儿童急性淋巴细胞白血病细胞需要诱导自噬依赖性坏死下垂以克服糖皮质激素抵抗

摘要

引言

对化疗初期的耐药性，尤其是对糖皮质激素（GC）的不良反应，是儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）不良预后的一个强有力的预测因素(1,2). 在过去十年中，柏林-法兰克福-穆斯特（BFM）合作研究小组验证了一种有效的风险分层方法，该方法基于通过白血病特异性定量PCR评估体内化疗反应。根据微小残留病（MRD）的持续性，可以确定一组复发风险极高的患者（VHR-ALL）(三). 由于这可能反映了对多种传统抗白血病药物的从头开始耐药性，因此与调节细胞死亡调节器的新药物联合治疗是一种提高治疗反应的有吸引力的方法。

在GC抗性ALL中，线粒体凋亡缺陷诱导的潜在机制尚不清楚。抗凋亡髓细胞白血病序列1（MCL-1）的表达增加是GC耐药基因表达特征的主要特征(4). 药物相关特征的生物信息学筛选确定雷帕霉素是耐GC ALL中GC药物的敏化剂。雷帕霉素的GC增敏作用归因于MCL-1水平的降低，这被认为是为了降低GC药物对凋亡刺激的阈值(5).

基于这些考虑，我们试图评估小分子obatoclax（GX15-070）在难治性儿童ALL联合治疗中的潜力。该药物被提议作为BCL-2家族拮抗剂，并在细胞毒性浓度下破坏MCL-1及其促凋亡对应物之间的相互作用(6,7). 奥巴曲克在导致MCL-1和细胞色素中Bak断裂的浓度下可触发细胞凋亡c（c）释放。然而，在缺乏凋亡效应物BAX和BAK的细胞中，奥巴曲松也具有细胞毒性，低浓度的化合物足以抑制AML细胞的克隆形成生长，这表明存在其他靶机制(8). 已为具有可接受毒性特征的成人血液恶性肿瘤患者确定了推荐的II期剂量(9,10)这是进一步评估奥巴托拉索在儿科试验中的作用的基础。

在细胞凋亡缺陷的背景下，一种依赖大细胞自噬的替代性细胞死亡途径已经被确定(11,12)自噬是自噬的一种主要形式，其中部分细胞质和细胞内细胞器被隔离在特征性的双膜或多膜自噬空泡中（以下简称自噬）(13). 自噬通常是为了应对细胞应激时增加的代谢需求而触发的。选定的抗凋亡BCL-2家族成员可以参与凋亡和自噬途径之间的串扰，因为它们与自噬调节因子beclin-1相关(11,14,15). 当caspase依赖性凋亡被阻断时，需要自噬的细胞死亡机制通过受体相互作用蛋白1（RIP-1）介导(12). RIP-1是一种中枢激酶，与死亡受体诱导的信号复合物相关，调节应激条件下生存与死亡之间的转换(16). 在有缺陷的凋亡条件下，RIP-1激酶活性被证明可以介导一种替代的细胞死亡途径，这可能代表一种程序性坏死，也称为坏死性下垂(17,18). RIP-1激酶活性对于通过NF-kB激活或死亡受体介导的凋亡诱导细胞生存信号是不必要的(17,19).

在这里，我们表明，亚细胞毒性浓度的奥巴托拉索通过触发非凋亡细胞死亡途径，有效地恢复了抗GC ALL患者对地塞米松的反应。obatoclax诱导MCL-1中beclin-1的亚细胞毒性浓度以及地塞米松与Obatolax的联合作用与雷帕霉素（mTOR）活性的哺乳动物靶点抑制有关，为自噬诱导提供了可能的机制。奥巴曲克还对VHR-ALL患者的多药耐药原代细胞进行了临床相关的广泛化疗增敏。我们提供了遗传学和药理学证据，表明地塞米松的致敏作用是通过自噬依赖性坏死细胞死亡发生的，而其他细胞毒药物的致敏则依赖于细胞凋亡。在异种移植模型中，使用来自难治性ALL患者的耐GC细胞，联合使用地塞米松和奥巴托拉松可显著降低白血病进展。总之，我们的数据为这种方法的快速临床转化提供了强有力的理论基础。

结果

奥巴曲克使耐GC的ALL对地塞米松重新敏感。

因为MCL-1被认为是ALL类固醇抵抗的中枢调节剂(4,5)，我们首先比较了两种对MCL-1、ABT-737和obatoclax具有不同选择性的小分子在GC抗性ALL细胞系中的作用。ABT-737是一种小分子BH3模拟物，对BCL-2和BCL-X具有选择性_L（左）(20). 对ABT-737的耐药性归因于其不能靶向MCL-1(21–23). 虽然这两种化合物在一组ALL细胞系中都表现出较强的细胞毒性（补充表1；本文在线提供补充材料；doi:10.1172/JCI39987DS1号机组)，obatoclax的亚细胞毒性剂量，而不是ABT-737对地塞米松的GC耐药细胞系的亚细胞毒剂量（图​（图1A1A和补充图1）。我们确认了VHR-ALL细胞中奥巴曲松的单药活性（补充表2）。低剂量奥巴曲松恢复了所有7名弱泼尼松应答（PPR）VHR-all患者细胞对地塞米松的敏感性（图​（图1B1B和补充图2）。相反，在类固醇敏感细胞中，使用低剂量ABT-737或obatoclax对类固醇敏感性没有明显影响（图​（图1A）。1A） ●●●●。出乎意料的是，泛酶抑制剂zVAD.fmk并未干扰奥巴托拉索对GC耐药细胞的类固醇致敏作用（图​（图2A），2A） 而zVAD.fmk在葡萄孢霉素（STS）诱导细胞死亡时，在GC敏感细胞和对照实验中阻断了地塞米松加或不加奥巴曲松的细胞毒性作用。通过克隆形成试验，我们证实，与亲本细胞系相比，奥巴曲松对缺乏caspase-9或BAX和BAK的ALL细胞同样有效（图​（图2B2B和补充图3）。此外，催产素介导的GC增敏既没有导致线粒体膜去极化的恢复（图​（图2C）2C） 细胞色素也没有增加c（c）与地塞米松在GC-敏感细胞中的作用相比，释放（图​（图2D）。2D） ●●●●。与这些发现一致，在联合使用奥巴曲松和地塞米松治疗的类固醇抵抗细胞中，caspase-9未被激活，caspase-3仅被轻微激活（补充图4）。总之，我们的结果表明，奥巴曲松和地塞米松联合使用可触发一种细胞死亡机制，该机制独立于甾体类耐药白血病中半胱氨酸蛋白酶的凋亡功能。

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图1

奥巴曲克使耐GC的ALL细胞对地塞米松重新敏感。

以亚细胞毒性浓度（10%IC）进行联合试验₅₀)obatoclax（oba）或ABT-737和1μM地塞米松（DEX），并将数值标准化为用载体对照处理的细胞。(A类)如图所示，对所有细胞株进行72小时的处理。用MTT法测定细胞活力。(B类)7名患有VHR-ALL的PPR患者和3名强的松高反应（PGR）患者的原代ALL细胞按指示治疗72小时。用7AAD流式细胞术评估细胞活力***P（P）< 0.05.

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图2

奥巴曲克使GC-resistant ALL细胞对地塞米松再敏感，但不激活线粒体凋亡。

(A类)所有细胞按指示处理48小时，对照组使用STS或zVAD.fmk（80 nM），并用MTT法评估细胞活力。697个细胞作为GC-敏感对照。(B类)尤尔卡特胱天蛋白酶9^–/–和行李^–/–贝克^–/–如图所示，将细胞处理72小时，并在甲基纤维素中孵育7天后评估克隆发生存活率。(C类)GC-耐药CEM-C1和GC-敏感CEM-C7细胞以及PGR和PPR患者治疗16小时后的样本中显示了含有JC-1单体的细胞百分比，与线粒体电位的损失相对应。(天)细胞色素c（c）在类固醇敏感的RS4中诱导释放；经地塞米松或地塞米森和奥巴托拉松治疗的耐药CEM-C1细胞系中没有11个细胞。STS作为阳性对照。细胞色素c（c）流式细胞仪检测释放情况***P（P）< 0.05.

诱导自噬对ALL细胞的类固醇敏感性至关重要。

因为在细胞系模型中描述了一种自噬依赖的细胞死亡途径，在该模型中细胞凋亡被阻止(11,24)接下来，我们评估了奥巴托拉松对GC致敏是否需要自噬。事实上，暴露于低剂量奥巴托拉松联合地塞米松4小时后，GC耐药细胞中明显存在自噬体形成，这与内源性LC3-II的生成有关（图​（图3，三，A–C）。因为雷帕霉素是自噬的诱导剂(25)，我们问雷帕霉素是否最近报道了GC致敏效应(5)也可能依赖于自噬。正如我们所料，雷帕霉素对类固醇的敏感性与超自噬特征有关（图​（图3，三、A和B）。单独奥巴曲克或雷帕霉素只能轻微诱导自噬体的形成和LC3-II的生成（图​（图3，三，A–C）。与自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）预孵育可消除自噬小体的形成、LC3-II的生成以及奥巴曲松和雷帕霉素引起的GC再敏化（图​（图3，三，B–D）。巴非霉素是自噬体形成的晚期抑制剂(25)和重要自噬基因beclin-1的下调(BECN1公司)和ATG-7(自动液位计7)通过RNA干扰阻断了奥巴曲松和雷帕霉素对GC的再增敏（图​（图3，三，D–G）。这些结果在一个独立的细胞系中得到了证实（补充图5）。克隆形成试验表明，由于克隆形成生长与未经治疗的对照组相比具有可比性，因此添加3-MA和下调beclin-1都可以防止低剂量奥巴托拉松和地塞米松的细胞毒性作用（图​（图3，三、F和G）。在GC敏感性ALL细胞中，尽管有少量可检测到的LC3脂质过氧化，但3-MA对自噬的抑制仅略微恢复了GC耐药性（补充图6）。这些发现表明，自噬是奥巴曲松和雷帕霉素引起GC再敏化的共同机制的一部分。

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图3

奥巴曲克诱导GC-resistant ALL细胞自噬。

(A类)用GFP-LC3瞬时转染后，Jurkat细胞按指示处理4小时。用共焦显微镜在地塞米松和奥巴曲松或雷帕霉素（rapa）处理的细胞中检测到表明自噬体形成的特征性斑点染色模式。比例尺：10μm。(B类)自噬体阳性细胞的定量。数据代表两个独立实验的平均值±标准差，每个实验计数200个细胞。(C类)通过Western blot分析检测内源性LC3-II。Jurkat细胞在有或无3-MA的情况下，以及按照指示进行24小时的治疗后，用奥巴曲松和地塞米松治疗指定的时间点。(天)3-MA或巴非霉素对自噬的抑制削弱了10 nM雷帕霉素或奥巴曲松（10%IC）对地塞米松的敏感性₅₀). MTT法检测细胞活力。(电子)奥巴曲松和地塞米松治疗抑制Jurkat细胞的克隆形成存活。3-MA从联合治疗诱导的细胞死亡中拯救了耐GC细胞。用化合物处理细胞72小时，并在清洗和培养7天后评估甲基纤维素中的克隆存活率。(F类)与打乱（scr）对照组相比，使用siRNA（si）下调beclin-1或ATG7可削弱obatoclax或雷帕霉素对Jurkat细胞对地塞米松的再敏感性。MTT法检测细胞活力。Western分析了48小时下调的效率。(G公司)在克隆发生试验中，Jurkat细胞中beclin-1和ATG7的下调保护细胞免受obatoclax和地塞米松诱导的细胞死亡的影响***P（P）< 0.05.

为了确定obatoclax是否触发自噬途径，作为对线粒体凋亡阻断的一般反应，我们研究了该药物对Bax公司^–/–贝克^–/–小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）对广泛的凋亡刺激具有抵抗力(26). 与雷帕霉素一样，奥巴曲松诱导自噬Bax公司^–/–贝克^–/–MEF（图​（图4，4，A–C），如自噬体形成所示（图​（图4，4、A和B）和LC3-II的生成（图​（图4C）。4C） ●●●●。奥巴曲克对WT和Bax公司^–/–贝克^–/–MEF，而ABT-737的活动仅限于WT MEF（图​（图4D）。4D） ●●●●。死亡反应被3-MA阻断（图​（图4E）4E） 和下调beclin-1或ATG-7（图​（图4，4、F和G）。综上所述，这些结果表明，奥巴曲松和雷帕霉素的细胞毒性作用源于线粒体凋亡受阻时的自噬诱导。

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图4

奥巴曲克和雷帕霉素诱导自噬细胞死亡Bax公司^–/–贝克^–/–MEF公司。

(A类)Bax公司^–/–贝克^–/–瞬时表达自噬标记GFP-LC3的MEF用载体、奥巴曲松（100 nM）或雷帕霉素（10 nM）治疗4小时。共聚焦显微镜监测自噬体形成。比例尺：20μm。(B类)自噬体阳性细胞的定量。数据表示两个独立实验的平均值±SD，每个实验计数200个细胞。(C类)治疗Bax公司^–/–贝克^–/–Western分析检测到，服用奥巴曲松的MEF诱导内源性LC3-II的生成，3-MA治疗阻断了这种作用。(天)WT或Bax公司^–/–贝克^–/–（DKO）MEF与obatoclax或ABT-737孵育48小时，并通过MTT试验评估细胞活力。(电子)3-MA挽救对自噬的抑制作用Bax公司^–/–贝克^–/–暴露于obatoclax或雷帕霉素48小时诱导的细胞死亡的MEFs而不是WT MEFs。(F类)beclin-1下调获救Bax公司^–/–贝克^–/–MTT试验评估的由奥巴曲松诱导的细胞死亡的MEF，而非WT MEF。通过Western blot分析确定下调效率。(G公司)ATG7下调Bax公司^–/–贝克^–/–MEF而非WT MEF对奥巴托拉索治疗耐药。通过Western blotting评估下调效率。

obatoclax对GC反应的调节与mTOR的抑制有关。

激酶mTOR是细胞命运决定的关键调节器，包括对自噬的调节(27). 雷帕霉素对mTOR的抑制使固醇耐药的ALL细胞对地塞米松再敏感(5)，但自噬的作用尚未在本研究中进行研究。由于地塞米松已被证明在其他细胞系统中抑制mTOR(28)我们研究了地塞米松和奥巴托拉松治疗对mTOR活性的影响。单独使用地塞米松略微降低S6蛋白磷酸化（图​（图5A）。5A） ●●●●。用奥巴曲松或雷帕霉素和地塞米松治疗后，mTOR靶点S6蛋白和4EB-P1的磷酸化急剧下降（图​（图5A）。5A） ●●●●。有趣的是，雷帕霉素（而非奥巴曲松）单独或与地塞米松联合诱导Ser473的AKT去磷酸化（图​（图5A）。5A） ●●●●。奥巴曲松或雷帕霉素和地塞米松的联合应用还导致了来自类固醇耐药高危ALL患者的原代ALL细胞中S6蛋白的去磷酸化（图​（图5B，5B、 左）。相比之下，类固醇敏感患者的细胞在使用奥巴曲松和地塞米松治疗后没有显示S6蛋白的去磷酸化（图​（图5B，5B、 右侧）。我们的实验表明，在GC耐药的情况下，地塞米松暴露与奥巴托拉松暴露可以协同降低mTOR活性。这一发现将被用于开发体内治疗生物反应的相关标记，例如，使用磷酸化流式细胞术监测白血病细胞中S6蛋白的磷酸化状态。

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图5

地塞米松和奥巴托拉松联合治疗可抑制mTOR。

(A类)如图所示，Jurkat细胞处理6小时，并评估mTOR靶点S6蛋白和4EB-P1的磷酸化。地塞米松与奥巴曲松或雷帕霉素联合使用可抑制mTOR活性（顶面板）。雷帕霉素单独使用以及与地塞米松联合使用，但不单独使用奥巴曲松或与地塞米松联合使用降低Jurkat和CEM-C1细胞中Ser473处AKT的磷酸化（下图）。(B类)在患有VHR-ALL的PPR患者的原代细胞中，地塞米松和奥巴曲松或雷帕霉素治疗导致S6蛋白磷酸化降低。相反，在强的松反应良好患者的细胞中，联合治疗后S6蛋白没有去磷酸化。

Obatoclax破坏beclin-1和MCL-1之间的复合物。

抗凋亡BCL-2家族成员MCL-1被认为是GC耐药性的调节剂(5). 因为自噬调节因子beclin-1被描述为与抗凋亡BCL-2家族成员相互作用，包括MCL-1(11,14,15)接下来，我们测试了奥巴托拉索对beclin-1与MCL-1相互作用的影响。obatoclax的亚细胞毒性浓度导致MCL-1的检测显著降低，MCL-1与293T细胞中过度表达的表位标记的beclin-1共同免疫沉淀（图​（图6A）。6A） ●●●●。我们通过对ALL细胞内生表达的蛋白质进行共免疫沉淀实验来证实这一结果（图​（图6B）。6B） 。同样，在存在亚细胞毒性浓度的obatoclax的情况下，显示较少的beclin-1与MCL-1共免疫沉淀，相反，较少的MCL-1与beclin-1一起被拉下。Obatoclax没有改变beclin-1和BCL-2之间的相互作用。有趣的是，与雷帕霉素或ABT-737孵育并不影响beclin-1和MCL-1之间的复合物。正如所报告的MCL-1相互作用谱所预期的那样(29,30)BIM可通过从类固醇耐药的ALL细胞共免疫沉淀检测到，但低剂量奥巴曲松治疗不会改变BIM与MCL-1的结合。在这个实验环境中，BH3-only蛋白NOXA与MCL-1没有结合（图​（图6B）。6B） ●●●●。

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图6

奥巴曲克诱导MCL-1和beclin-1复合物的破坏。

(A类)FLAG标记的beclin-1在293T细胞中过度表达，分析MCL-1免疫沉淀物中是否存在beclin-1，是否使用奥巴托品治疗3小时。(B类)用100 nM奥巴曲松、30 nM ABT-737或10 nM雷帕霉素处理Jurkat细胞3小时，并分析MCL-1或beclin-1免疫沉淀物中是否存在所示的蛋白质。低剂量obatoclax破坏了beclin-1和MCL-1之间的相互作用，而BCL2和beclin-1之间的相互作用不受影响。同样，ABT-737或雷帕霉素也不影响beclin-1和MCL-1或BCL2之间的复合物。(C类)在指定的时间点，使用载体或地塞米松和奥巴托拉松联合治疗后，评估MCL-1水平，包括或不包括环己酰亚胺（CHX）。Western blot分析显示MCL-1水平不受联合治疗的影响。(天)通过Western blot对甾体抗药性（Jurkat、VHR-01和VHR-02）和甾体敏感（RS4；11、697、SR-01和SR-02）细胞系以及用DEX（1μM）、obatoclax（100 nM）或联合治疗24小时的原代细胞进行BIM诱导评估。

由于MCL-1的蛋白质周转率很高(31)我们评估了联合使用奥巴曲松和地塞米松治疗对MCL-1蛋白水平的影响。在环己酰亚胺存在下，MCL-1水平在孵育45分钟后迅速下降，与奥巴托拉松和地塞米松的存在无关（图​（图6C）。6C） ●●●●。在选定的类固醇耐药ALL病例中，地塞米松未诱导促凋亡BIM(32). 我们没有发现BIM表达水平的任何变化与地塞米松联合奥巴托拉松在耐GC的ALL细胞中的恢复反应相关（图​（图6D）。6D） ●●●●。有趣的是，在类固醇敏感细胞中，BIM的诱导并不一致（图​（图6D）。6D） ●●●●。在RS4中；11个细胞，地塞米松很容易诱导BIM，激素抵抗患者的697个细胞和原始ALL细胞样本在地塞米森治疗后均未诱导这种促凋亡的BH3-only蛋白（图​（图6D）。6D） ●●●●。在类固醇敏感患者的细胞中，BIM-L和BIM-S亚型略有增加，但BIM-EL亚型未检测到。这些数据表明，obatoclax对类固醇的再敏化不是由于BIM的诱导。

为了进一步了解MCL-1在催产素作用机制中的作用，我们使用RNA干扰调节MCL-1的表达。MCL-1蛋白水平的降低导致对地塞米松的部分再敏，但令人惊讶的是，与奥巴曲松联合使用可防止任何额外的化学增敏（补充结果和补充图7）。地塞米松的部分再敏感性是通过诱导细胞凋亡介导的，而细胞凋亡是通过泛酶抑制剂zVAD.fmk阻断的。3-MA对自噬的抑制并不影响MCL-1敲低对地塞米松的再敏作用，即使存在奥巴曲松。相反，检测到caspase-9激活，这与caspase依赖性的beclin-1下降有关。因此，当MCL-1下调时，诱导凋亡可能会超过诱导自噬，这限制了对这些实验的解释。综上所述，我们的数据表明，beclin–MCL-1相互作用的破坏是obatoclax触发机制的一部分，并表明MCL-1除了在白血病细胞中作为抗凋亡调节器的作用外，还参与调节自噬依赖性细胞死亡途径。

奥巴曲松和地塞米松联合应用可触发GC-耐药ALL患者RIP-1激酶依赖性坏死下垂。

为了更好地评估奥巴曲松和地塞米松引起的细胞死亡的性质，我们进行了透射电镜成像。事实上，用奥巴托拉松和地塞米松治疗后，自噬体形成明显，而用3-MA孵育可完全抑制这种形成（图​（图7，7、A和B）。细胞在暴露于奥巴托克和地塞米松后表现出与非凋亡细胞死亡机制一致的特征。染色质的凝集是典型凋亡的标志，是不完整的（图​（图7A，7A、 与TRAIL治疗后显著的染色质凝集形成对比，TRAIL可诱导ALL细胞的死亡受体依赖性凋亡(33). 死亡细胞的一个特征是质膜的解体（图​（图7B），7B） 这是坏死性下垂的标志(34). 越来越多的证据表明，程序性坏死细胞死亡途径可以在凋亡效应器受损的情况下触发，这依赖于RIP-1激酶的活性(12,17). RIP-1在细胞存活和细胞死亡信号的交叉点发挥作用(35,36). 因此，我们测试了坏死抑素-1（nec-1；参考文献。17)会干扰obatoclax对类固醇的致敏作用。事实上，用nec-1处理的类固醇抗性ALL细胞对奥巴托卡司诱导的地塞米松再敏感是难治的（图​（图7C）。7C） ●●●●。Nec-1还降低了类固醇敏感ALL细胞对地塞米松的细胞毒性反应，无论是单独使用还是与低剂量奥巴曲松联合使用（图​（图7C）。7C） ●●●●。有趣的是，nec-1抑制了类固醇敏感细胞中BIM的诱导，该细胞在地塞米松后表现出BIM诱导（补充图8）。与RIP-1在GC药物应答中的中心作用一致，RIP-1缺陷的ALL细胞(37)对obatoclax介导的GC再敏化有抵抗力（图​（图7D）。7D） ●●●●。

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图7

RIP-1激酶活性对催产素介导的GC增敏至关重要。

(A类)电子显微镜图像显示了用奥巴曲松和地塞米松治疗72小时后坏死细胞死亡的特征。未检测到浓缩的染色质，而Trail治疗诱导浓缩的凋亡细胞核（顶面板）（原始放大倍数，×7100）。用奥巴曲松和地塞米松处理的细胞显示出解体的质膜，这是由钠肼重新修饰的。试验处理使膜保持完好（底部面板）（原始放大倍数，×5400）。(B类)同一实验的更详细视图。在细胞质中检测到具有特征性双膜结构的自噬体形成。用奥巴曲松和地塞米松处理的细胞质膜被破坏。N、 细胞核；C、 细胞质；A、 自噬体；PM，质膜（原始放大倍数，×15000）。(C类)在类固醇抵抗细胞（CEM-C1和Jurkat）和类固醇敏感细胞（697）中，用地塞米松（1μM）和奥巴曲松（10%IC）处理72小时₅₀)通过MTT试验评估，无论是否使用坏死抑制因子nec-1（300 nM），nec-1均能恢复类固醇抵抗。(天)尤尔卡特独立电源1^–/–细胞对地塞米松（1 mM）和奥巴曲松（10%IC）双重治疗72小时的敏感性较低₅₀)与WT Jurkat细胞相比。通过MTT法评估细胞活力。(电子)CYLD的下调挽救了Jurkat细胞，使其免于地塞米松（1μM）和obatoclax（10%IC）联合治疗72小时诱导的细胞死亡₅₀). 48小时后通过Western blot分析评估下调效率。(F类)Jurkat发生LC3-II生成独立电源1^–/–用地塞米松和奥巴托拉松治疗8小时后，细胞和WT细胞内。(G公司)nec-1治疗不能抑制奥巴曲松和地塞米松治疗诱导Jurkat细胞产生LC3-II***P（P）< 0.05.

氘激酶圆柱瘤病（头巾肿瘤综合征）（CYLD）是RIP-1激酶活性的直接调节器(38). 敲低CYLD的表达表明，通过地塞米松和奥巴托拉松的联合作用，需要CYRD来诱导RIP-1依赖性细胞死亡（图​（图7E）。7E） ●●●●。我们的结果与当前的模型一致，该模型认为，氘化形式的RIP-1介导细胞死亡信号(35). 一项重要发现是，自噬的诱导可以在治疗后4小时内早期检测到，并且在RIP-1缺陷的ALL细胞中LC3-II的生成既不受抑制（图​（图7F）7F） 在nec-1处理的ALL细胞中也没有（图​（图7G）。7G） ●●●●。综上所述，这些结果表明，奥巴曲松和地塞米松的联合作用触发了非凋亡细胞死亡途径，该途径具有坏死的中心特征，包括电子显微镜显示的细胞死亡的特征形态，并且严格依赖RIP-1激酶活性和RIP-1氘化酶CYLD。此外，我们的数据表明自噬过程是在RIP-1上游触发的，并不是坏死性下垂的结果。

奥巴曲克是多药耐药原代ALL细胞中广泛使用的化疗增敏剂，但与地塞米松合用可激活自噬依赖性细胞死亡。

为了验证我们在原代细胞中的结果，我们测试了前体B细胞ALL的PPR患者的预处理样品，他们的进一步特征是在强化的常规多药化疗下白血病细胞的分子持久性，并根据其体内对化疗的不良反应预测有很高的复发风险（补充表2）。事实上，在间充质基质细胞（MSC）共培养中，低剂量奥巴曲松使GC-resistant ALL细胞对地塞米松再敏感，而3-MA则完全消除了这一点，这也意味着自噬是原发性难治性ALL细胞的一种基本机制（图​（图8A）。8A） ●●●●。在这个剂量下，单用奥巴托拉索诱导的细胞死亡少于5%。重要的是，3-MA不干扰地塞米松单独或联合奥巴托拉松治疗对GC-敏感患者原代ALL细胞的细胞毒性作用（图​（图8A），8A） 表明GC敏感性细胞对GC药物的死亡反应不需要自噬。与我们在ALL细胞系中的结果一致，nec-1在固醇耐药的原代VHR-ALL细胞中消除了联合治疗的GC-致敏活性。相反，用zVAD.fmk阻断半胱天冬酶并不能抑制原代耐GC的ALL细胞中的类固醇再敏感，而用zVAD.fmk治疗类固醇敏感的ALL患者的细胞可以抑制对地塞米松的反应。

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图8

奥巴曲克对来自低风险患者的多药耐药原代ALL细胞表现出强烈的化学增敏活性。

(A类)来自5名PPR患者和3名强的松龙疗效较好的患者的原代ALL细胞与hTERT永生化骨髓基质细胞共培养，并单独或联合使用地塞米松（1μM）或奥巴曲松（10%IC）治疗₅₀)在存在或不存在3-MA、nec-1或zVAD.fmk的情况下持续72小时。用7AAD染色和流式细胞术检测细胞活力。数据显示为2个独立实验的平均值±SD。在联合实验中，数值被归一化为以指定剂量单独使用化合物和/或抑制剂处理的细胞。(B类)来自4名VHR、1名高危（HR）和3名标准风险（SR）患者的原代ALL细胞与hTERT永生化骨髓基质细胞共培养，并单独或联合应用柔红霉素、长春新碱或阿糖胞苷（araC）治疗（10%IC）₅₀)在存在或不存在3-MA、nec-1或zVAD.fmk的情况下持续72小时。用7AAD染色和流式细胞术检测细胞活力。数据显示为两个独立实验的平均值±标准差***P（P）< 0.05 (A类和B类). (C类)NSG小鼠在用来自2名患有VHR-ALL的PPR患者的原代细胞进行异种移植后的无事件生存率（pEFS）的百分比（VHR-02，n个= 8; 患者VHR-01，n个= 6; 补充表2），并用载体、地塞米松、奥巴托拉松或联合用药治疗3周。P（P）在两个异种移植实验中，地塞米松和奥巴托拉松与溶媒、地塞米森或单独奥巴托拉松的对比小于0.02。

目前的治疗方案包括类固醇窗口，然后进行多药化疗，包括细胞毒性药物，如柔红霉素、长春新碱和阿糖胞苷。低剂量奥巴托拉松使原代难治性ALL细胞对所有3种药物重新敏感，而敏感患者细胞的敏感性没有进一步增加。有趣的是，3-MA并没有恢复对这些细胞毒性药物的耐药性，这表明在用奥巴托拉索治疗后诱导自噬对GC再敏具有特异性（图​（图8B）。8B） 。相反，使用zVAD.fmk阻断半胱氨酸天冬氨酸酶完全抑制了低剂量奥巴曲松与柔红霉素、长春新碱和阿糖胞苷联合使用对高危和标准高危患者细胞的再敏化作用。这些结果支持了这样一种观点，即自噬依赖性坏死是在GC耐药的情况下由GC特异性触发的。此外，奥巴曲松可以作为一种化疗增敏剂，用于已建立的ALL多药治疗方案，因为它具有用非GC抗白血病药物恢复凋亡反应的广泛潜力。

讨论

在这里，我们描述了一种药理学方法，我们认为这是一种新的方法，可以特异性地绕过多药耐药ALL的凋亡阻断而进行化疗。BCL-2拮抗剂obatoclax的亚细胞毒性浓度通过诱导非凋亡细胞死亡途径恢复了对地塞米松的反应。对地塞米松的凋亡刺激有抵抗力的细胞中自噬依赖性细胞死亡的激活，令人想起使用实验系统所报告的观察结果，该实验系统具有内在和外在凋亡反应关键调节因子的明确遗传缺陷。在Bax公司^–/–贝克^–/–MEF和BCL-2–MEF过表达，依托泊苷或STS引发的细胞死亡依赖于自噬基因beclin-1和ATG-5(11). 其他人也报告过(6,8)，obatoclax具有细胞毒性Bax公司^–/–贝克^–/–我们证明细胞系严重依赖自噬途径。同样，对caspase 8或死亡受体信号的遗传或药理学干扰可导致具有坏死特征的自噬依赖性细胞死亡(12,18,41). 在淋巴细胞中，这可能是在缺乏正常凋亡反应的情况下控制异常细胞增殖的另一种机制。在caspase-8或FADD缺陷小鼠的活化T细胞中，需要自噬信号来诱导RIP-1依赖性坏死细胞死亡(41). 我们在此表明，这种细胞死亡机制可以在耐GC白血病中激活，以恢复对地塞米松的反应。

自噬被认为是细胞命运决定的重要调节机制。虽然很明显，自噬在细胞应激时具有保护功能，但自噬对程序性细胞死亡的执行所起的作用仍存在争议(13). 我们的数据表明，当奥巴托克或雷帕霉素恢复对地塞米松的反应时，自噬信号是细胞死亡机制的一个组成部分。早期（3-MA）或晚期（巴非霉素）干扰自噬过程和敲除对自噬至关重要的基因的两种抑制剂，BECN1公司和自动液位计7完全阻止了地塞米松的再敏感。地塞米松和奥巴托拉松联合使用可抑制GC-resistant ALL细胞的克隆形成生长，电子显微镜成像明确显示快速诱导具有自噬特征的坏死细胞死亡。有明确证据表明，在癌症中，自噬不一定是一种保护性特征。例如，BECN1公司被证明是一种单倍体抑癌基因(42,43)随着自发性肿瘤发生率的增加，包括beclin-1单倍体小鼠的淋巴瘤。对于自噬机制至关重要的基因是高度保守的，并且在一些依赖自噬的细胞过程中是必需的(44). 一些研究将自噬基因与程序性细胞死亡联系起来。例如，在中枢神经系统中，ATG7缺乏保护神经元免受缺氧/缺血性脑损伤后caspase依赖性和caspase非依赖性细胞死亡的影响(45). 在人类胶质母细胞瘤中，自噬基因的敲除自动液位计1或自动液位计5阻止大麻素的细胞毒性作用，大麻素通过mTORC1依赖性途径诱导自噬依赖性细胞死亡(46). 自噬也能调节发育过程中的程序性细胞死亡。年，类固醇激素蜕皮激素在唾液腺从幼虫期到成年期的形态发生过程中触发自噬依赖性细胞死亡果蝇属这种细胞死亡途径与caspase活性无关(47)为正常发育中通过类固醇激素信号调节自噬细胞死亡途径提供了有力证据。同样，自噬是中肠程序性细胞死亡所必需的果蝇属变态，这为自噬对细胞死亡的特定调节提供了额外证据，即使存在完整的凋亡机制(48). 奥巴曲松与GC药物联合治疗，但不与其他细胞毒药物联合治疗可诱导耐药ALL的自噬依赖性细胞死亡。这就提出了一个问题，即地塞米松对GC-敏感型ALL的作用是否也需要自噬。最近的一份报告描述了地塞米松治疗后GC-sensitive ALL细胞株的自噬增加，但细胞死亡与凋亡特征相关，而beclin-1的敲除仅能部分缓解这种效应(49). 我们还观察到使用3-MA（补充图6）或nec-1（图​（图7C）7C） 在GC-敏感细胞系的子集中。然而，我们无法在原代ALL细胞中检测到3-MA的作用，其中caspase依赖性细胞死亡占优势。我们的研究结果表明，自噬是奥巴曲松对GC-耐药细胞类固醇致敏的早期和限制性步骤，并强调了在设计针对自噬的癌症治疗策略时，了解细胞背景的重要性。

有明确证据表明AKT过度激活(50)和mTOR(5)在耐GC-ALL中。因为mTOR在不同环境下参与了自噬的控制(27)过度激活的AKT-mTOR信号可以阻止耐药疾病中的自噬诱导。我们假设GC-耐药的ALL细胞因此可以启动mTOR控制的自噬。与这一想法一致，我们发现地塞米松和奥巴托拉松联合诱导自噬细胞死亡导致耐药细胞中mTOR靶S6蛋白磷酸化显著降低。奥巴曲松或雷帕霉素增强地塞米松对mTOR作用的机制似乎不同。事实上，地塞米松与雷帕霉素联合使用，而不是与奥巴托克拉斯联合使用，导致AKT在Ser473上的磷酸化显著降低，这与最近的发现一致，表明mTOR也可以在AKT上游发挥作用(51). 只有当obatoclax与地塞米松联合使用时，才能观察到mTOR靶磷酸化的调节，而与其他细胞毒性药物联合使用时则没有观察到，这表明地塞米松暴露有助于抑制mTOR。事实上，据报道，地塞米松暴露与成肌细胞系和淋巴细胞中mTOR信号的抑制有关(28,52). mTOR在控制自噬方面的重要性也通过使用化合物库进行综合筛选的结果得到了强调，以识别新的自噬药物诱导物，其中候选分子的促自噬活性始终与mTOR靶点磷酸化的降低有关(53). 需要进行广泛的研究，以剖析奥巴托拉松和地塞米松联合用药引发的主要信号事件，因为它们可能提供有关急性淋巴细胞白血病耐药机制的重要线索。

GC耐药性似乎与ALL中GC受体的遗传或功能缺陷无关(54,55). 地塞米松通过增加BH3-only促凋亡蛋白BIM的水平来诱导细胞凋亡，在选定的GC-resistance ALL患者中，BIM水平显著降低(32). 然而，在大多数测试案例中，我们无法检测到地塞米松对GC-敏感细胞系和原代ALL细胞中BIM的诱导作用。此外，我们没有检测到与类固醇致敏相关的BIM水平升高、MCL-1蛋白水平降低或MCL-1蛋白质转换增加。相反，我们发现，通过内源性蛋白的免疫沉淀，奥巴曲松的亚细胞毒性浓度导致ALL细胞中MCL-1和beclin-1的破坏。这表明MCL-1可能通过beclin-1控制自噬的诱导，正如最近对其他BCL-2家族成员提出的那样(14,15). 有趣的是，在用雷帕霉素处理的细胞中没有观察到这种作用，这再次说明了催产素的靶机制不同。我们认识到，这种作用也可能是由蛋白质复合物的间接机制引起的，包括MCL-1和beclin-1。此外，调节MCL-1表达水平的功能性实验并不是决定性的。MCL-1的敲除导致细胞凋亡的中度激活和地塞米松的部分致敏，地塞米森是半胱氨酸天冬氨酸酶依赖性的，但通过催产素和自噬细胞死亡阻止了地塞米酮的完全再致敏。在这种情况下，细胞凋亡的激活可能超越了自噬的诱导。为了支持这一假设，我们检测到MCL-1下调后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9的激活，以及半胱氨酸蛋白酶-9依赖的beclin-1的裂解。这为细胞凋亡激活时防止自噬诱导提供了可能的机制。综上所述，低剂量奥巴曲松对类固醇的调节并不涉及MCL-1中促凋亡BCL-2家族蛋白的释放，而是通过一种需要MCL-1存在的机制触发自噬依赖性细胞死亡。

在这种情况下，需要激活自噬来诱导坏死性下垂，这是一种程序性坏死的形式，在凋亡因半胱氨酸蛋白酶抑制而流产时发生(16,56). 坏死性下垂的发生依赖于RIP-1激酶(17). 我们的数据表明，奥巴曲松和雷帕霉素对类固醇致敏绝对需要RIP-1活性。电子显微镜记录的细胞死亡形态与报道的坏死下垂形态一致(12,56). 此外，双歧化酶柱状瘤病（CYLD）已被证明调节RIP-1(38)，是执行坏死性下垂所必需的功能。这与实验一致，实验表明RIP-1激酶活性需要触发细胞死亡，RIP-1的泛素化阻止细胞死亡信号(16,19). RIP-1和CYLD被包括在核心基因中，这些核心基因在功能性siRNA筛选中被鉴定为对坏死至关重要的基因(18). 据我们所知，我们提供了第一个与临床相关的模型，并对来自高危疾病患者的原发性白血病细胞进行了一致验证，在该模型中，可以利用坏死途径恢复治疗反应。因此，这将构成一个非常相关的实验模型，以深入研究坏死性下垂的机制。我们的结果清楚地表明自噬途径和RIP-1介导的导致坏死的信号事件之间存在直接联系。自噬在早期触发，与RIP-1激酶活性无关，表明自噬作用于坏死信号的上游。许多研究确定RIP在功能上是与死亡受体途径蛋白（如FADD和caspase-8）复合物的一部分(35). 用小鼠模型进行的实验表明，自噬和坏死性下垂可能通过死亡受体途径的成分向自噬体膜的募集而联系起来(41). 很容易推测，与地塞米松和奥巴托拉松共刺激后，ALL细胞中也会触发类似的机制。我们的发现保证了广泛的生物化学后续研究，以了解RIP-1是如何被激活的，以及自噬机制是如何与坏死途径联系在一起的。

基于他人有希望的研究(32)，我们建立了一个新发高耐药ALL的白血病异种移植模型。这种方法的威力在于可以从相关患者群体中选择病例，从冷冻保存的剩余诊断样本开始，从治疗儿童急性淋巴细胞白血病的最大合作试验之一开始。通过MRD聚焦于VHR-ALL病例，我们还选择了体内对泼尼松最具耐药性的患者，定义为泼尼松单药治疗1周后外周血中白血病细胞减少。因此，这些患者的ALL细胞在体外对地塞米松和其他化疗药物具有完全耐药性。在前体B细胞和T细胞ALL病例中，低剂量奥巴曲松恢复了对地塞米松的反应。使用白血病异种移植模型进行1年随访观察到的持久缓解表明其具有较强的抗白血病活性。此外，低剂量奥巴曲松联合柔红霉素、长春新碱和阿糖胞苷对多药耐药的原代ALL细胞具有广泛的化学增敏作用，这为进一步评估奥巴曲松联合多药方案提供了强有力的基础。异种移植物方法对于验证这种方法是否适用于经过大量预处理的复发和难治性患者至关重要。我们观察到，在用奥巴曲松和地塞米松处理细胞系后，克隆形成分析中可以出现分离的克隆，这表明可能会对这种方法产生耐药性。我们建立的异种移植系统将使我们能够筛查更多的ALL病例，以验证是否必须预期对这种方法产生耐药性。耐药性病例的鉴定将提供一个模型，以建立与反应或耐药性相关的标记。根据目前的数据，mTOR活性随治疗的动态变化是一个很好的候选标记。这些知识将有助于优化临床试验的患者选择。

综上所述，我们的数据支持一种模型，在该模型中，通过激活自噬依赖性坏死细胞死亡途径，可以克服GC-resistant ALL细胞中的凋亡阻断。电子显微镜下的特征性坏死特征和S6蛋白磷酸化谱的变化为评估难治性ALL患者对奥巴托克和地塞米松联合治疗的生物反应提供了工具。在成人恶性血液病患者的临床研究中，考虑到奥巴曲松的可接受毒性特征(9,10)，我们的研究为评估这种治疗难治性和复发性急性淋巴细胞白血病儿童的新药理学策略提供了令人信服的理论基础。

方法

补充材料

致谢

脚注

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