自然方法。作者手稿；PMC 2010年6月1日提供。
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美国国立卫生研究院：美国国立卫生研究院186333
用改进的GCaMP钙指示剂对蠕虫、苍蝇和小鼠的神经活动进行成像
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林田
1Howard Hughes医学院，Janelia Farm Research Campus，Ashburn，VA 20147，USA
S.Andrew雇佣
1Howard Hughes医学院，Janelia Farm Research Campus，Ashburn，VA 20147，USA
天一毛
1Howard Hughes医学院，Janelia Farm Research Campus，Ashburn，VA 20147，USA
丹尼尔·胡贝尔
1Howard Hughes医学院，Janelia Farm Research Campus，Ashburn，VA 20147，USA
M.Eugenia Chiappe先生
1Howard Hughes医学院，Janelia Farm Research Campus，Ashburn，VA 20147，USA
Sreekanth H.Chalasani公司
2霍华德·休斯医学院，美国纽约州洛克菲勒大学神经回路和行为实验室，邮编：10065
利奥波多·彼得雷努
1Howard Hughes医学院，Janelia农场研究院，美国弗吉尼亚州阿什本，20147
贾斯珀·阿克布姆
1Howard Hughes医学院，Janelia Farm Research Campus，Ashburn，VA 20147，USA
肖恩·麦金尼
1Howard Hughes医学院，Janelia Farm Research Campus，Ashburn，VA 20147，USA
埃里克·施赖特
4波多黎各大学化学系-波多黎各圣胡安Río Piedras，邮编：00931
科妮莉亚·巴格曼
2霍华德·休斯医学院，美国纽约州洛克菲勒大学神经回路和行为实验室，邮编：10065
维维克·贾亚拉曼
1Howard Hughes医学院，Janelia Farm Research Campus，Ashburn，VA 20147，USA
卡罗·斯弗波达
1Howard Hughes医学院，Janelia Farm Research Campus，Ashburn，VA 20147，USA
洛伦·卢格
1Howard Hughes医学院，Janelia Farm Research Campus，Ashburn，VA 20147，USA
1Howard Hughes医学院，Janelia Farm Research Campus，Ashburn，VA 20147，USA
2霍华德·休斯医学院，美国纽约州洛克菲勒大学神经回路和行为实验室，邮编：10065
4波多黎各大学化学系-波多黎各圣胡安Río Piedras，邮编：00931
三当前地址：The Stowers Institute，Kansas City，MO 64110，USA
- 补充资料
1:补充图1。提高GCaMP2的蛋白质稳定性。补充图2。突变株产生位置摘要
补充图3。在HEK293细胞检测中筛选GCaMP2突变体。
补充图4。在HEK 293细胞中，筛选出了一些基线亮度和信号变化改善的突变体。
补充图5。GCaMP3的单次试验响应示例
补充图6。GCaMP2和GCaMP3对海马脑片神经元自发活动的成像
补充图7。GCaMP3对低频刺激的单次试验荧光反应示例
补充图8。D3cpV（顶板）或TN-XXL的单次试验反应示例
补充图9。动作电位检测概率
补充图10。在中表达GECI秀丽线虫
补充图11。GECI的长期表达可导致神经元形态和传感器特性的改变
补充图12。表达或不表达GCaMP3的神经元的本征和电路特性
补充表1。HEK 293细胞筛查中改良GCaMP的总结
补充表2。比较GCaMP3、GCaMP2和基于FRET的传感器
补充表3。基因编码钙指示剂在大鼠AWC神经元中的表达秀丽线虫
补充电影1。GCaMP2在培养海马脑片中显示的自发神经活动（3x实时）
补充电影2。GCaMP3显示培养海马脑片中的自发神经活动（3x实时）
补充电影3。在140秒的双光子图像序列中，清醒、行为正常的小鼠初级运动皮层（M1）中表达GCaMP3的2/3层神经元群体的自然活动（10倍实时）
GUID:65A57DB3-5C22-4361-9CEF-2D3A2DAA2621
摘要
基因编码钙指示剂（GECI）可用于对特定神经元群体的活动进行成像。然而，与合成指示器和记录电极相比，当前GECI产生的信号较差，无法检测到低发射率。我们开发了一种基于GCaMP2（GCaMP3）的单波长GECI，具有增加的基线荧光（3x）、动态范围（3x）和更高的钙亲和力（1.3x）。在锥体细胞树突中检测到由单动作电位触发的GCaMP3荧光变化，其信噪比和光稳定性明显优于GCaMP2、D3cpVenus和TN-XXL。在秀丽隐杆线虫化学感觉神经元与黑腹果蝇新指标（4-6x）显著增强了触角叶、感觉刺激诱发的荧光反应。在完整小鼠的体感和运动皮层神经元中，GCaMP3检测到钙瞬变，其幅度与动作电位数线性相关。行为正常小鼠运动皮层的长期成像显示，成像神经元在数月内出现了较大的荧光变化。
简介
钙是一种普遍的第二信使，在广泛的组织和生物体中调节重要的细胞信号事件。在神经元中，动作电位（AP）触发细胞质游离钙的大而快速的变化。类似地，突触传递过程中突触谷氨酸受体的激活产生[Ca2+]树突棘中的瞬变。使用合成钙指示剂的钙成像已被用于测量神经元群的神经元尖峰和突触输入在体外
1和体内
2,三然而，合成指示剂很难靶向特定的细胞类型或亚细胞位置（但参见4). 加载过程具有侵入性，并对神经组织造成损伤，从而避免了反复、慢性体内测量值。
基因编码钙指示剂（GECI）（也称为荧光钙指示剂蛋白；FCIP）是合成指示剂的替代品。GECI可以很容易针对特定的细胞类型或亚细胞隔室（有关审查，请参阅5). 它们与长期重复的体内测量6GECI由钙结合域组成，如钙调素或肌钙蛋白C，融合到一个或两个荧光蛋白（FP）（有关审查，请参见7,8). 在单FP-GECI中，循环置换FP（cpFP）的荧光强度受到发色团环境中钙结合相关变化的调节9,10在两个FP-GECI中，钙结合调节FP之间的荧光共振能量转移（FRET）11——13.
GECI已经得到了反复改进，并正在成为神经活动定量成像的有用工具体内基于钙调素的FRET指示剂D3cpVenus（D3cpV）13最近有报道在器官型小鼠脑切片和体内
14肌钙蛋白C基指示剂TN-XXL已用于慢性体内小鼠脑活动成像6在基于单FP的GECI中，GCaMP家族在多种模式生物中的应用最为广泛15——17然而，所有可用GECI的性能在信噪比（SNR）、响应线性、光稳定性和适当调节的钙亲和力方面仍低于合成指标。GCaMP指标的蛋白质稳定性较差。每一个参数的改进都将有助于神经活动的成像。
最近，加州2+-求解了GCaMP2的束缚和自由结构18,19，为合理改善指标属性奠定基础。结合蛋白质结构导向突变和半理性文库筛选（有关GECI设计的审查，请参阅20)，我们开发了改进的GCaMP变体。与GCaMP2相比，最佳突变体GCaMP3更明亮，具有更高的蛋白质稳定性，并且具有更大的动态范围和更高的钙亲和力。GCaMP3比FRET指示剂D3cpV和TN-XXL更具光稳定性，并且显示出显著更高的灵敏度和更快的动力学，尤其是在较高的活性水平下。GCaMP3在哺乳动物细胞培养、脑片中的锥体神经元以及蠕虫、苍蝇和小鼠中显示出更高的灵敏度体内.
结果
GCaMP3的结构导向工程
在HEK293细胞中，GCaMP2的荧光比EGFP低一百倍(补充图1a). 添加蛋白酶体抑制剂（10μM乳酸菌素）增加了表达GCaMP2的HEK293细胞的基线荧光(补充图1b). 我们推断，在GCaMP2引发剂蛋氨酸之后立即发现的N末端精氨酸可能会破坏蛋白质的稳定性21事实上，转染了缺乏精氨酸突变体GCaMP2.1的HEK293细胞的基线荧光比转染GCaMP2的细胞高40%(补充图1b).
然后我们创建了GCaMP2.1变体的小型库通过在EGFP发色团附近和“超折叠GFP”位置的许多位点进行定点突变22(补充图2). 虽然在细菌裂解物中筛选GCaMP突变体获得了较高的吞吐量，但我们发现基线荧光和动态范围与更完整的制剂相关性较弱(补充图3). 因此，我们设计了一种基于哺乳动物细胞的HEK293细胞高通量检测方法。通过用乙酰胆碱激活内源性毒蕈碱受体来诱导钙瞬变(补充图3d). GCaMP转染HEK293细胞的乙酰胆碱滴定结果显示，动态范围和基线荧光增加的两个点突变（T116V；GFP T203V和M66K；GFP M153K）。一个单一突变体（T116V）和一个双突变体（T116V和M66K）分别命名为GCaMP2.2和GCaMP2.3(,补充图4和补充表1).
体外GCaMP3的特性(一)在HEK293细胞中，筛选出了一些基线亮度和信号变化改善的突变体。(b条)GCaMP2和GCaMP3的示意图。突变残基以红色突出显示(c（c）)1 mM Ca的GCaMP3和GCaMP2（1μM蛋白质）的荧光光谱2+或MOPS缓冲液中的10 mM EGTA（30 mM MOPS，100 mM KCl，pH 7.5）（三次独立测量的平均值）。将每个指示剂的荧光强度归一化为钙饱和光谱的峰值。插图显示了非正常荧光发射光谱（485 nm激发）。(d日)钙2+MOPS缓冲液中的滴定曲线（1μM蛋白质）。插图显示了两个指示器的动态范围。(e（电子）)与GCaMP2相比，GCaMP3的基线荧光有所改善。这两种指标要么被转染到HEK293细胞中，要么被病毒传递到2/3层皮层神经元中。在转染后48小时或病毒注射后12天拍摄图像，然后用Volocity 5.0（即兴）进行分析。50μm比例尺。误差线表示平均值的标准偏差。
为了提高GCaMP对钙的亲和力，以便更好地检测与单个AP相关的小而快速的钙增加，我们分析了EF-hands的突变以及M13肽和钙调素（CaM）之间的界面(补充图2). 氨基酸替换N363D（CaM N60D）到GCaMP2.2和GCaMP2.3增加了小钙瞬变的荧光变化，对基线荧光几乎没有影响(和补充图4). GCaMP2.2-N363D和GCaMP2.3-N363D分别命名为GCaMP2.4和GCaP3(和补充表1). GCaMP3在乙酰胆碱检测中显示出最大的信号变化(和补充图4)并对其进行了进一步表征。
纯化GCaMP3的荧光光谱与GCaMP2的荧光光谱相似，但激发峰略有红移(). 在3-（N-吗啉基）丙磺酸（MOPS）缓冲液中测定的GCaMP3蛋白具有动态范围（F最大值/F类最小值)约为12，是GCaMP2的3倍(-插图）。这是由无钙荧光减少2倍和钙饱和荧光增加1.5倍引起的(-插图）。GCaMP3对Ca的亲和力2+比GCaMP2高1.3倍（660±19 nM对840±25 nM(第页=0.0017，配对t检验）().
在HEK293细胞中，GCaMP3显示出比GCaMP2高2.6倍的基线荧光(-顶部）。表达时通过在皮层2/3层神经元中的病毒基因转导，基线荧光比GCaMP2高约3.9倍(-底部）。鉴于纯化GCaMP3在载脂蛋白状态下的荧光较低，基线荧光的增加可能是由于蛋白质表达增加和37°C下的稳定性所致。
脑切片中GCaMP3的特征
我们测量了培养脑片中锥体神经元GCaMP3的AP触发荧光反应()23,24和室温下急性新皮质脑切片(). 在培养切片中，GCaMP3通过生物转染传递。GCaMP3荧光强度增加（ΔF/F=46±4.2%，n个=9个细胞）在根尖树突底部可靠地检测到，以响应所有细胞中的单个AP（100%单次试验检测；补充图5a). GCaMP3的平均ΔF/F(n个=9个细胞）分别为185±13%、250±27%、320±35%、480±50%、600±100%和620±130%(). 信噪比（SNR；参见方法)1个AP、5个AP和40个AP的GCaMP3分别为16.3±10.9、167.1±65.1和371.4±102.8(). 与GCaMP2相比，荧光增强和单一AP检测效率显著提高（1 APΔF/F=17±10%；38%单次试验检测）24培养海马切片中GCaMP3的动力学与GCaMP2相似（GCaMP3:升高T1/2=83±2毫秒；衰变T1/2=610±32毫秒；GCaMP2：上升T1/2=95±15毫秒；衰变T1/2=480±130毫秒24; 10个AP刺激的所有测量值）。与GCaMP2相反，GCaMP3的改进特性允许对培养海马切片中的自发群体活动进行成像(补充电影1、2和补充图6).
GCaMP3在海马锥体和2/3层皮层神经元中的动作电位诱发反应(一)顶端树突基底的线扫描定位和体部的诱发动作电位。10μm比例尺。显示荧光基线和单动作电位诱发反应的原始线扫描图像。(b)GCaMP3对器官型切片中单个海马锥体细胞的平均试验反应(n个=9个细胞，细灰线），每个刺激的所有细胞平均值（粗黑线）。注意每个面板的y轴刻度不同。(c（c）)GCaMP3在2/3层皮层神经元（S1）中的表达通过子宫电穿孔。20μm标尺。(d日)GCaMP3对2/3层皮层细胞的平均试验反应(n个=9个细胞，灰色细线），以响应83 Hz下给出的动作电位序列，以及跨细胞平均值（黑色粗线）。注意每个面板的y轴刻度不同。(e、 （f）)单个海马锥体细胞（细灰线）对83 Hz动作电位序列的GCaMP3反应的振幅和信噪比，以及跨细胞平均值（粗红线）。(克)GCaMP3的平均响应大于GCaMP2。(小时)GCaMP3的信噪比也大于GCaMP2。误差线表示平均值的标准偏差。
接下来，我们测试了由CAG启动子驱动的长期表达后，GCaMP3在第2/3层（L2/3）体感皮层锥体神经元中的表现通过子宫电穿孔(和补充图5b). 顶端树突基底GCaMP3的平均ΔF/F为14±2.7%(n个=9个细胞），用于单动作电位，505±220%用于40个AP(补充图5b、图2d、g和补充表2). 与GCaMP2相比(n个=8个细胞），GCaMP3的ΔF/F和SNR大2-5倍(和补充表2). 单个试验中的单个动作电位可在高达6 Hz的频率下解析(补充图7). 急性脑切片中100%棘波检测的阈值为2个AP，1个AP的检测率约为90%(补充图5b和8a)略低于培养脑片的表现。这种差异的来源不得而知。
基于GCaMP3和FRET的GECI的比较
我们比较了D3cpV和TN-XXL的性能()在相同的实验条件下，达到GCaMP3。在基线钙水平下，FRET指标（基于完整的荧光蛋白）比GCaMP3更亮（数据未显示）。然而，FRET指示剂产生的荧光变化较小(补充图9,和补充表2)与GCaMP3相比，信噪比更低(以及表2）。此外，GCaMP3比FRET指标更具光稳定性。在对体细胞和近端树突进行10个150秒的框架扫描照明周期（样品中为10 mW）后，30秒的黑暗穿插其间，GCaMP3荧光保持不变（初始荧光的109%），而TN-XXL（36%CFP；70%YFP）和D3cpV（59%CFP，84%YFP(). 平均荧光上升时间相似：GCaMP3、TN-XXL和D3cpV分别为95±27 ms、80±18 ms和108±26 ms(-左）。GCaMP3的荧光衰减时间（650±230 ms，n个=7个细胞），显著短于FRET指标（TN-XXL，1550±640 ms，n个=10个单元格(第页=0.0016，配对t检验）；D3cpV，9500±3400毫秒，n个=10个单元格(第页=1.7e-05，配对t检验）(-右侧）。
急性皮质切片锥体细胞主树突GECI对反向传播动作电位反应的比较(一)基于FRET的钙指示剂D3cpV和TN-XXL的示意图。(b条)跨细胞动作电位序列的荧光响应平均值(n个=7个细胞，每个细胞1次试验）。从下到上的轨迹表示对列车1、2、3、5、10、20和40个AP的响应。(c（c）)单个海马锥体细胞的D3cpV和TN-XXL对83 Hz动作电位序列的反应比率变化（细灰线），以及细胞间平均值（粗黑线）。(d日)D3cpV和TN-XXL的信噪比。(e、 （f）)比较GCaMP3、D3cpV和TN-XXL的平均响应（ΔF/F或ΔR/R）和信噪比。较低刺激的缩放如插图所示。(克)周期性双光子帧扫描期间的平均细胞荧光(n个=每个GECI 3–4个细胞）。(小时)10个AP下所有三个指标的上升和下降时间比较。误差线表示平均值的标准偏差。
在绝对反应和信噪比方面，GCaMP3在整个刺激范围内表现优于FRET两个指标，尤其是在2–20个AP中(和表2）。GCaMP3还显示出更好的光稳定性和更快的动力学(). 这些因素转化为改善生理相关钙信号的检测和测量(补充图8a).
成像感觉诱发钙2+瞬态秀丽线虫
为了比较GCaMP3和以前的GCaMP对感觉神经元中感觉刺激诱发活动的反应，我们创建了稳定的秀丽线虫在两个AWC神经元（AWC）之一中表达GCaMP1、GCaMP2和GCaMP3的细胞系打开). AWC神经元中GCaMP1和GCaMP2的表达引起了一些转基因系的行为扰动，反映为局部搜索转向减少。相反，表达GCaMP3的蠕虫没有检测到细胞毒性或行为扰动(补充图10和补充表3). 根据气味添加-去除序列对单个蠕虫进行成像16异戊醇抑制AWC打开导致所有三个GCaMP指标的荧光降低(). 相对于GCaMP1，两种较新的GCaMPs的荧光变化较大（GCaMPl为−13±6%，GCaMP2为−27±8%，GCaMP3为−38±8%）。随后去除诱人的气味导致AWC的荧光平均增加455±48%打开表达GCaMP3的神经元，比GCaMP2（113±25%ΔF/F）和GCaMP1（88±19%ΔF/F）提高约4-5倍(). 由于转基因的镶嵌性质，传感器表达水平的变化妨碍了指标基线亮度的定量比较。
体内传感器激发钙的成像2+GCaMP瞬态秀丽线虫中GCaMP1、GCaMP2和GCaMP3的气味诱发反应秀丽线虫嗅觉神经元。在气味添加-去除序列后，对表达GCaMP的转基因蠕虫株进行成像。(a、 b条)气味出现时，GCaMP3和GCaMP2的荧光强度也有类似的降低。(c、 d日)去除气味后，GCaMP3的荧光响应比GCaMP2和GCaMP1增加了4-5倍。灰色条表示存在气味。黄色间隔在b条和d日每个轨迹和误差条的灰色阴影表示平均值的标准误差（S.E.M。，n个=每个基因型12只动物）。
成像感觉诱发钙2+瞬态果蝇属
然后，我们将GCaMP1.6和GCaMP3表达为果蝇属触角叶（AL）的嗅觉投射神经元（PN），并比较它们对气味应用的反应（GCaMP2在果蝇属
25). 单个GCaMP拷贝足以在触角叶（AL）肾小球中产生可见荧光（数据未显示），但我们使用两个拷贝以允许在低激光强度下成像。我们对一个已确定的肾小球DM2的神经活动进行了成像()针对醋和乙酸异戊酯这两种气味。我们发现，与GCaMP1.6相比，GCaMP3的DM2中的荧光变化增加了约4倍，这是通过框架扫描测量的()对食醋的反应（GCaMP3的平均ΔF/F为143.7±16.7%；GCaMP1.6的平均△F/F是39.3±10.9%）。当用乙酸异戊酯气味刺激苍蝇时，肾小球DM2也获得了类似的结果（数据未显示）。这些数据表明，在测量感觉诱发Ca方面，GCaMP3比现有的GCaMP有了重大改进2+无脊椎动物的瞬态。
体内传感器激发钙的成像2+GCaMP的瞬态果蝇属GCaMP1.6和GCaMP3在大鼠海马投射神经元中的气味诱发反应果蝇属天线瓣（AL）。(一)GCaMP1.6和GCaMP3在AL的DM2肾小球中的表达。DM2 ROI用虚线圈出，用于框架扫描。10μm比例尺。(b条)比较GCaMP1.6和GCaMP3对醋的DM2框架扫描反应。每只动物的5次试验平均反应，表达GCaMP1.6（左侧面板）或GCaMP3（右侧面板）。(c（c）)所有试验和动物的GCaMP1.6（3只动物的4AL）和GCaMP3（4只动物的4 AL）的峰值响应。与GCaMP1.6相比，GCaMP3的反应增加了约4倍。此处显示的比较非常重要(第页=6.80e-08，Mann-Whitney）。误差线表示平均值的标准偏差。
影像学诱发和自发钙2+小鼠皮层的瞬变体内
为了在脊椎动物中测试GCaMP3，我们将其传递给2/3层体感或运动皮层神经元通过腺相关病毒感染（AAV2/1；突触蛋白-1发起人）。感染12天后，我们观察到GCaMP3在2/3层锥体神经元中的稳健表达(). 我们使用双光子显微镜对标记的细胞体进行成像，同时记录全细胞或细胞附着结构中的动作电位().
体内钙2+GCaMP3对清醒、有行为的小鼠诱发和自发活动的成像(一)病毒感染的L2/3神经元的同步双光子成像和电生理示意图体内. (b条)麻醉下从三个神经元到50Hz诱发AP的单次试验反应（灰线）和10次试验平均值（黑线）示例。(c（c）)GCaMP3对诱发APs的反应呈线性ΔF/F(n个=9个细胞，灰色细线；每个神经元平均10次试验，粗红线）。(d日)头戴式行为期间荧光变化（黑色）和峰值活动（红色，每0.5秒箱中的AP数量）同步记录的示例轨迹。在松散密封细胞连接模式下记录AP。(e（电子）)响应动作电位的荧光变化，间隔0.5秒。来自3只动物的6个细胞用不同的颜色表示。误差条表示平均值的标准偏差。(（f）)衰减时间的累积分布（T½，最后一个荧光最大值的单指数拟合）。10至120天，核排斥神经元的衰变时间相似（彩色线，第页=0.22，Kolmogorov–Smirnov检验）。充满核的神经元的衰变时间明显更长（黑线，第页=5.78e-10，Kolmogorov–Smirnov试验）。(克)注射后72天，初级运动皮层L2/3神经元中GCaMP3的表达（顶部，30μm标尺）和单个细胞的ΔF/F轨迹（底部，黑线）。用红线表示跑步机的相对运动（F：向前，B：向后）。(小时)注射后120天的视野和荧光痕迹与（g）相同。
我们首先测试了在麻醉小鼠中由短电流脉冲触发的动作电位引起的GCaMP3的荧光变化。GCaMP3的平均荧光响应与50Hz下1、2、3、5或10列动作电位的数量几乎呈线性关系(). 单个AP导致荧光增加7.9±2.8%(n个=9个单元格）(). 对于2、3、5和10次AP的爆发，相应的反应分别为12.5±6.4%、21.2±6.4%，43.7±18.0%和94.7±42.5%(n个=9个单元格）(). 单脉冲检测率为70%，3个AP序列检测率为90%，较长序列检测率100%(补充图8b). 与生理温度（37°C）下的快速钙挤压一致26，GCaMP3表现出更快的动力学体内（衰变T1/210次脉冲：384±76 ms）与切片制备相比(第页=0.0015，配对t检验）。
接下来，我们拍摄了清醒小鼠在跑步机上跑步时，当记录松散密封细胞连接结构中的动作电位时，GCaMP3对感觉诱发和自发钙瞬变的响应荧光变化(). GCaMP3的荧光变化与每0.5秒3个至20个动作电位的数量呈线性相关(n个=来自3只动物的6个细胞）(). 单动作电位和双动作电位检测不可靠，可能是因为运动噪音和清醒大脑中基线钙水平升高。
小鼠GCaMP3慢性成像
我们发现GECIs在皮层神经元中的长期表达通过子宫电穿孔导致一些细胞的生理改变。我们在约8.3%的GCaMP3-、13%的D3cpV-和5%的TN-XXL标记的L2/3锥体神经元中观察到P25-P28处的明亮核荧光(补充图11a). 充满细胞核的神经元减弱了GCaMP荧光反应（数据未显示），并减少了神经活动引起的钙变化(补充图11b). 抗-His6免疫染色主要检测到胞质GCaMP3，表明细胞核中充满了N-末端切割的GCaMP3(补充图11c). 这些结果表明，标记细胞核的神经元中钙稳态和GECI功能均受损。
GCaMP3出生后推出时通过病毒转导（在突触蛋白-1启动子），注射部位附近的一些神经元明亮且充满细胞核(补充图11d). 充满核神经元的自发荧光瞬变具有较长的衰减时间，这是生理异常的另一个特征(). 这些受到干扰的细胞很容易被视觉识别出来以排除在外。基础荧光随着距离注射部位的距离而降低，并且在大脑的大面积区域被排除在外，即使在表达120天后也是如此(和补充图11d). 我们使用了多种生理学方法来测试排除核的GCaMP3阳性神经元的改变特性。我们在脑切片中记录了表达GCaMP3的神经元2至3周。与GCaMP3阴性细胞相比，GCaMP3-阳性神经元具有相似的静息电位和兴奋性(补充图12a、b). 我们使用激光扫描光模拟电路测绘27测试GCaMP3阳性神经元的突触特性变化。我们发现GCaMP3阳性和GCaMP3-阴性神经元具有无法区分的总突触输入(补充图12c，d). 因此，选择显示排除核的G-CaMP3表达的神经元，可以在广泛的皮层表面上实现定量光学生理学。
作为慢性病的证明体内钙成像我们使用腺病毒载体GCaMP3来成像体内通过颅窗反复检测运动皮层神经元的钙活性(). 当头戴眼镜的老鼠在跑步机上跑步时，在140秒的成像时间内，许多神经元显示出大幅度的荧光瞬态28(和补充电影3). 运动皮层的群体活动与运动活动相关(). 核排斥成像细胞中自发钙瞬变的荧光衰减率在感染后120天是稳定的(). 感染后72天和120天对同一神经元群进行重复成像，结果显示GCaMP3表达和信号变化显著稳定(). 这些结果表明，GCaMP3适合长期成像大型神经元群体的行为相关活动。
讨论
GCaMP3的改进特性允许在多模型生物中应用新型神经科学。在秀丽线虫，GECI的表达导致了行为表型29，可能是由于指示剂过度表达引起的神经生理学改变(补充图10和补充表3). 表达GCaMP3的神经元表现出高信噪比，没有检测到细胞毒性或行为扰动(补充图10). GCaMP3提供的信号电平更高()可以进行低表达水平的实验，改善与钙缓冲相关的问题。
在果蝇属，GCaMP2的低表达25GCaMP1.3和1.6已成为最先进的单FP指示器，但其低灵敏度和非线性响应阻止了对低射速的检测30.GCaMP3的表达和信号水平有了很大提高体内()没有明显的细胞毒性或行为表型（数据未显示），并且可以进行以前不可能的成像实验。
在行为正常的小鼠中，GCaMP3可以在数月内同时记录数十个已识别神经元的活动(). 因此，GCaMP3应允许在多个录音会话中跟踪电路级活动中学习引起的变化。GCaMP3的泛神经表达可以像超分辨率功能MRI一样，对整个大脑活动和信号传播进行宽场成像31.
GECI在小鼠大脑中的长期高水平表达可能导致非功能性指标32和异常生理(补充图11). 虽然GCaMP3在出生后大脑中的表达通过病毒基因转移介导，限制了这种不良影响，但核填充神经元的比例仍随着注射部位的接近而增加，并在注射后缓慢增加。因此，优化表达的时间和大小以平衡信号水平和细胞毒性需要进一步研究。
与单FP GECI相比，比率指示器具有潜在优势，包括更高的基线亮度和对运动伪影不敏感通过波长比率。然而，GCaMP3更具光稳定性，可能是因为在低荧光状态下减少了漂白(). 通过共同表达或融合参考荧光蛋白，GCaMP3可以实现比率测量。GCaMP3的较小尺寸可能有助于更广泛的靶向蛋白融合，用于亚细胞室中的钙成像。GCaMP3的更快动力学可以更准确地检测棘波序列中动作电位的数量和时间。
GCaMP3可能不是最适合所有应用的GECI。也可以使用D3cpV检测单动作电位14; 事实上，D3cpV的缓慢动力学可能适用于以极低和稀疏峰值速率为特征的情况。以肌钙蛋白为基础的指标，如TN-XXL，可能导致内源性钙信号的扰动较小6谨慎性要求在特定应用环境中测试每个指标。
尽管GCaMP3是对GCaMP2的重大改进，但蛋白质工程的其他途径仍然存在。GCaMP的CaM和M13pep结构域消融相互作用的突变，如对D2/D3/D4指示剂的突变13，可以提高高表达级别的性能。基于肌钙蛋白C的单FP指标33可能将非内源性钙结合蛋白的益处与GCaMP的高信噪比和快速动力学相结合。定量建模研究20已经表明，增加荧光开启率将进一步改善与单个AP相关的短暂钙瞬变的检测。将GCaMP3表达水平稳定、适度维持数月的表达盒将有助于信号校准，并进一步降低毒性问题。
方法
构建和病毒生产
原始GCaMP2表达构建物来自M.Kotlikoff34，O.Griesbeck的TN-XXL6和A.Palmer的D3cpV13将GCaMP亚克隆到pRSETa中，用于表达和纯化大肠杆菌将GCaMP亚克隆到pCMV中，用于HEK293细胞分析和培养脑片实验。将GCaMP变异体、TN-XXL和D3cpV亚克隆到pCAGGS载体中，该载体带有CAG启动子（CMV-enhancer、β-actin启动子和土拨鼠肝炎病毒的调节元件35（WPRE））子宫内电穿孔36.pCAG-樱桃37与GCaMP联合转染用于培养海马脑片和子宫内电穿孔以更好地控制表达水平。为了制造转基因虫和蝇，GCaMP被亚克隆到pSM中街道-2发起人（来自C.I.Bargmann）和pMUH（来自Janelia Farm Research Campus的Barret Pfeiffer的礼物）。pMUH-GCaMP被整合到attP40整合酶的第二个位点果蝇属染色体38（遗传服务公司）。对于体内小鼠钙显像、GCaMP2和GCaMP3的表达是使用腺相关病毒2/1（AAV2/1）在泛神经人类控制下驱动传感器突触蛋白-1发起人39将.GCaMP2和GCaMP3亚克隆到rAAV-hSYN表达载体中，并产生活病毒（宾夕法尼亚大学载体核心服务）。所有结构均通过测序进行验证。
细菌蛋白表达、纯化和测试
pRSETa中的GCaMP转化为化学活性的BL21（DE3）-pLysS，并纯化通过N端His标签。蛋白质浓度由固有色氨酸荧光测定。在pH 7.2条件下，使用10 mM K混合物进行钙钳制2H（H）2EGTA和Ca2来自钙校准试剂盒#1（Invitrogen）的EGTA。游离[Ca2+]使用MAXCHELATOR（maxchestrator.stanford.edu）计算水平。在Safire上记录荧光光谱2荧光板阅读器（帝肯）。此处的动态范围计算为F最大值/F类最小值.英尺最大值是饱和时的荧光强度[Ca2+]和F最小值是零处的荧光强度[Ca2+].
HEK293基于细胞的屏幕
使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将pCMV中的GCaMP转染到HEK293细胞中，并在转染后48小时进行成像实验。用FDSS平板阅读器（哈马松）对96-well平板中转染GCaMP的293个细胞进行成像。读取开始10秒后自动添加乙酰胆碱（Ach）。使用Volocity 5.0（即兴）量化亮度。
蠕虫钙成像
如前所述，对表达GCaMP的蠕虫进行钙成像16在定制设计的微流体装置中对每个基因型总共12只动物进行研究，并对气味刺激的荧光响应进行平均。对于气味呈现，每只动物首先在成像芯片中饥饿20分钟。在60秒的记录中，气味在t=10秒时呈现，在5分钟后，在第二次60秒记录中，在t=10s时消除。
小鼠脑片制备
使用标准方法制备海马切片培养物24,40对于生物活性基因转移，每个完整的试管使用10μg的DNA。在基因转染后24–48小时进行成像实验。在急性切片实验中，通过以下方法将GECI导入E-16小鼠胚胎子宫内电穿孔35，如前所述，在P14-17准备急性切片24.
苍蝇种群、准备和气味传递
苍蝇在标准玉米粉琼脂培养基上饲养。我们使用Gal4/UAS系统41将钙传感器的表达导向PNs。加纳146-镀锌4苍蝇是L.Luo（加州斯坦福斯坦福大学）送的礼物。无人机-GCaMP1.6苍蝇是D.Reiff和a.Borst（MPI，Martinsried，德国）赠送的礼物。所有实验动物均为羽化后3-5天的成年雌性。使用上述方法解剖成虫11将苍蝇麻醉在冰块上的小瓶中，直到运动停止（<15秒），然后轻轻插入铝箔的一个孔中。使用小滴蜡（55°C）将苍蝇悬挂在洞中，箔片边缘围绕头部和胸部形成一个水平面，从前面的第一触角段到后面的盾片。箔的背侧浸泡在盐水中，而腹侧（包括触角和上颌触须）保持干燥，可以闻到气味。在眼睛之间的背部头部角质层上切下一个窗口，从短颈延伸到第一触角段。大脑背侧和前部的脂肪囊和气囊被切除，但神经鞘完好无损。用一小滴蜡将长鼻贴在一缕头发上，以限制大脑活动。在记录期间（1.5–3小时），通常在该准备过程中观察到自发的腿部运动。所有实验中使用的生理盐水组合物为42（单位：mM）：103氯化钠，3氯化钾，5N个-三（羟甲基）甲基-2-氨基乙烷磺酸、10海藻糖、10葡萄糖、2蔗糖、26 NaHCO三，1 NaH2人事军官4，1.5氯化钙2和4 MgCl2，用95%O起泡时，调节至275 mOsm，pH值7.32/5%一氧化碳2.
气味(顺式-3-己烯-1-醇（顺式）和乙酸异戊酯（ia））通过定制的气味传递系统和一个特氟隆喷嘴（入口直径1/8〃）直接输送至天线。在最终浓度约为15%的恒定气流（1 l/min）中传递气味。使用mini-PID（加拿大安大略省Aurora Scientific Inc.）测量气味传递时间。气味出现时间为3秒或5秒。所有传感器性能的比较都是使用相同气味呈现时间的实验进行的。报告的结果基于从3只表达GCaMP1.6的苍蝇（4只AL）和4只表达GCa MP3的苍蝇中获得的数据。
飞行中的钙成像
我们使用Olympus 0.8 NA LUMPlFI40XW/IR2物镜在双光子激光扫描显微镜（Prairie Technologies）上成像。使用调谐至920nm的锁模Ti:Sapphire变色龙Ultra II激光器（相干，加州圣克拉拉）作为激励源。使用525/70nm发射滤波器进行带通滤波后，使用光电倍增管（日本滨松市滨松）收集荧光。使用PrairieView软件以帧扫描模式（4–16 Hz）采集一个天线叶的单个平面的图像。
脑切片的电生理和钙成像
我们在室温（22–24°C）下对海马片培养中的CA1细胞和急性脑片中皮质层2/3锥体细胞（S1）进行了记录。从硼硅酸盐玻璃（带灯丝的标准壁）中拔出贴片吸管，当填充内溶液（128 K-甲基硫酸盐或K-葡萄糖酸盐、10 HEPES、10 Na磷酸、4 MgCl）时，其电阻为4-6 MΩ2，4钠2ATP，0.4钠2GTP，3抗坏血酸（pH 7.25290 mOsm），单位：mM）。像以前一样进行切片记录和同时行扫描成像24在记录过程中，将切片浸泡在ACSF（127 NaCl，25 NaHCO）中三，1.25 NaH2人事军官4，25葡萄糖，2.5 KCl，2 CaCl2，1氯化镁2（单位：mM）充满碳。如果细胞具有GECI荧光的核排斥，输入电阻至少为100 MΩ，培养切片中的静息电位≤−50 mV，或急性切片中≤−65 mV，则选择这些细胞进行数据分析。对于诱发动作电位刺激的实验，向浴中添加10μM（R）-CPP（Tocris）和10μM NBQX（Sigma）以阻断谷氨酸受体。通过贴片吸管注入电流（1–4 nA，2 ms），在83 Hz下触发动作电位。
以线扫描模式（500 Hz）在距基底20–50μm的顶部树突上进行成像(). Ti:Sapphire激光器（Mai Tai，Spectro-Physics，CA）调谐至910 nm用于GCaMP成像，860 nm用于激发FRET指示器。对于与mCherry共同表达的GCaMP，我们使用565nm二向色性和BG22（绿色通道）和HQ620/90（红色通道）发射滤光片将荧光分离为绿色和红色通道。对于基于FRET的GECI，我们使用505nm二向色性和HQ480/80（青色通道）和HQ535/50（黄色通道）发射滤光片分离荧光。从所有记录道中减去PMT暗电流。在切片培养记录中，平均基线荧光（F0)根据动作电位刺激前的滤波器原始轨迹（20 Hz）计算，如24.峰值荧光是通过将原始荧光时间序列约为20 Hz线性过滤痕迹峰值的30 ms平均值来确定的。对于急性切片，反应基线被定义为刺激前250ms窗口的平均值。峰值响应被计算为刺激停止500ms内过滤轨迹（100ms移动窗口）的最大值。该方法对0条AP记录道给出了约3%ΔF/F。噪声是在每个细胞水平上计算的，作为无刺激、1秒、漂白校正的示踪片段的平均标准偏差。对于显示，使用Savitzky-Glay过滤器（2）过滤示例记录道第顺序，50 ms跨度）。动作电位检测通过双盲心理测试和算法模板匹配进行量化。在心理测试中，向八名志愿者展示了一个反应模板，并询问它是否以随机顺序、顺序呈现的痕迹出现。假阳性率由对0个AP轨迹的响应来确定。算法方法计算了模板和荧光痕迹之间的最大互相关，荧光痕迹在刺激开始时滞后200毫秒。检测成功被定义为大于95%基线记录道的互相关值。基线记录道集由所有记录的0条AP记录道加上反转和/或反转的记录道组成。模板是平均3AP响应（GCaMP3）或平均5AP响应（D3cpV，TN-XXL）的前1.5秒。上升T1/2用电流注入开始到半峰反应之间的时间来测量海马神经元的数量。衰退T1/2测量为从峰值响应恢复到基线的单指数拟合的半衰减时间。所有分析均使用MATLAB（Mathworks，Natick，MA）进行。
体内小鼠钙显像与电生理
rAAV（AAV2/1；突触蛋白-1将启动子）注射到2-3周龄C57Bl/6Crl野生型小鼠的初级体感皮层（S1）。注射后两周，用2%异氟醚对小鼠进行麻醉，并在注射部位进行1.5毫米圆形开颅手术，如前所述43用贴片吸管记录细胞，其中含有（mM）：10.0 KCl、140 K-葡萄糖酸盐、10.0 HEPES、2.0 MgCl2，2.0氯化钙2，0.05 Alexa 594，pH 7.25290 mOsm。为了记录和刺激，使用了MultiClamp 700B放大器（分子器件，加利福尼亚州森尼维尔）。在全细胞模式下，通过2-5ms长电流注入诱发动作电位；在电池连接模式下，需要高达100nA的电流。Ti:Sapphire激光器（Mai Tai，Spectro-Physics，CA）被调谐至910 nm，用于GCaMP3成像。使用配备40X、0.8NA物镜的定制双光子激光扫描显微镜同时采集荧光图像（日本东京奥林巴斯）。以15 Hz（256×32像素）的频率采集帧扫描，持续3秒。
对于清醒、头部固定的跑步小鼠的成像，病毒注射和手术与麻醉状态相同，只是注射和开颅是在初级胡须和前肢运动区（M1）上进行的。此外，还使用了局部麻醉剂（马卡因）和全身麻醉剂（丁丙诺啡、0.1mg/kg IP和酮洛芬、5mg/kg SC）。在用加热垫完全恢复后，这些动物的头部受到限制，但可以在线性跑步机上自由奔跑。使用松散密封细胞连接配置记录动作电位，贴片移液管充满缓冲液（单位：mM:125 NaCl，2.5 KCl，25.0葡萄糖，10.0 HEPES，2.0 CaCl2，2.0硫酸镁4，0.05 Alexa 594；pH 7.4，285 mOsm），并使用MultiClamp 700B（分子器件，加利福尼亚州森尼维尔）放大信号。为了确认记录的神经元的身份，每次记录都是通过闯入细胞并注入红色移液管溶液来终止的。在成像过程中，动物通过零星的声音刺激（拍手声）或向胡须区吹气或吹气来保持警惕。使用16X、0.8 NA水浸物镜（美国尼康公司，德克萨斯州路易斯维尔），以4–8 Hz的帧速率采集图像，分辨率为256×512像素。使用ImageJ插件TurboReg纠正清醒时采集的所有图像中的运动伪影(http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/). ΔF/F通过减去基线荧光水平（F0, 35第个总荧光的百分位），并归一化为F0.
行为小鼠的慢性钙显像
对于慢性成像，如上所述进行手术和开颅手术，但GCaMP3-AAV在用牙科丙烯酸树脂密封成像窗口之前直接注射到皮层。对C57BL/6Crl野生型（感染AAV2/1）进行慢性显像-hsyn1型-GCaMP3）和PV-CRE小鼠44（感染CRE依赖型AAV2/1-hsyn1（hsyn1）-GCaMP3）感染后10至120天。为了在成像过程中保持动物的警觉和活跃，老鼠被限制饮水，并训练它们在胡须偏转时舔水以获得水奖励。通过拟合单个指数计算衰变时间（τ½，半最大值时的时间）。所有数据分析均使用MATLAB（Mathworks，Natick，MA）进行。
成像数据分析
对于体内如前所述，使用自动跟踪软件和MATLAB脚本分析蠕虫体内的荧光信号16.
在苍蝇中，荧光时间序列是通过对框架中肾小球的空间范围进行平均得到的。在所有情况下，根据气味出现前2秒以上的平均值，计算荧光变化相对于基线荧光水平的变化。
用于小鼠成像数据分析体内无核细胞体作为ROI进行荧光瞬态分析。排除了自发峰值的记录。ΔF/F是刺激开始后500ms内的荧光峰值增加除以刺激开始前三帧的平均值。动作电位检测采用相互关联模板进行量化，以对3个动作电位的平均反应的前6帧为模板，以1个动作电位和2个动作电位记录的后半部分（刺激后1.5-2.83秒，共100条记录）为基线。在清醒行为小鼠中，自发荧光瞬变的ΔF/F被计算为荧光峰值增加除以5的平均值第个–10第个荧光强度的百分位数。所有数据分析均使用MATLAB（MathWorks，Natick，MA）进行。
GCaMP3表达神经元的内在和电路特性表征
L2/3祖细胞通过子宫内用表达CRE重组酶的质粒在C57BL/6Crl E16时间妊娠小鼠中电穿孔CAGS公司如前所述的促进剂36,45在出生后第14天，一种CRE依赖型AAV病毒在人类体内表达GCaMP3突触素-将1个启动子注入新皮质。这种组合方法允许我们用GCaMP3标记L2/3锥体神经元的稀疏亚群。在50至95μm深度处记录细胞。进入细胞后，立即通过注入分级电流脉冲使细胞去极化。病毒感染后14至21天（P28至P34），通过腹腔注射氯胺酮/噻嗪混合物（0.13 mg氯胺酮/0.01 mg噻嗪/g体重）麻醉动物，并通过心脏灌注少量冰冷的ACSF，其中含有（mM）：130 NaCl，25 NaHCO三，25 D-葡萄糖，2.5 KCl，1.0 MgCl2，2.0氯化钙2和1.25 NaH2人事军官4，用95%O2/5%CO充气2将大脑取出并置于冰镇切割液中，该切割液含有（单位：mM）：110氯化胆碱、25氯化钠、25葡萄糖、11.6抗坏血酸钠、7.0氯化镁2，3.1丙酮酸钠，2.5 KCl，1.25 NaH2人事军官4和0.5 CaCl2用振动切片机（德国Walldorf，Microm）切下400μm厚的桶状皮层冠状切片，并在37°C的充氧ACSF中培养45分钟，然后进行记录。连续记录L2/3锥体神经元对（<100μm；一个GCaMP3+，另一个GCa MP3−）。我们通过使用谷氨酸开盖的激光扫描光刺激测量两个记录细胞的总兴奋性输入，比较了撞击GCaMP3+和GCaMP3−神经元的突触输入。简言之，在网格（16×16，间距75μm）上使用紫外线激光（DPSS Lasers）进行刺激。该区域包括皮质灰质和相邻桶状柱的整个厚度。在样品平面上用20 mW的激光功率对MNI-谷氨酸盐进行1 ms的非激发。我们证实，在我们的实验条件下，只有当激光束靠近神经元胞体时，这些刺激参数才会激发动作电位。当细胞保持在−70 mV时，仅绘制了兴奋性输入，接近快速抑制的逆转。在紫外线刺激后100毫秒内分析反应。直接反应和突触反应根据其不同的起始时间分开三。起效时间低于7 ms的反应被归类为直接反应(即。纯粹的突触后反应）和后来的突触反应。突触输入图被计算为7到75毫秒响应窗口中的平均电流。
信噪比（SNR）计算
在刺激开始前250 ms，SNR计算为ΔF/F或ΔR/R与滤波轨迹标准偏差（100ms移动窗口）的比值。
统计分析
P值由MATLAB中的Mann-Whitney算法计算。除非另有说明，否则所有数值范围均为平均值±标准偏差（SD）。
补充材料
1
补充图1。提高GCaMP2的蛋白质稳定性。
补充图2。突变株产生位置摘要
补充图3。在基于HEK293细胞的测定中筛选GCaMP2突变体。
补充图4。在HEK 293细胞中，筛选出了一些基线亮度和信号变化改善的突变体。
补充图5。GCaMP3的单次试验响应示例
补充图6。GCaMP2和GCaMP3对海马脑片神经元自发活动的成像
补充图7。GCaMP3对低频刺激的单次试验荧光反应示例
补充图8。D3cpV（顶板）或TN-XXL的单次试验反应示例
补充图9。动作电位检测概率
补充图10。在中表达GECI秀丽线虫
补充图11。GECI的长期表达可导致神经元形态和传感器特性的改变
补充图12。表达或不表达GCaMP3的神经元的本征和电路特性
补充表1。HEK 293细胞筛查中改良GCaMP的总结
补充表2。比较GCaMP3、GCaMP2和基于FRET的传感器
补充表3。基因编码钙指示剂在大鼠AWC神经元中的表达秀丽线虫
补充电影1。GCaMP2在培养海马脑片中显示的自发神经活动（3x实时）
补充电影2。GCaMP3显示培养海马脑片中的自发神经活动（3x实时）
补充电影3。在140秒的双光子图像序列中，清醒、行为正常的小鼠初级运动皮层（M1）中表达GCaMP3的2/3层神经元群体的自然活动（10倍实时）
致谢
我们要感谢J.Simpson和S.Hampel将GCaMP克隆到pMUH中，并感谢Fly Core制作苍蝇杂交。pMUH是B.Pfeiffer和G.Rubin慷慨赠送的礼物。感谢J.Seelig，他为果蝇属成像实验。感谢S.Viswanathan和S.Sternson协助筛选HEK293细胞中的突变体，以及J.Marvin协助筛选大肠杆菌感谢B.Zemelman在病毒生产方面的帮助。感谢H.Zhong、T.Sato和B.Borghuis开发图像分析软件。感谢D.K.O'Connor子宫内电穿孔辅助。感谢H.White和S.Winfrey负责细胞培养，B.Shields和A.Hu负责组织学，A.Arnold负责成像实验。感谢用于质粒制备和测序的分子生物学共享资源。感谢J.Marvin、J.Simpson和G.Tervo对手稿的批判性阅读。所有附属机构均为霍华德·休斯医学院、珍妮亚农场研究校园。
脚注
作者贡献
L.L.L.、K.S.、L.T.、S.A.H.、T.M.、项目设计；L.T.、L.L.L.、传感器设计和屏蔽大肠杆菌，HEK293细胞；L.T.、T.M.、S.A.H.、L.P.、GCaMP脑切片变异检测；脑切片S.A.H.、FRET传感器和GCaMP2检测；S.A.H.，L.T.，D.H.，脑切片成像数据分析体内; D.H.、。，体内小鼠脑成像；S.C.、C.B.、蠕虫成像和数据分析；V.J.，E.C.，苍蝇的钙成像和数据分析；S.A.M，S.A.H.，AP检测概率数据分析；J.A.、L.L.L、E.R.S.，结构分析；L.L.L.和L.T.领导了该项目；L.L.L.、K.S.、L.T.和S.A.H.撰写了这篇论文。
竞争利益声明
作者声明没有竞争性的经济利益。
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1Yuste R，Peinado A，Katz LC。发育中新皮质的神经元结构域。科学。1992;257:665–669.[公共医学][谷歌学者] 2Stosiek C，Garaschuk O，Holthoff K，Konnerth A.神经元网络的体内双光子钙成像。美国国家科学院院刊。2003;100:7319–7324. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 3Fetcho JR，Cox KJ，O’Malley DM。行为脊椎动物单细胞分辨率神经元群活动监测。组织化学杂志。1998;30:153–167.[公共医学][谷歌学者] 5Palmer AE，Tsien RY。使用基因靶向荧光指示剂测量钙信号。国家协议。2006;1:1057–1065.[公共医学][谷歌学者] 6Mank M等人。慢性体内双光子成像的基因编码钙指示剂。自然方法。2008[公共医学][谷歌学者] 7McCombs JE，Palmer AE。用基因编码的钙指示剂测量活细胞中的钙动力学。方法。2008;46:152–159. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 8Mank M，Griesbeck O。基因编码钙指示剂。化学修订版。2008;108:1550–1564.[公共医学][谷歌学者] 9Baird GS，Zacharias DA，Tsien RY。绿色荧光蛋白中的环形排列和受体插入。美国国家科学院院刊。1999;96:11241–11246. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 10Nagai T，Sawano A，Park ES，Miyawaki A。设计用于感知Ca2的循环排列绿色荧光蛋白+美国国家科学院院刊。2001;98:3197–3202. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Miyawaki A等人。基于绿色荧光蛋白和钙调蛋白的Ca2+荧光指示剂。自然。1997;388:882–887.[公共医学][谷歌学者] 12Heim N，Griesbeck O.基于肌钙蛋白C和绿色荧光蛋白的细胞钙动力学基因编码指标。生物化学杂志。2004年；279:14280–14286.[公共医学][谷歌学者] 13Palmer AE等。基于计算重新设计的钙调素肽对的钙离子指示剂。化学生物。2006;13：521–530。[公共医学][谷歌学者] 14Wallace DJ等。利用遗传钙（2+）传感器在体外和体内进行单脉冲检测。自然方法。2008[公共医学][谷歌学者] 15He J，Ma L，Kim S，Nakai J，Yu CR。编码小鼠犁鼻器官中的性别和个体信息。科学。2008;320:535–538. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Chalasani SH等。秀丽隐杆线虫嗅觉行为回路的解剖。自然。2007;450:63–70.[公共医学][谷歌学者] 17Wang JW，Wong AM，Flores J，Vosshall LB，Axel R.双光子钙成像揭示了苍蝇大脑中气味刺激的活动图。单元格。2003;112:271–282.[公共医学][谷歌学者] 18Akerboom J等。GCaMP钙传感器的晶体结构揭示了荧光信号变化的机制，并有助于合理设计。生物化学杂志。2008 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19Wang Q，Shui B，Kotlikoff MI，Sondermann H。GCaMP2钙传感的结构基础。结构。2008;16:1817–1827. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20雇佣SA、Tian L、Looger LL。用基因编码的钙指示剂报告神经活动。脑细胞生物学。2008;36:69–86. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21Varshavsky A.原子分辨率的N端规则。自然结构分子生物学。2008;15：1238–1240。[公共医学][谷歌学者] 22Pedelacq JD、Cabantous S、Tran T、Terwilliger TC、Waldo GS。超文件夹绿色荧光蛋白的工程与表征。国家生物技术。2006;24：79–88。[公共医学][谷歌学者] 23Pologruto TA、Yasuda R、Svoboda K。用基因编码的Ca2+指示剂监测神经活动和[Ca2+]。神经科学杂志。2004年；24:9572–9579. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 24Mao T，O'Connor DH，Scheuss V，Nakai J，Svoboda K。GCaMP型基因编码钙指示剂的表征和亚细胞靶向性。《公共科学图书馆·综合》。2008;三：e1796。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 25Hendel T，et al.基因钙指示剂和OGB-1的荧光变化与体内外神经活动和钙相关。神经科学杂志。2008;28:7399–7411. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 26Markram H，Helm PJ，Sakmann B.大鼠新皮质锥体神经元中单个反向传播动作电位诱发的树突状钙瞬变。生理学杂志。1995;485：1–20。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Shepherd GM、Svoboda K.大鼠大脑皮层2/3层锥体神经元上行兴奋性投射的层流和柱状组织。神经科学杂志。2005;25:5670–5679. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 28Dombeck DA、Khabbaz AN、Collman F、Adelman TL、Tank DW。用细胞分辨率对清醒、活动小鼠的大规模神经活动进行成像。神经元。2007;56:43–57. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 29Ferkey DM等。秀丽线虫G蛋白调节器RGS-3控制对感官刺激的敏感性。神经元。2007;53:39–52. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30Jayaraman V，Laurent G.使用电生理学对完整成年果蝇的神经活动基因编码光学传感器进行评估。前神经电路。2007;1:3. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 31Kim SG，Ogawa S.深入了解高分辨率功能MRI的新技术。神经生物电流。2002;12:607–615.[公共医学][谷歌学者] 32Hasan MT等。TET控制下转基因小鼠中的功能性荧光Ca2+指示蛋白。《公共科学图书馆·生物学》。2004年；2：e163。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 33Garaschuk O、Griesbeck O、Konnerth A.基于肌钙蛋白C的生物传感器：神经系统体内钙成像的新基因编码指标家族。细胞钙。2007;42:351–361.[公共医学][谷歌学者] 34科特利科夫MI。基因编码Ca2+指示剂：利用遗传学和分子设计来理解复杂的生理学。生理学杂志。2007;578:55–67. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 35Gray NW，Weimer RM，Bureau I，Svoboda K.体内新皮层突触PSD-95的快速再分配。《公共科学图书馆·生物学》。2006;4：e370。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 36Saito T，Nakatsuji N.使用体内电穿孔将基因高效转移至胚胎小鼠大脑。开发生物。2001;240:237–246.[公共医学][谷歌学者] 37Shaner NC等。从Discosoma sp.红色荧光蛋白中提取的改良单体红色、橙色和黄色荧光蛋白。国家生物技术。2004年；22:1567–1572.[公共医学][谷歌学者] 38Markstein M、Pitsouli C、Villalta C、Celniker SE、Perrimon N。利用位置效应和吉普赛逆转录病毒绝缘体来设计精确表达的转基因。自然遗传学。2008;40:476–483. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 39Thiel G，Greengard P，Sudhof TC。人类突触蛋白I基因启动子组织特异性转录的表征。美国国家科学院院刊。1991;88:3431–3435. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 40Stoppini L，Buchs PA，Muller D.神经组织器官型培养的简单方法。神经科学方法杂志。1991;37:173–182.[公共医学][谷歌学者] 41品牌AH，Manoukian AS，Perrimon N.果蝇异位表达。方法细胞生物学。1994;44:635–654.[公共医学][谷歌学者] 42Wilson RI，Laurent G.GABA能抑制在果蝇触角叶形成气味诱发时空模式中的作用。神经科学杂志。2005;25：9069–9079。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 43Huber D等人。大脑皮层中的稀疏光学微刺激推动了自由运动小鼠的学习行为。自然。2008;451:61–64. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 44Hippenmeyer S等。DRG神经元对ETS转录因子信号的反应中的发育开关。《公共科学图书馆·生物学》。2005;三：e159。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 45Petreanu L、Huber D、Sobczyk A、Svoboda K、Channelrhodopsin-2辅助的长程胼胝体投射回路映射。自然神经科学。2007;10:663–668.[公共医学][谷歌学者] 
