跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
单元格。作者手稿；PMC 2011年4月30日提供。
以最终编辑形式发布为：
单元格。2010年4月30日；141(3): 432–445.
数字对象标识：2016年10月10日/j.cell.2010.03.030
预防性维修识别码：项目经理2864022
美国国立卫生研究院：美国国家卫生研究院193332
PMID：20434984

c-Myc调节转录暂停释放

彼得·B·拉尔,1 查尔斯·Y·林,1中，2 艾米·塞拉,三，4 瑞安·A·弗林,三 斯科特·麦奎因,1 克里斯托弗·B·伯格,2 菲利普·夏普,2,三和理查德·A·杨1中，2,*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

通过特定的DNA结合转录因子将RNA聚合酶II（Pol II）转录起始装置招募到启动子是基因表达的关键调控步骤。我们在此报告，启动子近端停顿是Pol II在哺乳动物细胞中转录的一个普遍特征，因此是基因表达调控的另一个步骤。这表明一些转录因子将转录器招募为启动子，而其他转录因子则影响启动子近端暂停释放。事实上，我们发现转录因子c-Myc是细胞增殖的关键调节因子，在Pol II暂停释放中起主要作用，而不是在其靶基因中招募Pol II。我们讨论了这些结果对c-Myc扩增在人类癌症中的作用的影响。

介绍

转录调控是控制细胞基因表达程序的基础。通过特定的DNA结合转录因子将RNA聚合酶II（Pol II）转录起始装置招募到启动子，通常被认为是大多数真核基因选择性转录的关键调节步骤(Hochheimer和Tjian，2003年；Ptashne和Gann，1997年；罗德，2005年). 在转录器募集之后，可能会发生额外的调节步骤，已知这些步骤在控制基因子集的表达方面起着重要作用(Core和Lis，2008年；Margaritis和Holstege，2008年；Peterlin和Price，2006年)。

Pol II启动子近端暂停是一种启动后调节事件，已在少数基因中进行了深入研究。为了便于讨论，将使用启动子-近端暂停来描述事件，包括衰减、停滞、平衡、终止伸长和启动子-最近端终止。这个果蝇Hsp70在向伸长过渡之前，基因通过启动子的募集和启动子近端暂停来调节(Gilmour和Lis，1986年；O'Brien和Lis，1991年；Rougvie和Lis，1988年). 在一些人类基因中也可以检测到暂停的Pol II分子(宾利和格鲁丁，1986年；Espinosa等人，2003年；Sawado等人，2003年). 在通过启动子近端暂停调节的基因中，暂停因子DRB敏感性诱导因子（DSIF）和负延伸因子（NELF）在转录起始位点（TSS）的下游产生Pol II暂停(Wada等人，1998年a；山口等，1999年). 某些序列特异性转录因子可能会向这些基因募集暂停释放因子，如正转录延伸因子b（P-TEFb）(Barboric等人，2001年；Core和Lis，2008年；Eberhardy和Farnham，2001年,2002；金泽等人，2003年；Peterlin和Price，2006年)。

最近的报告表明，启动后调控对于后生动物蛋白质编码基因子集的转录控制非常重要。例如，在人类胚胎干细胞中，大约30%的基因经历转录起始，但没有进一步延伸的证据(Guenther等人，2007年). 这些结果表明，启动装置募集后的调节步骤是这些基因转录控制的关键。虽然经历转录起始而非延伸的基因是少数，但最近发现Pol II可以在正反义方向启动转录(Core等人，2008年；Seila等人，2008年)，表明启动子可能需要更普遍的启动后调节步骤，如果只是为了防止未调节的反义转录。

我们在这里报告的证据表明，启动子近端停顿通常发生在ES细胞、完全转录的基因以及经历起始但没有延伸的基因中。在Pol II可检测水平的基因中，ChIP-Seq数据显示，大多数酶通常与暂停因子DSIF和NELF一起占据启动子近端区域的DNA。暂停释放因子P-TEFb的抑制导致Pol II在全基因组中保留在这些位点。因为c-Myc在ES细胞自我更新和增殖中起关键作用(Cartwright等人，2005年)并能结合肿瘤细胞中的暂停释放因子P-TEFb(Eberhardy和Farnham，2001年,2002；Gargano等人，2007年；金泽等人，2003年)，我们研究了c-Myc是否具有调节ES细胞暂停释放的功能。我们的结果表明，c-Myc在ES细胞中大量活跃转录基因的暂停释放而非Pol II募集中起着关键作用。

结果

Pol II倾向于占据启动子区域

我们使用染色质免疫沉淀结合高通量测序（ChIP-seq）来确定Pol II如何占据ES细胞基因组(图1,表S1、S2). 使用了一种与Pol II（N-20）最大亚单位的N末端结合的抗体，使我们能够独立于其C末端结构域（CTD）的磷酸化状态来监测Pol II。我们发现Pol II的大部分占据了绝大多数基因的启动子近端区域(图1A). 这种占据启动子近端区域的趋势对于积极转录的基因（具有H3K4me3-和H3K79me2-修饰核小体）和显示起始但不延伸证据的非生产性基因（具有H1K4me2-修饰的核小体，但不具有H3K 79me2-）都很明显。在活跃转录的基因中，在整个转录区域到多聚腺苷酸化位点观察到低水平的Pol II信号，在转录终止的下游观察到较高的信号。这些数据与启动子和终止子区域的占据时间比活性转录基因的中央体更长一致。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms193332f1.jpg
Pol II的全基因组占用率

（A） 通过ChIP-seq分析确定mES细胞中RNA Pol II（全部）、RNA Pol II Ser5P和RNA Pol II Ser2P的占有率。代表性活性基因的富集（卢比3）和非生产性基因（7岁以上）如图所示。每个Pol II形式的全基因组结合平均值（内含子未描绘）显示在50bp的箱子中，以显示从转录起始位点上游2kb到每个注释基因末端下游2.5kb的转录单元的一般结合模式。

（B） 描述用于确定mES细胞中每个Pol II结合基因的移动比率（TR）的计算的示意图。启动子近端bin使用注释起始位点周围−30bp到+300bp的固定窗口定义。转录区（基因体）bin从+300bp到注释端。TR是启动子近端bin中Pol II密度与转录区bin中的Pol II浓度之比。

（C） 具有给定TR的Pol II结合基因百分比的分布。大约91%的基因的TR大于2，表明大多数Pol II连接基因在启动子近端区域比下游转录区域具有更多的PolⅡ。另请参见图S1。

启动子区域相对于基因体存在高聚合酶密度，以前曾被引用为启动子近端暂停或启动后调控的证据大肠杆菌,果蝇属和人类细胞(Fuda等人，2009年；价格，2008；韦德和斯特鲁尔，2008年). 我们观察到的Pol II结合模式表明，mES细胞中经常出现启动子近端停顿。为了进一步表征Pol II在mES细胞中的占有率，我们计算了启动子近端区域和基因体中Pol II密度的相对比率(图1B)称为行程比（TR）(Reppas等人，2006年)或暂停指数（Zeitlinger等人，2007）。在启动子-近端清除率与启动率相似的基因中，TR接近1(Reppas等人，2006年). 然而，在启动子近端清除率低于启动率的基因处，TR大于1。使用这一指标，我们发现91%的基因的Pol II TR大于2，证实在绝大多数基因的启动子近端区域检测到的PolⅡ密度高于基因体(图1C,S1，表S3). 大多数活性ES细胞基因的启动子区域存在高聚合酶密度，这表明这些基因经历了某种形式的启动后调控。

Pol II的大亚单位包含一个C末端结构域（CTD），该结构域在转录的不同阶段被修饰；Pol II被低磷酸化CTD募集到起始前复合物中，CTD在起始过程中在丝氨酸5（Ser5P）上磷酸化，然后在延伸过程中在丝氨酸2（Ser2P）上磷酸化(Fuda等人，2009年). 为了确定Pol II的这两种磷酸化形式是如何占据ES细胞基因的，ChIP-Seq实验使用了针对这两种CTD磷酸化形式的抗体进行(图1A). Ser5P Pol II在启动子区和活性基因转录区检测到，峰值位于启动子近端区域。对于经历起始而非延伸（非生产性）的基因，Ser5P Pol II仅在启动子区域内检测到，正如预期的那样。Ser2P Pol II主要在启动子区域下游检测到，峰值位于可能发生终止的多聚腺苷酸化位点下游区域。这些结果与Pol II在被招募到启动子并被Ser5磷酸化后通常经历启动子近端、速率限制步骤的想法一致。Pol II也可能在转录终止区域从DNA中缓慢释放(Core等人，2008年；Glover Cutter等人，2008年)。

P-TEFb抑制阻止大多数活性基因的暂停释放

Pol II占据基因的模式表明，启动后的调控步骤，如暂停释放，可能对大多数基因的转录控制很重要。这个果蝇Hsp70该基因在P-TEFb依赖性暂停释放启动后受到调节(Lis等人，2000年). 活性P-TEFb是一种由细胞周期蛋白依赖激酶Cdk9和细胞周期蛋白组分（CycT1、CycT2或CycK）组成的异二聚体，磷酸化至少三个对转录控制重要的靶点：DSIF的Spt5亚基、NELF的NelfE亚基和Pol II CTD的Ser2(Kim和Sharp，2001年；Marshall等人，1996年；马歇尔和普莱斯，1995年；Wada等人，1998年b；Yamada等人，2006年). 为了评估P-TEFb依赖性暂停释放在全局转录控制中的作用，我们重复了ChIP-Seq实验，以检测用黄哌啶醇（FP）（Cdk9激酶活性抑制剂）处理的mES细胞中的总Pol II(Chao等人，2000年；Chao和Price，2001年). 正如预期的那样，FP治疗在60分钟内导致Spt5和Pol II Ser2的磷酸化降低，而Ser5的磷酸化没有受到实质性影响(图2A,S2A公司). 如果转录基因需要Pol II暂停释放，我们预计在存在FP的情况下，Pol II分子将与启动子近端暂停位点相关，但会从DNA下游进一步耗尽。在最活跃的转录基因中观察到Pol II占用模式的这种变化(图2B,S2B型). 我们分析了TR，以进一步评估Pol II在全基因组中占有率的变化。FP治疗后的TR变化通常在转录活跃的基因中观察到，其中启动子近端的Pol II信号相对不受影响，但下游的PolⅡ信号被耗尽(图2C). 我们发现75%的基因在药物治疗后Pol II TR的变化至少为1.5。TR在通常经历启动但不经历延伸的基因上通常没有变化(图2D). 这些结果表明，P-TEFb依赖性暂停释放是mES细胞中最活跃转录基因的Pol II转录所必需的。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms193332f2.jpg
P-TEFb抑制阻止启动子近端Pol II的释放

（A） mES细胞用1μM flavopiridol处理指定的时间。使用Pol II Ser2P、Spt5、Cdk9和Brg1抗体（用作负荷控制）通过Western blot分析提取物。**表示分子量较高的Spt5物种，如(Yamada等人，2006年)，即黄哌啶醇敏感。*表示分子量较低的Spt5物种。另请参见图S2A。

（B） 用对照（DMSO 60分钟，黑色）或黄哌啶醇（1μM 60分钟，红色）处理的mES细胞的RNA Pol II（all）ChIP-seq分析。该面板显示了黄哌啶醇治疗后四个活跃转录基因的Pol II占用率的变化。另请参见图S2B。

（C） 在flavopiridol处理和对照处理的mES细胞中活性基因的Pol II旅行比率分布（Pol II与H3K79me2修饰的核小体结合）。TR值越高，表示暂停程度越高。

（D） mES细胞中非生产性基因的Pol II移动比率分布（Pol II结合但没有H3K79me2修饰的核小体），表明无论用对照药物还是黄哌啶醇治疗，非生产性基因组的TR分布都相对相同。

启动子近端位点由Pol II、DSIF和NELF共同占据

P-TEFb拮抗暂停因子DSIF和NELF的负伸长活性(Cheng和Price，2007年；Kim和Sharp，2001年；Wada等人，1998年b). DSIF（Spt4和Spt5）和NELF（NelfA、NelfB、NelfC/D和NelfE(Wada等人，1998年a；山口等，1999年). 在向伸长过渡后，NELF解离，一种形式的DSIF仍然与伸长复合物有关(Andrulis等人，2000年；Wu等人，2003年). 如果Pol II转录的基因通常需要P-TEFb依赖性暂停释放，则DSIF和NELF应与Pol II一起占据这些基因的启动子近端区域。

我们使用ChIP-Seq测定小鼠ES细胞中NelfA（NELF）和Spt5（DSIF）的全基因组占有率(图3). 结果表明，NelfA和Spt5在整个基因组中与Pol II占据完全相同的启动子近端位点(图3A). 启动子近端区域的Pol II、NelfA和Spt5在转录活跃的基因和经历转录起始但没有延伸（非生产性）的基因中都很明显共存(图3A). Spt5和NelfA入住率与Pol II入住率呈正相关(图S3). 在启动子近端区域检测到最大的NelfA和Spt5峰，但只有Spt5在活性转录基因的下游进一步富集(图3A). 活跃转录基因3′端的Spt5富集与Ser2P Pol II相似，表明其在终止前仍与Pol II相关。NelfA和Spt5峰与Pol II峰的启动子近端位点重叠，Pol II的两侧为H3K4me3修饰核小体(图3B、3C). 这些结果表明，停顿因子DSIF和NELF与Pol II共同占据基因的启动子近端区域，这与PolⅡ转录的基因通常需要依赖P-TEFb的停顿释放的模型一致。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms193332f3.jpg
DSIF和NELF与Pol II共占大多数基因

（A） 使用ChIP-seq分析在一个代表性活性基因上结合Pol II（all）、NelfA（NELF亚基）、Spt5（DSIF亚单位）和Ctr9（PAF1亚单位）（卢比3）和非生产性基因（第7页）在mES细胞中。每个因子的全基因组结合平均值（内含子未描述）显示为50bp，以显示沿着RefSeq基因转录单位的一般结合模式，从转录起始位点上游2kb到每个注释基因末端下游2.5kb。

（B） 所有小鼠RefSeq基因的Pol II（全部；灰色）、NelfA（橙色）、Spt5（绿色）和H3K4me3（紫色）的ChIP-seq结合的热图表示，从大多数Pol II排列到最低Pol II。颜色意味着丰富，白色意味着没有丰富。另请参见图S3。

（C） Spt5、NelfA和H3K4me3峰与每个富集Pol II基因的启动子近端Pol II峰之间的距离的空间分布，表明与Spt5，NelfA及Pol II峰值大致重叠。

（D） ChIP-seq结合图显示Pol II（all）、Spt5（DSIF）、NelfA（NELF）、延伸相关染色质修饰（H3K79me2）和TSSa-RNA在双向启动基因处读取到该基因组区域的地图（Hsd17b12）和单向启动基因（卢比6）.红色箭头表示在反义方向映射到基因的TSSa-RNA物种，蓝色箭头表示在感观方向映射到该基因的TSSa-RNA物种。

PAF1复合物等因素参与独立于启动子-近端暂停的启动后事件。PAF1参与伸长、mRNA处理事件和伸长相关染色质修饰（Saunders等人，2006年）。为了测试Pol II启动子近端峰是否对启动子近段暂停相关因素具有特异性，我们对PAF1复合物的Ctr9亚单位进行了ChIP-Seq。虽然在一些基因的启动子近端区域可以检测到有限的信号，但Ctr9的占位通常与启动子近缘Pol II峰不重叠(图3A). Ctr9通常位于活性基因的编码区内，即启动子近端Pol II的下游，并延伸至转录基因的3′端。Ctr9占用率在活跃转录基因的3′端达到峰值，这与Ser2P Pol II和Spt5的结果相似，表明在终止前它仍与Pol II相关。Ctr9 ChIP-seq数据表明，PAF1复合体通常与最活跃基因的转录部分相关，这与它在伸长、mRNA加工和染色质修饰中的拟议作用一致(阿德尔曼等人，2006年；Krogan等人，2003年；Pokholok等人，2002年；Zhu等人，2005年). 这些结果支持这样的观点，即Pol II启动子近端峰代表启动后调节区域，而不仅仅是ChIP-Seq方法的伪影。

暂停释放调节基因的P-TEFb前DSIF和NELF功能(Fuda等人，2009年；Peterlin和Price，2006年). 这预示着即使没有P-TEFb活性，DSIF和NELF也应该存在于启动子近端的Pol II位点。我们使用ChIP-ChIP来确定FP治疗后Spt5和NelfA启动子近端是否与Pol II共占。我们发现在FP治疗后，Spt5和NelfA继续与Pol II共占启动子近端位点(图S3B). FP治疗后，这些启动子近端位点下游的Spt5被耗尽，支持了Spt5在基因体中的定位依赖于Pol II的模型(Ni等人，2008年；Ni等人，2004年). 这些结果表明，在P-TEFb功能之前，DSIF和NELF与Pol II共同占据启动子近端位点。

双向和单向基因

最近有报道称Pol II可以在许多基因的正、反义方向启动转录(Core等人，2008年；Seila等人，2008年). 我们根据有义和反义的证据将基因分为双向和单向两类t吨赎金秒蛋挞秒伊特一ES细胞中的相关RNA(Seila等人，2008年). 为了确定DSIF和NELF如何占据这两类基因的启动子近端区域，我们以更高的分辨率重新检查了Pol II、Spt5、NelfA和H3K79me2（伸长标记）的ChIP-seq数据(图3D). 大约65%具有TSSa-RNA读码的活性基因属于双向类，在这些基因的启动子处，我们发现Pol II占据的两个位点都被NelfA和Spt5共占。大约35%具有TSSa-RNA读码的活性基因属于单向类，在这些基因的启动子处，我们发现Pol II占据的一个位点被NelfA和Spt5共占。这些结果表明，无论Pol II发生在一个方向还是两个方向，DSIF和NELF通常在发现Pol II的地方共占启动子近端区域，进一步支持了P-TEFb依赖性暂停释放是Pol II转录启动的一般特征的模型。

暂停因子敲低改变Pol II基因的占有率

在大多数经历转录起始的基因中，暂停因子NELF和DSIF与Pol II共占启动子。先前的研究表明，NELF的缺失会导致启动子处Pol II密度的降低，从而导致Pol II移动比率（或暂停指数）的降低，在少量的果蝇属基因(Muse等人，2007年). 为了确定脊椎动物NELF或DSIF的丢失如何影响Pol II的占用，我们使用shRNA-介导的NelfA和Spt5的敲除，然后对mES细胞进行Pol II ChIP-seq分析(图4)。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms193332f4.jpg
DSIF基因敲除改变Pol II在许多基因上的占有率

（A） 通过使用Spt5或NelfA抗体的Western blot测定所示shRNA-介导的mES细胞敲除后的Spt5（左）和NelfA（右）蛋白水平。β-管蛋白是一种负荷控制。

（B） shControl（黑色）、shSpt5（橙色）和shNelfA（蓝色）mES细胞中五个活性基因的RNA Pol II（all）ChIP-seq结合密度分析。

（C） shControl、shSpt5和shNelfA mES细胞中的RNA Pol II TR计算表明，许多基因在Spt5敲除后变得不那么暂停，而在NelfA敲除后发生更微妙的变化。较低的TR值表示暂停程度较低。另请参见图S4。

Pol II密度的最显著变化是在Spt5基因敲除后发现的，在激活转录基因的启动子下游经常观察到Pol II浓度的增加(图4B). 在这些活性基因中，暂停因子的缺失似乎导致通过暂停位点的转录增加，但由于对启动子近端Pol II几乎没有影响，高启动率维持Pol II启动子水平。发现NelfA在Spt5基因敲除后继续占据启动子近端区域(图S4A、S4B). 使用TR指标量化Spt5击倒对Pol II密度的影响(图4C,S4E、S4F). Spt5基因敲除后，TR发生了重大变化，这表明当DSIF水平降低时，活性基因转录区的Pol II密度通常会增加。这些结果证实，Spt5功能有助于控制mES细胞中启动子近端Pol II。

NelfA击倒对Pol II入住率的影响较小(图4B、4C)，但在一些基因上观察到了适度的影响，并且变化模式与在非生产性基因上的Spt5敲除实验中观察到的模式相似，如TR的变化所证明的(图S4E、S4F、S4G). 这一结果与之前在果蝇胚胎中观察到的结果类似，其中一部分基因在启动子处显示Pol II密度丢失(Muse等人，2007年). NelfA敲除后，启动子近端区域的Spt5占有率基本上未受影响(图S4C、S4D). 总之，我们发现Spt5敲除，以及在更有限的程度上NelfA敲除，相对于启动子近端区域，可以在转录区域中产生增加的Pol II占有率，这与这些因素在控制启动子近端暂停中的作用一致。

c-Myc结合P-TEFb并有助于暂停ES细胞的释放

如果P-TEFb依赖性暂停释放是Pol II转录的一般特征，则某些DNA结合转录因子可能负责招募P-TEFb来释放活性基因的暂停聚合酶。基于这种转录因子可以结合P-TEFb并刺激肿瘤细胞中特定基因的延伸的证据，已经提出了c-Myc的这种作用(Eberhardy和Farnham，2001年,2002；Gargano等人，2007年；金泽等人，2003年). 因为c-Myc是自我更新和增殖所需的关键ES细胞转录因子(Cartwright等人，2005年)，它占据了三分之一的活性基因（见下文），我们研究了c-Myc是否在其在ES细胞中占据的基因的P-TEFb依赖性暂停释放中发挥作用。

如果c-Myc有助于ES细胞中P-TEFb依赖性暂停释放，则可能会在这些细胞中结合P-TEFb。作为转录因子，c-Myc与Max形成异二聚体(艾尔斯和艾森曼，2008年). 我们使用联合免疫沉淀分析确定内源性c-Myc/Max是否与ES细胞中的P-TEFb相互作用。我们发现P-TEFb组分Cdk9和CycT1共同免疫沉淀Max的免疫沉淀，以及类似的c-Myc和Max共同免疫沉淀(图5A). 因此，c-Myc/Max可以在ES细胞中结合P-TEFb。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms193332f5.jpg
c-Myc靶基因富含活性转录基因，c-Myc/Max与mES细胞中的P-TEFb相关

（A） 使用针对IgG（测量背景结合）或内源性c-Myc、Max、Cdk9和CycT1的抗体在mES细胞中进行协同免疫沉淀实验。从mES细胞裂解物中免疫预处理蛋白质，并通过检测Max、Cdk9和CycT1进行Western blot分析。为Max和Cdk9印迹加载10%的输入，为CycT1印迹加载1%的输入。

（B） 热图表示说明了c-Myc、Oct4和Nanog靶基因在mES细胞中的转录状态，如Pol II Ser5P、H3K4me3（启动相关染色质修饰）、H3K79me2（延伸相关染色质修改）和H3K27me3（抑制性染色质修饰。根据每个基因的Pol II结合量对每个目标基因集进行排序，从Pol II的最高量到最低量，指示的染色质修饰或Pol II在每个注释的转录起始位点周围的富集显示为-2.5kb到+3kb。蓝色表示浓缩，白色表示不浓缩。

（C） C-Myc靶基因的TR值低于非靶基因。对具有给定TR值的高置信度c-Myc靶基因和非靶基因的基因数量绘制直方图。TR值较低的基因比TR值较高的基因暂停时间短。另请参见图S5。

如果c-Myc的主要功能是促进ES细胞中的暂停释放，那么我们预计它应该几乎完全与活性转录基因相关，而不像其他关键的ES细胞调节因子如Oct4和Nanog，它们与活性和抑制基因都相关。我们检查了已发布的ChIP-Seq数据，以确定c-Myc、Oct4和Nanog结合的基因中活跃转录的部分(Chen等人，2008；Marson等人，2008年)如含有组蛋白H3K4me3和H3K79me2的核小体所示(图5B). 刚刚超过一半的Oct4和Nanog占据的基因显示出转录延长的证据（H3K79me2修饰的核小体）。相比之下，几乎所有c-Myc占据的基因都有H3K79me2修饰的核小体，这表明mES细胞中的大多数c-Myc靶点经历转录延长。此外，与非c-Myc靶基因相比，c-Myc目标基因的TR值更低(图5C). 我们估计ES细胞中33%的活性转录基因在转录起始点1kb内与c-Myc结合(图S5). c-Myc与大量活性转录基因的关联，再加上它可以结合P-TEFb的证据，与c-Myc促进ES细胞中大部分活性基因的P-TEFb-依赖性暂停释放的模型一致。

为了更直接地测试c-Myc是否调节暂停释放，我们使用了c-Myc/Max的低分子量抑制剂10058-F4，它抑制c-Myc/Max异二聚在体外和体内(Hammoudeh等人，2009年；Wang等人，2007年；Yin等人，2003年). 由ChIP测定的最大共占c-Myc结合位点，证实c-Myc和Max在ES细胞的靶基因上共同发挥作用(图S6A). 10058-F4（50μM，持续6小时）处理mES细胞导致大多数c-Myc靶基因的表达降低，但不影响两个非c-Myc目标基因的表达，表明在这些条件下，10058-F5抑制了c-Myc/Max功能(图6A). 观察到的减少幅度（～20-40%）与mES细胞中典型的mRNA半衰期（～7小时）相对较短的抑制剂治疗时间相一致(Sharova等人，2009年)。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms193332f6.jpg
c-Myc抑制在暂停释放阶段影响转录

（A） 从10058-F4或单独载体（DMSO）处理6小时的mES细胞中提取RNA，并使用逆转录生成cDNA。从两个独立实验中计算10058-F4处理的细胞的表达变化，并将两个非c-Myc靶基因（Brg1、Rnf2-绿色）和五个c-Myc目标基因（Bax、Nol5、Zfp451、Brca2和Atic-blue）与单独对照进行比较。误差条表示三次qPCR反应的标准偏差。

（B） 用10058-F4处理mES细胞1.5、6或12小时。使用抗Pol II Ser2P CTD和Pol II Ser5P CTD抗体对提取物进行Western blot分析，以确定Pol II修饰形式的水平。TBP用作负荷控制。

（C） 10058-F4（C-Myc/Max抑制剂；蓝色）、DMSO单独（黑色）或黄哌啶醇（P-TEFb抑制剂；红色）处理的mES细胞中Pol II ChIP-seq结合谱。显示了三个c-Myc靶基因的Pol II占有率(Ncl公司,Npm1号机组和第5号)和两个非cMyc靶基因(Txnip公司和Chpf2公司). 用10058-F4或DMSO处理细胞6小时。另请参见图S6。

（D） 非药物（黑色）和10058-F4治疗（蓝色）中高置信度cMyc靶基因和非c-Myc靶蛋白基因的平均Pol II结合图。左侧面板显示了整个基因的平均值。右侧面板是转录区的特写，显示了不同条件下伸长Pol II密度的差异。右侧面板中还包括黄哌啶醇治疗后延长的Pol II密度（红色）。

（E） 10058-F4治疗（蓝色）或非药物治疗（黑色）后高置信度c-Myc靶基因和非c-Myc目标基因的Pol II移动比率（TR）。左侧面板是c-Myc目标的TR，右侧面板是非c-Myc靶的TR。TR值越高，表示暂停程度越高。

如果c-Myc的一个关键功能是有助于暂停其在ES细胞中占据的活性基因的释放，那么c-Myc缺失预计会导致Ser2-磷酸化Pol II（与伸长相关的形式）水平的降低，但不应影响Ser5-磷酸化Pol-II（与起始相关的形状）的水平。我们发现用10058-F4处理ES细胞确实导致Pol II Ser2P水平显著降低，而Ser5P未受影响(图6B). 受c-Myc调控的基因中有1/3是细胞中转录率最高的基因，这可能解释了为什么Ser2P Pol II总水平的降低幅度大于33%。

如果c-Myc调节暂停释放，那么抑制应该对启动子和基因体中类似于FP的Pol II水平产生影响，但只对c-Myc占据的基因产生影响。我们通过在mES细胞中使用ChIP-seq确定10058-F4如何影响Pol II占用率来测试这一想法。启动子处的Pol II密度几乎没有影响，但转录区明显减少(图6C). c-Myc shRNA敲除后也观察到这种对Pol II密度的影响(图S6B、S6C、S6D). 10058-F4的影响程度略轻于FP，可能是因为c-Myc/Max异源二聚体的抑制不完全(Hammoudeh等人，2009年；Wang等人，2007年；Yin等人，2003年). 10058-F4处理并没有改变P-TEFb组分Cdk9或CycT1的蛋白质水平，表明这种影响不是P-TEFb-水平降低的结果(图S6E). 重要的是，缺乏c-Myc结合证据的基因显示了Pol II占用模式，而这种模式不受10058-F4治疗的影响(图6C). 我们证实，非c-Myc靶基因确实需要P-TEFb功能来释放暂停的Pol II，因为FP治疗会导致暂停释放的阻滞(图6C)，这表明c-Myc以外的转录因子参与募集P-TEFb以刺激这些基因的暂停释放。

我们对10058-F4对c-Myc结合基因的Pol II占有率的影响进行了更全面的分析，并将这些模式与不受该因子约束但有延伸证据的基因进行了比较(图6D,S6G系列). 结果表明，高置信度c-Myc靶基因通常保留启动子近端Pol II，但在其转录区域降低了Pol II密度，而非c-Myc目标基因的Pol II占有率没有改变(图6D). 进一步分析证实，c-Myc靶点的基因体（p=7.341e-06）发生了统计上显著的变化，但启动子区域（p=0.4536）没有变化。此外，10058-F4治疗后，在c-Myc靶基因上观察到TR显著增加，但在非c-Myc靶标上没有观察到这种变化(图6E). c-Myc shRNA敲除后，c-Myc靶基因的TR也发生了类似的变化，表明基因变得更加暂停(图S6F). c-Myc活性降低对启动子近端Pol II水平几乎没有影响，但导致c-Myc靶基因转录部分Pol II的水平降低，这与c-Myc/Max通常在mES细胞中其靶基因的Pol II暂停释放中起作用的模型一致。

Oct4和c-Myc的缺失对Pol II基因占有率有不同的影响

另一个关键ES细胞转录因子Oct4的缺失导致ES细胞中许多Oct4-结合活性基因的转录减少(霍尔等人，2009年；Matoba等人，2006年). 为了确定Oct4的缺失如何影响其靶基因启动子和转录区的Pol II水平，我们使用了一个多西环素诱导的Oct4关闭mES细胞系(Niwa等人，2000年)并在10月4日停堆前后通过ChIP-Seq监测Pol II水平(图7). 接触强力霉素后12小时内Oct4蛋白水平显著降低，24小时后几乎消除(图7A). 在转录减少的Oct4-ocked基因中，启动子近端区域和基因体中的Pol II占有率在12小时和24小时通常都会降低(图7B). 这些效应在10月4日未被占领的大多数基因中未被观察到(图7B). 鉴于Pol II在基因体中的相应损失，Oct4靶基因启动子近端区域中Pol II的损失可能是由于转录器招募减少所致。对于这些Oct4靶基因，其中Pol II从启动子近端和基因体区域丢失，我们预计TR不会发生变化，对这些基因的全局分析表明，情况确实如此(图7C,S6G系列). 我们得出结论，Oct4缺失时Oct4靶基因Pol II密度降低的模式与c-Myc缺失时c-Myc靶基因不同，并认为这是由于两种转录因子发挥主导调节作用的阶段不同所致。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms193332f7.jpg
Oct4停堆减少Oct4依赖基因的Pol II启动

（A） 在多西环素治疗0、12或24小时后，多西环素诱导的Oct4敲低mES细胞中的Oct4蛋白水平。用Oct4抗体对提取物进行检测。Brg1用作加载控制。

（B） 在强力霉素治疗的指定时间后，Pol II ChIP-seq在Oct4靶基因上的结合谱，诱导Oct4敲除。值得注意的是，Oct4结合基因改变了启动子近端区域和转录区域中Pol II的占有率。右边的面板显示了在多西环素治疗的指定时间后，非Oct4靶点的Pol II ChIP-seq结合谱，诱导Oct4敲低。

（C） Pol II移动比（TR）如所述图1C在强力霉素治疗0或12小时后，高置信度Oct4依赖基因和Oct4非靶基因。左侧面板是Oct4目标的TR，右侧面板是非Oct4的TR。

讨论

转录因子与特定DNA序列结合，并通过向启动子招募转录起始装置来调节基因表达(Hochheimer和Tjian，2003年；Ptashne和Gann，1997年；罗德，2005年). 最近的研究表明，在某些基因启动之后，必须进行额外的调节，并提出某些转录因子调节这一步骤(Core和Lis，2008年；Margaritis和Holstege，2008年；Peterlin和Price，2006年). 这里描述的证据表明，启动子近端暂停是Pol II在脊椎动物细胞中转录的一个更普遍的特征，并确定c-Myc在ES细胞中大量活跃转录基因的暂停释放中起着关键作用。

我们描述了支持启动子-近端停顿是Pol II在ES细胞中转录的一般特征这一假设的几行证据。首先，全基因组分析表明，Pol II的大部分占据基因的启动子近端区域，即使这些基因是细胞中转录最活跃的基因之一。其次，停顿因子DSIF和NELF通常与Pol II共占这些位点，这与它们通常在转录延伸的早期阶段与酶结合的观点一致。第三，抑制暂停释放因子P-TEFb可以阻止启动子近端暂停Pol II在几乎所有基因上的释放。

已经确定了一些受P-TEFb依赖性停顿控制调节的基因，例如热休克蛋白70和计算机辅助设计(Eberhardy和Farnham，2002年；Lis等人，2000年). 然而，回顾过去，有一些观察结果表明，转录中的这一步骤更经常受到调控，可能是普遍的。生殖细胞通过抑制P-TEFb功能全面抑制Pol II转录。在线虫生殖系卵裂球和果蝇属原始生殖细胞PIE-1和Pgc分别通过抑制P-TEFb功能来抑制全局转录(Hanyu-Nakamura等人，2008年；Seydoux和Dunn，1997年；Zhang等人，2003年). 慢病毒和逆转录病毒（如HIV和T淋巴细胞病毒I型）的转录因子通过向其启动子区域招募P-TEFb，减弱Pol II转录暂停来发挥作用(Wei等人，1998年；Zhou等人，2006年). 这些病毒因此产生了自己的方法来克服暂停控制。

启动子近端暂停是普遍存在的模型对转录控制有几点启示。转录起始装置募集后的一个步骤原则上可以在任何基因上进行调节。启动子近端暂停可能有助于RNA加工因子的组装，并已被提议将转录和mRNA加工事件结合起来(Glover-Cutter等人，2008年；Moore和Proudfoot，2009年). DSIF和Ser5P Pol II可以结合封盖酶并刺激mRNA封盖(Mandal等人，2004年；McCracken等人，1997年a；McCracken等人，1997年b；Wen和Shatkin，1999年). P-TEFb的Ser2磷酸化导致剪接因子和3′末端加工因子的招募，这是正确加工所必需的(Ahn等人，2004年；Komarnitsky等人，2000年；McCracken等人，1997年b；Ni等人，2004年). 启动子近端暂停也提供了一种机制来控制双向启动子的转录(Core等人，2008年；Seila等人，2008年)，可能有助于核小体缺失区域的形成，从而改善对调节器的接触（Gilchrist等人，2008年）。

多种证据支持这样的观点，即c-Myc/Max通常在ES细胞中Pol II在其靶基因处的暂停释放中发挥作用，并通过P-TEFb的招募发挥作用。c-Myc的缺失降低了延长Pol II的水平，但不影响启动子近端Pol II水平。c-Myc/Max功能的抑制导致细胞中Ser2-磷酸化Pol II水平的大幅降低，这是与伸长相关的形式，但不会影响Ser5-磷酸化Pol-II的水平，这是一种与起始相关的形式。cMyc结合P-TEFb，负责Ser2-磷酸化Pol II。与暂停释放的作用一致，c-Myc几乎只与活跃转录的基因相关，而不像Oct4和Nanog等其他关键ES细胞调节因子，后者同时占据活跃基因和抑制基因。此外，c-Myc占据启动子近端位点(图S5A)，其结合的电子盒核心图案得到了极大丰富(图S5B)其中c-Myc最适合招募P-TEFb。

与其他细胞类型一样，在ES细胞中，c-Myc占据了参与细胞增殖的基因(Chen等人，2008；Kidder等人，2008年；Kim等人，2008年). 我们的结果表明，c-Myc在ES细胞的暂停释放中起着关键作用，并且可能在所有活性转录基因的1/3处起到关键作用。这些结果解释了c-Myc的异位表达如何显著提高成纤维细胞重编程诱导多能干细胞的效率(Takahashi等人，2007年；高桥和山中，2006年). 由于c-Myc在广泛的增殖细胞类型中表达(艾尔斯和艾森曼，2008年；Meyer和Penn，2008年)，并已被证明结合P-TEFb并刺激肿瘤细胞中一组基因的伸长(Eberhardy和Farnham，2001年,2002；Gargano等人，2007年；金泽等人，2003年)我们预计c-Myc的功能会影响大多数增殖细胞中该基因群体的暂停释放。

c-Myc扩增是肿瘤细胞中最常见的体细胞拷贝数扩增(Beroukhim等人，2010年). 我们的结果表明，过度表达c-Myc的肿瘤细胞具有增强的增殖基因表达，这是由于c-Myc在募集P-TEFb以影响这些基因的Pol II暂停释放中的作用。因此，降低c-Myc和P-TEFb活性的药物组合可能是对过度表达c-Myc的肿瘤细胞特别有效的治疗剂。

实验程序

mES细胞培养

V6.5（C57BL/6-129）小鼠ES细胞在典型的mES条件下在辐照小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）上生长。为了进行定位分析，从MEF培养细胞两代。为了对小分子抑制剂处理后的mES细胞进行定位分析，在甲醛交联之前，细胞在喂食器外培养两代，用所示最终浓度的黄哌啶醇（ChIP-ChIP和ChIP-seq实验用1μM，1小时；或Western blot分析用所示浓度和时间）或c-Myc/Max抑制剂10058-F4（50μM，6小时）处理细胞，二者均溶解于DMSO中的生长培养基中。作为对照，单独添加二甲基亚砜的最终体积与药物相同。使用的小分子抑制剂为：Flavopiridol（Sigma cat#F3055）和c-Myc抑制剂10058-F4（Sigma-cat#F 3680）。对于shRNA敲除后的位置分析（OpenBiosystems），在293T细胞中共转染48小时后收集病毒培养基，并且在mES细胞初始接种24小时后用病毒培养基直接感染mES细胞。感染培养基为1:2病毒培养基：mES培养基加2mM聚brene。用含有2μM嘌呤霉素的mES培养基筛选感染后24小时的有效感染细胞。细胞在选择后72小时交联。对于10月4日停堆后的位置分析，ZHBTc4 mES电池(Niwa等人，2000年)在标准mES细胞培养条件下生长，并在MEF饲养器上繁殖两代。在甲醛交联之前，将含有2μg/ml多西环素的mES培养基添加到细胞中0小时、12小时和24小时。

染色质免疫沉淀（ChIP）

ChIP是根据安捷伦哺乳动物ChIP-on-ChIP协议完成的。使用的抗体和ChIP条件可以在补充信息为了进行ChIP-ChIP分析，将Cy3-和Cy5-标记的连接介导的PCR产物与44000特征的安捷伦小鼠微阵列杂交。对于ChIP-seq分析，Solexa/Illumina的测序和分析按照Marson等人，2008年。请参阅补充信息以获取这些方法的详细描述。

mES细胞中的活性和非生产性基因类别

根据ChIP-seq的测定，使用H3K4me3（启动相关染色质修饰）和H3K79me2（延伸相关染色质修改）对mES细胞中的活性和非生产性基因进行分类(Marson等人，2008年)，作为转录状态的标记。活性基因同时有H3K4me3和H3K79me2染色质修饰，非生产性基因只有H3K4me3，而非活性基因没有H3K4-me3或H3K79 me2(Guenther等人，2007年；Marson等人，2008年；Pokholok等人，2005年)。

出行比率计算

PolⅡ水平在许多基因的5′区达到峰值。为了量化这种影响，我们开发了一种称为旅行比率（TR）的测量方法，该方法比较启动子和基因区域中Pol II密度之间的比率。我们将启动子区域定义为相对于TSS的-30到+300，基因体是基因的剩余长度。

ChIP-seq数据的热图分析

指定因子或修饰的ChIP-seq富集在50bp的箱子中测定（箱子中的富集以百万计），以每个转录起始位点为中心。通常，每个代表的基因列表根据mES细胞中Pol II（all）的数量进行排序，从大到小将给定因子的富集程度与每个基因的Pol II数量关联起来。Cluster 3.0和Java Treeview用于可视化数据并生成本文中所示的图形。

本研究中使用的先前发布的ChIP-seq数据集

mES细胞中的H3K4me3、H3K79me2和Oct4占用率(Marson等人，2008年); mES细胞中Nanog和c-Myc的占有率(Chen等人，2008); mES细胞中H3K27me3的占有率(Mikkelsen等人，2007年)。

补充材料

01

单击此处查看。（7.7M，pdf格式）

02

单击此处查看。（18M，xls）

致谢

我们感谢Garrett Frampton对Solexa数据分析的帮助，感谢David Price对抗体和讨论的帮助；Hiroshi Handa检测抗体；怀特黑德研究所测序中心的Tom Volkert、Jennifer Love、Jeong-Ah Kwon和Sumeet Gupta为Solexa测序提供帮助；John Lis和Young、Sharp和Burge实验室的成员进行了有益的讨论。这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款RO1-HG002668（RAY）、RO1-GM34277（PAS）、RO1-CA133404（PAS。ACS得到了美国国立卫生研究院博士后奖学金5-F32-HD051190的支持。ChIP-seq和微阵列数据以登录号存放在GEO上GSE20485标准。

脚注

请参阅补充信息其他实验程序、补充数据、表格和结果。

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

工具书类

  • 阿德尔曼·K、魏·W、阿德哈利·MB、沃纳·J、朱·B、莱因伯格·D、李斯·JT。果蝇Paf1调节活跃转录基因的染色质结构。分子细胞生物学。2006;26:250–260. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Ahn SH，Kim M，Buratowski S.RNA聚合酶II C末端结构域内丝氨酸2的磷酸化偶联转录和3′末端处理。分子细胞。2004;13:67–76.[公共医学][谷歌学者]
  • Andrulis ED、Guzman E、Doring P、Werner J、Lis JT。果蝇Spt5和Spt6在体内热休克基因的高分辨率定位：在启动子近端暂停和转录延长中的作用。基因发育。2000;14:2635–2649. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Barboric M、Nissen RM、Kanazawa S、Jabrane-Ferrat N、Peterlin BM。NF-kappaB结合P-TEFb，通过RNA聚合酶II刺激转录延伸。分子细胞。2001年；8:327–337.[公共医学][谷歌学者]
  • Bentley DL，Groudine M.伸长阻滞是分化HL60细胞中c-myc转录降低的主要原因。自然。1986;321:702–706.[公共医学][谷歌学者]
  • Beroukhim R、Mermel CH、Porter D、Wei G、Raychaudhuri S、Donovan J、Barretina J、Boehm JS、Dobson J、Urashima M等。人类癌症中体细胞拷贝数变化的前景。自然。2010;463:899–905. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Cartwright P、McLean C、Sheppard A、Rivett D、Jones K、Dalton S.LIF/STAT3通过Myc依赖性机制控制ES细胞的自我更新和多能性。发展。2005年；132:885–896.[公共医学][谷歌学者]
  • Chao SH、Fujinaga K、Marion JE、Taube R、Sausville EA、Senderowicz AM、Peterlin BM、Price DH。Flavopiridol抑制P-TEFb并阻断HIV-1复制。生物化学杂志。2000;275:28345–28348.[公共医学][谷歌学者]
  • Chao SH、Price DH。Flavopiridol灭活P-TEFb并阻断体内大多数RNA聚合酶II转录。生物化学杂志。2001年；276:31793–31799.[公共医学][谷歌学者]
  • Chen X，Xu H，Yuan P，Fang F，Huss M，Vega VB，Wong E，Orlov YL，Zhang W，Jiang J，等。胚胎干细胞中外部信号通路与核心转录网络的整合。单元格。2008;133:1106–1117.[公共医学][谷歌学者]
  • Cheng B，Price DH。P-TEFb介导的转化为生产性伸长前后RNA聚合酶II伸长复合物的性质。生物化学杂志。2007;282:21901–21912.[公共医学][谷歌学者]
  • 核心LJ，Lis JT。RNA聚合酶启动子近端暂停的转录调控Ⅱ。科学。2008;319:1791–1792. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Core LJ、Waterfall JJ、Lis JT。新的RNA测序揭示了人类启动子的广泛暂停和发散启动。科学。2008;322:1845–1848. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Eberhardy SR，Farnham PJ公司。c-Myc通过RNA聚合酶II后募集机制介导cad启动子的激活。生物化学杂志。2001年；276:48562–48571.[公共医学][谷歌学者]
  • Eberhardy SR，Farnham PJ公司。Myc招募P-TEFb来调节cad启动子转录激活的最后一步。生物化学杂志。2002;277:40156–40162.[公共医学][谷歌学者]
  • 艾勒斯·M，艾森曼·RN。Myc的广泛影响力。基因发育。2008;22:2755–2766. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Espinosa JM、Verdun RE、Emerson BM。p53通过DNA损伤前后转录起始成分的应激和启动子特异性募集发挥作用。分子细胞。2003;12:1015–1027.[公共医学][谷歌学者]
  • 新泽西州富达，Ardehali MB，Lis JT。定义体内调节RNA聚合酶II转录的机制。自然。2009;461:186–192. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Gargano B、Amente S、Majello B、Lania L.P-TEFb是Myc转录激活的关键辅因子。细胞周期。2007;6:2031–2037.[公共医学][谷歌学者]
  • Gilmour DS，Lis JT。RNA聚合酶II与果蝇黑胃细胞中未诱导hsp70基因的启动子区域相互作用。分子细胞生物学。1986;6:3984–3989. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Glover-Cutter K、Kim S、Espinosa J、Bentley DL。RNA聚合酶II在基因两端暂停并与前mRNA处理因子相关。自然结构分子生物学。2008;15:71–78. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Guenther MG、Levine SS、Boyer LA、Jaenisch R、Young RA。人类细胞中大多数启动子的染色质标志物和转录起始。单元格。2007;130:77–88. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hall J、Guo G、Wray J、Eyres I、Nichols J、Grotewold L、Morfopoulou S、Humphreys P、Mansfield W、Walker R等，10月4日和LIF/Stat3还诱导Kruppel因子维持胚胎干细胞自我更新。细胞干细胞。2009;5:597–609.[公共医学][谷歌学者]
  • Hammoudeh DI，Follis AV，Prochownik EV，Metallo SJ。癌蛋白c-Myc上小分子抑制剂的多个独立结合位点。美国化学学会杂志。2009;131：7390–7401。[公共医学][谷歌学者]
  • Hanyu-Nakamura K、Sonobe-Nojima H、Tanigawa A、Lasko P、Nakamura A。果蝇Pgc蛋白抑制P-TEFb向原始生殖细胞染色质的募集。自然。2008;451:730–733. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hochheimer A，Tjian R.多种转录起始复合物扩大了启动子选择性和组织特异性基因表达。基因发育。2003;17:1309–1320.[公共医学][谷歌学者]
  • Kanazawa S、Soucek L、Evan G、Okamoto T、Peterlin BM.c-Myc招募P-TEFb用于转录、细胞增殖和凋亡。致癌物。2003;22:5707–5711.[公共医学][谷歌学者]
  • Kidder BL、Yang J、Palmer S.Stat3和c-Myc全基因组启动子在胚胎干细胞中的占有率。公共科学图书馆一号。2008;三：e3932。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kim J，Chu J，Shen X，Wang J，Orkin SH.胚胎干细胞多能性的扩展转录网络。单元格。2008;132:1049–1061. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kim JB，Sharp PA。正转录延伸因子B磷酸化hSPT5和RNA聚合酶II羧基末端结构域，独立于细胞周期素依赖性激酶。生物化学杂志。2001年；276:12317–12323.[公共医学][谷歌学者]
  • Komarnitsky P，Cho EJ，Buratowski S.转录过程中不同磷酸化形式的RNA聚合酶II和相关mRNA处理因子。基因发育。2000;14:2452–2460. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Krogan NJ、Dover J、Wood A、Schneider J、Heidt J、Boateng MA、Dean K、Ryan OW、Golshani A、Johnston M等。Paf1复合物是COMPASS和Dot1p实现组蛋白H3甲基化所必需的：将转录延伸与组蛋白甲基化联系起来。分子细胞。2003;11:721–729.[公共医学][谷歌学者]
  • Lis JT、Mason P、Peng J、Price DH、Werner J.P-TEFb激酶在热休克位点的募集和功能。基因发育。2000;14:792–803. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Mandal SS，Chu C，Wada T，Handa H，Shatkin AJ，Reinberg D.RNA捕捉酶与通过RNA聚合酶II正向和负向调节启动子逃逸的因子的功能相互作用。美国国家科学院院刊。2004;101:7572–7577. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Margaritis T，Holstege足球俱乐部。泊松RNA聚合酶II暂停思考。单元格。2008;133:581–584.[公共医学][谷歌学者]
  • Marshall NF、Peng J、Xie Z、Price DH。通过一种新的羧基末端结构域激酶控制RNA聚合酶II延伸电位。生物化学杂志。1996;271:27176–27183.[公共医学][谷歌学者]
  • Marshall NF，Price DH。P-TEFb的纯化，这是一种转化为生产性伸长所需的转录因子。生物化学杂志。1995;270:12335–12338.[公共医学][谷歌学者]
  • Marson A、Levine SS、Cole MF、Frampton GM、Brambrink T、Johnstone S、Guenther MG、Johnston WK、Wernig M、Newman J等。将微RNA基因连接到胚胎干细胞的核心转录调控电路。单元格。2008;134:521–533. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Matoba R、Niwa H、Masui S、Ohtsuka S、Carter MG、Sharov AA、Ko MS。通过表达谱分析胚胎干细胞中Oct3/4调节的基因网络。公共科学图书馆一号。2006;1：e26。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • McCracken S、Fong N、Rosonina E、Yankulov K、Brothers G、Siderovski D、Hessel A、Foster S、Shuman S、Bentley DL。5′-封盖酶通过与RNA聚合酶II的磷酸化羧基末端结构域结合，靶向前mRNA。基因发育。1997年a；11:3306–3318. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • McCracken S、Fong N、Yankulov K、Ballantyne S、Pan G、Greenblatt J、Patterson SD、Wickens M、Bentley DL。RNA聚合酶II的C末端结构域将mRNA处理与转录耦合。自然。1997年b；385:357–361.[公共医学][谷歌学者]
  • 梅耶·N，佩恩·LZ。与MYC共度25年时光。Nat Rev癌症。2008;8:976–990.[公共医学][谷歌学者]
  • Mikkelsen TS、Ku M、Jaffe DB、Issac B、Lieberman E、Giannoukos G、Alvarez P、Brockman W、Kim TK、Koche RP等。多能干细胞和谱系承诺细胞染色质状态的基因组全图。自然。2007;448:553–560. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Moore MJ，新泽西州Proudfoot。信使核糖核酸前体的处理回到转录，再向前到达翻译。单元格。2009;136:688–700.[公共医学][谷歌学者]
  • Muse GW、Gilchrist DA、Nechaev S、Shah R、Parker JS、Grissom SF、Zeitlinger J、Adelman K。RNA聚合酶准备在基因组中激活。自然遗传学。2007;39:1507–1511. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Ni Z、Saunders A、Fuda NJ、Yao J、Suarez JR、Webb WW、Lis JT。P-TEFb对RNA聚合酶II在体内成熟为生产性伸长至关重要。分子细胞生物学。2008;28:1161–1170. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Ni Z、Schwartz BE、Werner J、Suarez JR、Lis JT。P-TEFb激酶对热休克基因的转录、RNA处理和监测的协调。分子细胞。2004;13:55–65.[公共医学][谷歌学者]
  • Niwa H，Miyazaki J，Smith AG.Oct-3/4的定量表达定义了ES细胞的分化、去分化或自我更新。自然遗传学。2000;24:372–376.[公共医学][谷歌学者]
  • O'Brien T，Lis JT。RNA聚合酶II暂停在转录诱导的果蝇hsp70基因的5′端。分子细胞生物学。1991;11:5285–5290. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Peterlin BM，Price DH。用P-TEFb控制转录延伸期。分子细胞。2006;23:297–305.[公共医学][谷歌学者]
  • Pokholok DK，Hannett NM，Young RA。体内基因表达期间RNA聚合酶II起始和延伸因子的交换。分子细胞。2002;9:799–809.[公共医学][谷歌学者]
  • Pokholok DK、Harbison CT、Levine S、Cole M、Hannett NM、Lee TI、Bell GW、Walker K、Rolfe PA、Herbolsheimer E等。酵母中核小体乙酰化和甲基化的基因组全图。单元格。2005年；122:517–527.[公共医学][谷歌学者]
  • 价格DH。固定聚合酶：照你的意思……准备好……出发！分子细胞。2008;30：7-10。[公共医学][谷歌学者]
  • Ptashne M，Gann A.通过招募进行转录激活。自然。1997;386:569–577.[公共医学][谷歌学者]
  • Reppas NB、Wade JT、Church GM、Struhl K。大肠杆菌中转录起始和延伸之间的转换是高度可变的，通常具有速率限制。分子细胞。2006;24:747–757.[公共医学][谷歌学者]
  • 罗德RG。转录调控和动物细胞中多种共激活因子的作用。FEBS信函。2005年；579:909–915.[公共医学][谷歌学者]
  • Rougvie AE，Lis JT。黑腹果蝇未诱导hsp70基因5′端的RNA聚合酶II分子参与转录。单元格。1988;54:795–804.[公共医学][谷歌学者]
  • Sawado T，Halow J，Bender MA，Groudine M。β-珠蛋白基因座控制区（LCR）主要通过增强从转录起始到延伸的过渡来发挥作用。基因发育。2003;17:1009–1018. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Seila AC、Calabrese JM、Levine SS、Yeo GW、Rahl PB、Flynn RA、Young RA、Sharp PA。活性启动子的发散转录。科学。2008;322:1849–1851. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Seydoux G，Dunn MA。在秀丽隐杆线虫和黑腹果蝇的早期胚胎中，转录抑制的生殖细胞缺乏磷酸化RNA聚合酶II亚群。发展。1997;124:2191–2201.[公共医学][谷歌学者]
  • Sharova LV、Sharov AA、Nedorezov T、Piao Y、Shaik N、Ko MS。通过多能干细胞和分化小鼠胚胎干细胞的DNA微阵列分析获得的19 977个基因的mRNA半衰期数据库。DNA研究。2009;16:45–58. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Takahashi K、Tanabe K、Ohnuki M、Narita M、Ichisaka T、Tomoda K、Yamanaka S。通过特定因子从成人成纤维细胞诱导多能干细胞。单元格。2007;131:861–872.[公共医学][谷歌学者]
  • Takahashi K，Yamanaka S.通过特定因子从小鼠胚胎和成年成纤维细胞培养物中诱导多能干细胞。单元格。2006;126:663–676.[公共医学][谷歌学者]
  • Wada T、Takagi T、Yamaguchi Y、Ferdous A、Imai T、Hirose S、Sugimoto S、Yano K、Hartzog GA、Winston F等。DSIF是一种调节RNA聚合酶II进程的新型转录延伸因子，由人类Spt4和Spt5同源物组成。基因发育。1998年a；12:343–356. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Wada T，Takagi T，Yamaguchi Y，Watanabe D，Handa H。P-TEFb在体外减轻DSIF对RNA聚合酶Ⅱ依赖性转录的负面影响的证据。Embo J。1998年b；17:7395–7403. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Wade JT，Struhl K。从转录起始到延伸的转变。当前操作基因开发。2008;18:130–136. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Wang H，Hammoudeh DI，Follis AV，Reese BE，Lazo JS，Metallo SJ，Prochownik EV.改进的低分子量Myc-Max抑制剂。摩尔癌症治疗。2007;6:2399–2408.[公共医学][谷歌学者]
  • Wei P、Garber ME、Fang SM、Fischer WH、Jones KA。一种新的CDK9相关的C型细胞周期蛋白直接与HIV-1 Tat相互作用，并介导其与TAR RNA的高亲和力、环特异性结合。单元格。1998;92:451–462.[公共医学][谷歌学者]
  • Wen Y，Shatkin AJ。转录延伸因子hSPT5刺激mRNA封顶。基因发育。1999;13:1774–1779. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Wu CH、Yamaguchi Y、Benjamin LR、Horvat Gordon M、Washinsky J、Enerly E、Larsson J、Lambertsson A、Handa H、Gilmour D.NELF和DSIF导致果蝇hsp70启动子上的启动子近端暂停。基因发育。2003;17:1402–1414. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Yamada T、Yamaguchi Y、Inukai N、Okamoto S、Mura T、Handa H。P-TEFb介导的hSpt5 C-末端重复序列磷酸化对过程转录延伸至关重要。分子细胞。2006;21:227–237.[公共医学][谷歌学者]
  • Yamaguchi Y、Takagi T、Wada T、Yano K、Furuya A、Sugimoto S、Hasegawa J、Handa H.NELF是一种含有RD的多亚单位复合物，与DSIF协同抑制RNA聚合酶II的延伸。单元格。1999;97:41–51.[公共医学][谷歌学者]
  • Yin X，Giap C，Lazo JS，Prochownik EV。Myc-Max相互作用的低分子量抑制剂及其功能。致癌物。2003;22:6151–6159.[公共医学][谷歌学者]
  • Zhang F，Barboric M，Blackwell TK，Peterlin BM.抑制模型：CTD类似物和PIE-1通过P-TEFb抑制转录延伸。基因发育。2003;17:748–758. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Zhou M、Lu H、Park H、Wilson Chiru J、Linton R、Brady JN。Tax以一种新的方式与P-TEFb相互作用以刺激人类嗜T淋巴细胞病毒1型转录。《维罗尔杂志》。2006;80:4781–4791. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Zhu B、Mandal SS、Pham AD、Zheng Y、Erdjument-Bromage H、Batra SK、Tempst P、Reinberg D。人类PAF复合体协调转录与RNA合成下游事件。基因发育。2005年；19:1668–1673. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]