）和10μM曲格列酮（类别号T2573，Sigma:）的DMEM启动分化。启动两天后，用维持培养基（含有10%胎牛血清、5μg/ml胰岛素和10μM曲格列酮的DMEM）替换培养基。此后每两天更换一次新鲜的维护介质。在诱导后14天内的不同时间点收集细胞。
对于氯喹处理，将早期传代的野生型初级MEF接种在六孔板中。用10μM氯喹（cat n°C6628，Sigma）处理细胞，50%融合，并繁殖至完全融合。汇合后2天，用含有10μM氯喹的分化培养基诱导脂肪细胞分化。启动两天后，将培养基更换为包括10μM CQ在内的维持培养基。此后每两天更换一次含有10μM CQ的新鲜维护培养基。
EM和免疫印迹法测定自噬体
将分化细胞用2.5%戊二醛/4%多聚甲醛固定在指定的时间点，置于0.1M的二羧酸缓冲液中2小时。对样品进行处理，并在Reichert Ultracut E切片机上切割薄片（90 nm）。使用JEOL 1200EX透射电子显微镜在80 kV下观察截面。在飞利浦CM12（每个样品15–20张）中，以X6300的一次放大率随机取样拍摄显微照片。用点计数法定量自噬空泡的细胞质体积分数。34western印迹按标准方案进行。抗体来源为：MAP-LC3抗体：由Cocalico Biologicals（PA，US）使用重组大鼠MAP-LC3蛋白作为抗原制成；兔多克隆Atg12抗体：cat n°2011，细胞信号技术；兔多克隆Ran抗体：cat n°sc-1156，Santa Cruz；p62：一抗：豚鼠抗p62蛋白（cat n°03-GP62-C，American Research Products，Inc.）；二级：来自Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.的驴抗豚鼠多克隆抗体（目录号706-035-148）。
成像
在Olympus IX70显微镜下观察活细胞，使用浮雕对比物镜（10X或40X）和相位对比物镜。使用带有20倍相位对比物镜的通用显微镜Axioplan 2成像系统（美国纽约州卡尔蔡司）观察固定和染色细胞。对于延时显微镜，将细胞置于组织培养板上，并使用37°C和5%CO的Olympus IX70显微镜进行监测210倍浮雕对比物镜下的环境室。使用CCD摄像机（Model MicroMax；Princeton Instruments，Trenton，NJ，US）每隔5分钟采集一次图像，并使用IPLab软件（BD Biosciences Bioimaging，Rockville，MD，US）保存为图像堆栈。使用Image J软件（美国马里兰州贝塞斯达NIH）处理图像。
脂滴染色
身体
如前所述，用BODIPY 493/503（类别号D-3922，Invitrogen）对分化细胞进行染色。35简单地说，细胞培养玻片用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗一次，用3%多聚甲醛在PBS中在室温下固定30分钟，用PBS清洗四次，在室温下用10μg/ml Bodypy 493/503在黑暗中染色15分钟，然后用Vectashield安装介质（类别号H-1000，Vector Laboratories）安装。
油红-O
根据Kim等人的说法，盖片上的细胞用Oil Red-O（类别号：O0625，Sigma）染色，并做了一些修改。36将Oil Red-O溶于异丙醇中至3.5 mg/ml。使用前，用四份H稀释六份Oil Red-O原液2O、 在室温下放置20分钟，并通过0.2μm过滤器过滤。用PBS清洗载玻片一次，用PBS缓冲福尔马林（类别号00740，Surgipath Medical Industries，Inc.）固定1小时，然后用60%异丙醇清洗两次，每次5分钟。然后将细胞风干，并在25°C下用油红-O工作溶液染色30分钟。对于，玻片用苏木精复染1分钟。为了量化染色，用含有4%NP-40的异丙醇从玻片上的细胞中提取油红O，然后在520 nm的波长下测量光密度（OD）。
cDNA扩增与实时定量PCR
根据标准方案，使用TRIzol试剂（cat n°15596-026，Invitrogen）从细胞培养裂解液中提取RNA。随后的RNA质量评估、cDNA扩增和定量RT-PCR反应由新泽西州皮斯卡塔韦罗格斯大学环境与职业健康科学研究所（EOSHI）的生物技术研究中心（BRTC）进行（详细方案见http://eohsi-brtc.com). RNA质量通过安捷伦生物分析仪2100（安捷伦科技公司，加州圣克拉拉）电泳和cDNA合成前的分光光度分析进行评估。使用每个样品中5至20 ng的总RNA生成高保真cDNA，用于定量PCR。使用Ribo-SPIA（NuGen，San Carlos，CA）线性扩增过程生成“反义”cDNA。使用SPIA过程（加利福尼亚州圣卡洛斯NuGen）扩增cDNA，并使用1:200稀释的扩增cDNA产物进行后续QPCR分析。
选择六个与脂肪细胞分化相关的基因进行实时定量PCR分析，以验证微阵列分析的结果。Gpam公司,Cebpa公司,Pparg公司,工厂4,阿格帕特2和普林被确定为分析的候选基因，另外两个基因Ube23DNORM和Wbp11NORM被选为PCR反应的标准化因子。使用Taqman化学和使用Roche Universal Probe Library设计算法设计的探针和引物检查基因表达(www.universalprobelibrary.com). 探头设计结果如下：Gpam公司，左引物GAG GCA AGG ACA TTT ATG TGG和右引物GGT GCT TTC ACA ATC ACT CG；Cebpa公司，左引物CTG GCT CTG GGT CTG GAA和右引物AGC CAC AGG GGTGTG TGT A；Pparg公司，左引物CTC TCA GCT GTT CGC CAA G和右引物CAC GTG CTC TGT GAC GAT CT；工厂4，左引物GCA CGG TCT CTC TGC AAT C和右引物ACA ATC AAT CAG CGC AGG A；Ucp1单位，左引物CCA GTG GAT GTG GTA AAA ACA A和右引物CAC AGC TTG GTA CGC TTG G；阿格帕特2，左引物TTC CCA CCT CAA GCC TGT和右引物TGC CTT GTG GTC TTG TGG；普林，左引物CTC CGG CCT TTC CTC TCT A和右引物GGG GGA GTG ATG ACA TGG；Ube23NORM，左引物TTA GTG ATT TGG CCC GTG A和右引物TGG CTT GCC AAT GAA ACA T；和Wbp11NORM，左引物GAG CAA TGT CCA CTG TCA GG和右引物ATC CCA GCA GGC AAA CAT。以下用于探针生成的染料组合用于检测和数据归一化：FAM（用于感兴趣的基因）、HEX（用于归一化基因）和BHQ1（非荧光猝灭剂）和ROX（参考）。所有探针均为根据每个分析设计指定的从罗氏通用探针库中选择的8个MGB探针。在比较分析之前，进行了验证实验，以确定为感兴趣基因和Wbp11NORM和Ube23DNORM设计的分析的相对效率，这些基因随后用作比较分析的参考基因。所有反应均一式三份，实验重复三次。所有反应均在ABI 7900（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）中进行，循环参数如下：50°C的1个循环（2分钟），然后是95°C（10分钟），95°C的40个循环（15秒），最后是60°C（1分钟）。在每个循环的每个温度阶段收集数据，并使用序列检测软件（Applied Biosystems，Foster City CA）进行分析，同时使用比较阈值循环（CT）方法进行相对定量。相关基因的表达水平表示为与控制基因Wbp11NORM mRNA水平的相对水平。
标记法
用PBS缓冲福尔马林将生长在载玻片上的分化细胞固定15分钟。根据制造商的说明，使用TMR红色原位细胞死亡检测试剂盒（货号：12 156 792 910，罗氏应用科学公司）进行TUNEL分析。在安装载玻片并在显微镜下拍照之前，用BODIPY 493/503（10μg/ml）和DAPI（1μg/ml，目录号D9564，Sigma）对载玻片进行10分钟的反染色。在随机选择的区域中，对带有Bodypy 493/503信号（绿色）的分化细胞进行计数，并在这些细胞中对带有TUNEL阳性信号（红色）的细胞进行计数。计算分化细胞中凋亡细胞的百分比。对于氯喹治疗实验，通过Coulter Cytomics FC500流式细胞仪（Beckman Coulter，CA，US）对凋亡细胞群进行量化。
免疫荧光分析
E18.5小鼠胚胎和新生小鼠（出生后12小时内）被处死，用PBS缓冲福尔马林固定，并包埋在石蜡中。通过PCR进行基因分型后，18在肩胛骨水平切取横断面。37根据标准方案进行免疫荧光检测。简单地说，用二甲苯将切片脱蜡，并通过分级乙醇进行再水化。在95–99°C的10 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）中进行抗原揭膜10分钟。让载玻片在室温下冷却30分钟，并用H冲洗2O和PBS。用PBS/Triton中5%的山羊血清封闭标本1小时，然后在4°C下用Perilipin A抗体（1998年，Sigma，1:50稀释）孵育过夜。为了进行免疫染色检测，将载玻片与二级抗体FITC-山羊抗狂犬病IgG（cat n°62-6111，Invitrogen，1:100稀释）孵育1小时，用PBS冲洗，并用Vectashield固定培养基（cat n°H-1000，Vector Laboratories）固定。使用带有100倍相位对比物镜的通用显微镜Axioplan 2成像系统（美国纽约州卡尔蔡司）拍摄照片。使用Adobe Photoshop软件（加利福尼亚州圣何塞市Adobe Systems公司）测量图片中脂滴的直径。
致谢
我们感谢Noboru Mizushima博士提供第5天敲除小鼠，Loren Runnels博士和Li-Ting Su博士协助显微镜检查，Dawn L.Brasaemle博士协助脂肪细胞分化，Raj Patel协助EM技术，Adam Oberstein制作重组MAP-LC3蛋白，Andrew Brooks博士协助实时PCR分析，所有Jin实验室成员进行富有成效的讨论。R.B.由NIH 5 F31 GM078857-02支持，Y.Z.、P.C.和S.J.由NIH 1R01 CA116088-01A1和1R01AG030081-01A1支持。
工具书类
1Rosen ED，Spiegelman BM。脂肪细胞是能量平衡和葡萄糖稳态的调节器。自然。2006;444:847–53. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 2Cannon B，Nedergaard J.Brown脂肪组织：功能和生理意义。生理学评论。2004;84:277–359.[公共医学][谷歌学者] 4Hansen JB，Kristiansen K。控制白色与棕色脂肪细胞分化的调节电路。生物化学杂志。2006;398:153–68. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5.Rosen ED、MacDougald OA。脂肪细胞由内而外分化。Nat Rev Mol细胞生物学。2006;7:885–96.[公共医学][谷歌学者] 6Rosen ED、Walkey CJ、Puigserver P、Spiegelman BM。脂肪生成的转录调控。基因发育。2000;14:1293–307.[公共医学][谷歌学者] 7.Chen PL、Riley DJ、Chen Y、Lee WH。视网膜母细胞瘤蛋白通过与C/EBP的直接相互作用积极调节终末脂肪细胞分化。基因发育。1996;10:2794–804.[公共医学][谷歌学者] 8Kubota N、Terauchi Y、Miki H等。PPARgamma介导高脂饮食诱导的脂肪细胞肥大和胰岛素抵抗。分子细胞。1999;4:597–609.[公共医学][谷歌学者] 9Sue N、Jack BH、Eaton SA等。基本克鲁珀样因子基因（Klf3）的靶向破坏揭示了其在脂肪生成中的作用。分子细胞生物学。2008;28:3967–78. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 10Wu Z，Rosen ED，Brun R，等。C/EBPα和PPARgamma的交叉调节控制脂肪生成和胰岛素敏感性的转录途径。分子细胞。1999;三:151–8.[公共医学][谷歌学者] 11自噬：在不到十年的时间里从现象学到分子理解。Nat Rev Mol细胞生物学。2007;8:931–7.[公共医学][谷歌学者] 12莱文B，克林斯基DJ。自我暗示的发展：自噬的分子机制和生物功能。开发单元。2004;6:463–77.[公共医学][谷歌学者] 13水岛N.自噬：过程和功能。基因发育。2007;21:2861–73.[公共医学][谷歌学者] 14.Ohsumi Y，Mizushima N。两个泛素样结合系统对自噬至关重要。精液细胞开发生物学。2004;15:231–6.[公共医学][谷歌学者] 15Qu X，Yu J，Bhagat G，等。通过杂合性破坏beclin 1自噬基因促进肿瘤发生。临床投资杂志。2003;112:1809–20. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Yue Z、Jin S、Yang C、Levine AJ、Heintz N.Beclin 1是早期胚胎发育所必需的自噬基因，是一种单倍体抑癌基因。美国国家科学院程序。2003;100:15077–82. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 17Hara T、Nakamura K、Matsui M等。抑制神经细胞的基础自噬会导致小鼠的神经退行性疾病。自然。2006;441:885–9.[公共医学][谷歌学者] 18Kuma A，Hatano M，Matsui M等。自噬在新生儿饥饿早期的作用。自然。2004;432:1032–6.[公共医学][谷歌学者] 19小松M、瓦古里S、千叶T等。中枢神经系统中的自噬丧失会导致小鼠的神经退化。自然。2006;441:880–4.[公共医学][谷歌学者] 20Komatsu M、Waguri S、Ueno T等。Atg7缺陷小鼠饥饿诱导和结构性自噬的损伤。细胞生物学杂志。2005;169:425–34. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21Kundu M，Lindsten T，Yang CY，et al.Ulk1在网织红细胞成熟过程中线粒体和核糖体的自噬清除中起着关键作用。鲜血。2008;112:1493–502. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 22.Sandoval H、Thiagarajan P、Dasgupta SK等。尼克斯在红细胞自噬成熟中的重要作用。自然。2008 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23Schweers RL、Zhang J、Randall MS等。NIX是网织红细胞成熟过程中程序性线粒体清除所必需的。美国国家科学院程序。2007;104:19500–5. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 24Shibata M、Yoshimura K、Furuya N等。MAP1-LC3结合系统参与脂质滴的形成。生物化学与生物物理研究委员会。2009;382:419–23.[公共医学][谷歌学者] 25.Singh R，Kaushik S，Wang Y，等。自噬调节脂质代谢。自然。2009;458:1131–5. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 26Novikoff AB、Novikoft PM、Rosen OM、Rubin CS。培养的3T3-L1前脂肪细胞中的器官关系。细胞生物学杂志。1980;87:180–96. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Mizushima N、Noda T、Yoshimori T等。自噬所必需的蛋白质结合系统。自然。1998年9月24日；395:395–8.[公共医学][谷歌学者] 28Mizushima N、Ohsumi Y、Yoshimori T.哺乳动物细胞中的自噬体形成。细胞结构功能。2002;27:421–9.[公共医学][谷歌学者] 29Banks AS，Li J，McKeag L等。SOCS7的缺失导致胰岛素作用增强和胰岛扩大。临床投资杂志。2005;115:2462–71. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30水岛N.监测自噬的方法。国际生物化学与细胞生物学杂志。2004;36:2491–502.[公共医学][谷歌学者] 31阿马拉瓦迪RK，汤普森CB。治疗诱导的自噬和坏死在癌症治疗中的作用。临床癌症研究。2007;13:7271–9.[公共医学][谷歌学者] 32Amaravadi RK，Yu D，Lum JJ，等。在Myc诱导的淋巴瘤模型中，自噬抑制增强治疗诱导的凋亡。临床投资杂志。2007;117:326–36. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 33Spalding KL、Arner E、Westermark PO等。人类脂肪细胞周转动力学。自然。2008;453:783–7.[公共医学][谷歌学者] 34Komatsu M，Wang QJ，Holstein GR，等。自噬蛋白Atg7在维持轴突稳态和预防轴突变性中的重要作用。美国国家科学院程序。2007;104:14489–94. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 35DiDonato D，Brasaemle DL。免疫荧光显微镜研究脂滴的固定方法。组织化学与细胞化学杂志。2003;51:773–80.[公共医学][谷歌学者] 36.Kim YK，Choi HY，Kim NH，等。逆转素刺激3T3-L1细胞的脂肪细胞分化并下调Akt和p70（s6k）信号通路。生物化学与生物物理研究委员会。2007;358:553–8.[公共医学][谷歌学者] 37Oishi Y、Manabe I、Tobe K等。Kruppel-like转录因子KLF5是脂肪细胞分化的关键调节因子。单元格元数据。2005;1:27–39.[公共医学][谷歌学者] 
