线粒体DNA突变引起神经元变性的机制

分化为神经元

使用4+/4-方法将亲代胚胎干细胞和杂交细胞分化为神经元（Bain等。（1995年），如Kirby所述等。(2009)这也给出了分化标志物的全部细节。培养物保持在poly上-d日-赖氨酸/层粘连蛋白涂层盖玻片。在电镀后7-9天对分化的神经元进行研究。

成像细胞溶质游离钙浓度、线粒体膜电位、活性氧生成和谷胱甘肽浓度

在室温下用5µM fura-2 AM（Molecular Probes，Eugene，OR）和0.005%Pluronic在4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲盐溶液中加载细胞30分钟，缓冲盐溶液由（mM）：156 NaCl，3 KCl，2MgSO组成₄，1.25千赫₂人事军官₄，2氯化钙₂，10葡萄糖和10 HEPES，用NaOH调节pH至7.35。用于同时测量细胞内游离钙浓度（[Ca²⁺]_c（c）)和线粒体膜电位（Δψ_米)在fura-2加载期间的最后15分钟内，将罗丹明123（10µM，Molecular Probes，Eugene，OR）添加到培养物中。测量Δψ_米，在室温下用25 nM四甲基罗丹明甲酯负载细胞30 min，在整个实验过程中，染料在所有溶液中的浓度相同。在这些实验中，四甲基罗丹明甲酯被用于“再分配模式”（Duchen等。,2003)评估Δψ_米因此，线粒体局部四甲基罗丹明甲酯荧光的减少代表线粒体去极化。

使用配备20×萤石物镜的外荧光倒置显微镜对装载fura-2和罗丹明123的细胞进行荧光测量。[加利福尼亚州²⁺]_c（c）和Δψ_米使用氙弧灯提供的激发光在单细胞中进行监测，光束通过单色仪（英国肯特郡凯恩研究所）依次选择340、380和490 nm的波长（英国肯特郡凯恩调查所），带宽为10 nm。发射的荧光通过515nm长通滤波器反射到帧转移冷却的电荷耦合器件相机（哈马松Orca ER）。使用iQ软件（Andor，Belfast，UK）收集并分析所有成像数据。以5-10秒的间隔采集荧光数据。fura-2数据未根据[Ca进行校准²⁺]_c（c）由于使用不同的校准技术而产生的不确定性。极化线粒体中罗丹明123的积累会淬灭荧光信号，作为对去极化的响应，荧光信号被去淬灭；因此，若丹明123信号的增加是线粒体去极化的信号。在可能的情况下，我们将静息水平（设置为0）和响应解偶联剂羰基氰化物对三氟甲氧基苯腙（FCCP）（1μM；设置为100%）产生的最大信号之间的信号标准化（Abramov和Duchen，2008).

为了测量线粒体活性氧生成，在室温下用线粒体靶向氢乙硫胺（5µM，Molecular Probes，Eugene，OR）预培养细胞10分钟。为了测量细胞溶质活性氧生成，在实验期间溶液中存在二氢乙硫酸氢钠（2μM）。二氢乙硫铵未使用预培养（“加载”）来限制氧化产物在细胞内的积累。

使用配备META检测系统和40×油浸物镜的蔡司510 UV-VIS共焦激光扫描显微镜测量四甲基罗丹明甲酯。将照明强度保持在最低，以避免光毒性，并将针孔设置为提供～2μm的光学切片。使用543 nm激光线激发四甲基罗丹明甲酯，并使用560 nm长通滤波器测量荧光。对于氢乙炔和线粒体靶向氢乙炔测量，测量氧化/还原形式的比率：543 nm激光线和560 nm长通滤波器用于激发氧化形式（乙炔），而351 nm激发和405–470 nm测量用于测量还原形式（氢乙炔）的变化。所有数据均来自至少五份盖玻片和两到三份不同的细胞制剂。

谷胱甘肽测量

为了测量谷胱甘肽，将细胞与50µM一氯二烷（MCB）（分子探针，尤金，OR）孵育。当MCB与谷胱甘肽在谷胱甘苷转移酶催化的反应中发生反应，生成荧光加合物时，细胞在室温下与HEPES缓冲盐溶液中的染料孵育40分钟，或直到达到稳定状态，然后采集图像进行定量（Keelan等。,2001). 然后用HEPES缓冲盐溶液洗涤细胞，并使用冷却的电荷耦合器件成像系统获得MCB谷胱甘肽加合物的荧光图像，如所述，使用380nm的激发和>400nm的发射。

细胞死亡实验

同时用20µM碘化丙啶（不包括在活细胞中，但在膜完整性丧失后显示红色荧光）和4.5µM Hoechst 33342（分子探针，尤金，OR）对所有细胞核进行染色，并在紫外线照射下产生蓝色荧光，以计数细胞总数。使用相位对比光学，明亮的视野图像可以识别神经元，与平坦的胶质细胞相比，神经元具有非常独特的形态，并且位于胶质层上方的不同焦平面上。在每张盖玻片的20–25个区域中，总共统计了600–800个神经元或胶质细胞。每个实验用不同的培养物重复五次或更多次。

严重复合物I缺乏细胞线粒体膜电位维持机制的研究

研究严重损害复合物I活性的突变如何不仅能维持Δψ_米但也与一个大于对照细胞的值相关，我们探讨了不同线粒体机制在维持膜电位中的作用。在氧化磷酸化正常的细胞中，Δψ_米由呼吸链的质子泵活动维持。然而，如果氧化磷酸化受损，F₁F类_哦-ATP合成酶（复合物V）可以逆转、水解ATP并将质子泵过内膜，从而维持Δψ_米（例如McKenzie等。,2007). 应用F抑制剂寡霉素（2μg/ml）₁F类_哦-ATP合成酶导致Δψ的大幅下降_米在CY3-I神经元中，四甲基罗丹明甲酯信号减少58±5%(n个= 82;图1E） ●●●●。寡霉素增加或不影响Δψ_米在其他细胞系中(图1C和D）。因此，在CY3-I细胞中，作为对呼吸链活动受损的反应，F₁F类_哦复合体切换到ATP消耗模式，维持Δψ_米.

尽管携带相同的mtDNA突变，但未分化的CY3-I干细胞对寡霉素的反应与分化的神经元CY3-I细胞不同(图1F） ●●●●。在未分化细胞中，应用寡霉素使四甲基罗丹明甲酯荧光增加7.4±0.4%(n个=99），与分化细胞的去极化相反。随后加入鱼藤酮后，四甲基罗丹明甲酯荧光显著降低（38.2±4.1%），表明Δψ下降_米由于FCCP的反应，信号进一步大幅下降，因此表明复合物II活性作为这些细胞中的电子供体也必须相对活跃。寡霉素、鱼藤酮和FCCP对非分化细胞CY2-I的影响(n个=76），ES-I(n个=41）和CY1-I(n个=67）相当于对分化神经元和胶质细胞的影响。

底物对线粒体膜电位维持的影响

结果表明，在某些模型中，Δψ的维持_米通过“反向”ATP酶活性可以通过提供额外的底物来纠正，这表明底物供应可能是速率限制的（甘地等。,2009). 为复合物I（丙酮酸，5 mM）提供额外的底物增加了Δψ_米在CY3-I细胞中（16.1±1.1%，n个= 101;P（P）<0.05），但琥珀酸甲酯（5 mM）是琥珀酸的一种膜透性类似物，是复合物II的底物，在CY3-I神经元中诱导了较小但显著的线粒体去极化（19.1±1.1%；P（P）< 0.05). 额外的线粒体底物没有改变寡霉素对Δψ的影响_米-F的应用₁F类_哦-ATP酶抑制剂增加Δψ_米在ES-I、CY1-I和CY2-I中，Δψ坍塌_米在CY3-I神经元中(图2A–D）。因此，Δψ的受损维护_米CY3-I神经元呼吸链的改变并不是由于缺乏底物供应。

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图2

线粒体底物对Δψ维持机制的影响_米线粒体突变的细胞。丙酮酸（5 mM）或琥珀酸甲酯（5 mC）对神经元的作用增加了Δψ_米，但增加底物供应并不能阻止寡霉素诱导的CY3-I神经元线粒体去极化(C类). 在丙酮酸存在下，甲基琥珀酸诱导ES-I和CY1-I神经元线粒体进一步超极化(A、 B、D)但在CY3-I细胞中有少量线粒体去极化。TMRM=四甲基罗丹明甲酯。

钙平衡

线粒体作为空间钙缓冲系统在维持神经元钙平衡方面发挥着重要作用（Duchen，2000). 生理刺激不会损害健康细胞的线粒体功能，但可以增加活性氧的生成，当与线粒体钙超载相关时，活性氧可促使线粒体通透性转换孔开放。为了研究线粒体突变对钙稳态的影响，我们测量了[Ca²⁺]_c（c）和Δψ_米同时分别使用呋喃-2和罗丹明123，然后用多种激动剂刺激细胞以提高[Ca²⁺]_c（c）.ATP（100μM）用于刺激[Ca²⁺]_c（c）星形胶质细胞中通过嘌呤受体的信号，50mM KCl用于诱导质膜的去极化和开放的电压门控钙通道，这些通道主要在神经元中表达。将50 mM KCl应用于所有四种产生[Ca的细胞系²⁺]_c（c）神经元表型细胞上的信号，Δψ无明显去极化_米(图3)如前所述初级神经元（基兰等。,2001; 甘地等。,2009). 100μM ATP在α[Ca诱导的共培养胶质细胞中的应用²⁺]_c（c）各组细胞在振幅或时间进程上无显著差异的信号(图3C–D）。提高[Ca²⁺]_c（c）ATP也没有改变Δψ_米在任何细胞系中。因此，这些线粒体突变不会导致线粒体对[Ca²⁺]_c（c）这些条件下的信号。

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图3

钙稳态。同时测量[Ca²⁺]_c（c）和ΔΨ_米由神经元制成(A–B)和星形胶质细胞(C–D类)在与呋喃-2和罗丹明123共同负载的混合培养基中。每种情况下都会显示单个单元格的痕迹。线粒体突变不会导致其对[Ca的线粒体反应发生病理变化²⁺]_c（c）这些条件下的信号。

线粒体中活性氧的产生

线粒体被广泛认为是许多神经退行性疾病状态下活性氧的重要来源。呼吸链受损的线粒体产生的线粒体活性氧增加可能是线粒体DNA突变导致细胞功能障碍的一个因素（Fukui和Moraes，2008). 通过将氢乙硫胺作为细胞溶质指示剂与线粒体靶向氢乙硫醇的信号进行比较，我们试图区分细胞溶质和线粒体基质中产生的活性氧物种。通过测量红色荧光（氧化氢乙硫胺或乙硫胺）的增加速率与紫外线诱导的蓝色氢乙硫醇荧光的消失速率之比来评估活性氧生成速率（见“材料和方法”一节）。为了从其他产生活性氧物种的来源中分离线粒体，使用了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶抑制剂（apocynin，1 mM或0.5µM二苯碘铵）和黄嘌呤氧化酶抑制剂（oxypurinol，10μM）（阿布拉莫夫等。,2007). 对照（ES-I）细胞和CY1-I细胞的胞浆和线粒体基质中的活性氧生成速率没有显著差异(图4A） ●●●●。线粒体基质中CY2-I神经元的活性氧生成速率显著高于ES-I神经元（1.5倍；n个= 121;P（P）<0.05）和胞浆中（与ES-I相比，比率增加了1.8倍；n个= 161;P（P）< 0.05;图4A） ●●●●。复合物I（CY3-I神经元）的严重突变也与两种基质中活性氧生成速率的显著增加有关（比ES-I高1.9倍；n个= 178;P（P）< 0.001;图4A） 胞质溶胶（比ES-I高3.3倍；n个= 195;P（P）< 0.001;图4A） ●●●●。

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图4

线粒体突变细胞中线粒体和细胞溶质活性氧的产生。与对照组相比，CY3-I神经元线粒体靶向氢乙硫胺（Mitosox）和氢乙硫醇比率的基础增加率明显较高，表明细胞内和细胞外活性氧的基础生成量较高(A类). 柱状图显示了线粒体靶向氢乙硫胺或氢乙硫醇比率的百分比值，与对照神经元的100%相比。(B–E类)显示ΔΨ的增加_米线粒体底物（丙酮酸和TMPD/抗坏血酸）或鱼藤酮对复合物1的抑制表明活性氧生成依赖于ΔΨ_米. *P（P）< 0.05; **P（P）< 0.001.

CY3-I神经元中活性氧的高生成率可能是这些细胞线粒体呼吸链的两个特征的结果，即复合物I的缺陷和较高的Δψ_米为了探索这一点，我们为复合物I使用了额外的底物，即5 mM丙酮酸，并诱导ES-I细胞中氢乙硫胺比率增加2.2倍(n个= 153;P（P）<0.001），但不在CY3-I神经元中(n个= 114;图4B和C）。随后用5μM鱼藤酮抑制复合物I，导致ES-I神经元的活性氧生成量进一步增加（相对于基本速率增加3.1倍），但CY3-I细胞减少（从ES-I神经细胞的基本速率增加3.3倍到CY3-1细胞速率增加1.5倍；P（P）< 0.05;图4B和C）。在CY3-I细胞中，底物和鱼藤酮的作用表明，高Δψ维持了CY3-1神经元中活性氧的生成_米。

在CY2-I细胞中，鱼藤酮的存在增加了活性氧的生成（达到CY2-1基本速率的289±24%）。丙酮酸也增加了CY2-I细胞中活性氧的生成（163±11%的基础；n个=144），但随后应用沃斯特蓝（TMPD；200μM）/抗坏血酸（5 mM）抑制了CY2-I神经元的活性氧生成（至基频氢乙硫胺比率的106±6%）。在CY2-I神经元中，活性氧生成增加可能是由于复合物IV的缺陷所致。

谷胱甘肽测量

细胞活性对活性氧生成增加的反应取决于细胞抗氧化系统的效率。谷胱甘肽是中枢神经系统的主要抗氧化机制之一。氧化应激——活性氧生成速率压倒抗氧化防御的状态，通常与谷胱甘肽耗竭有关，并导致中枢神经系统病理学（Dringen和Hirrlinger，2003). MCB用于测量共同培养的非激活神经元和胶质细胞中的谷胱甘肽状态。神经元和星形胶质细胞中谷胱甘肽浓度水平之间的差异已得到证实（基兰等。,2001; Dringen和Hirrlinger，2003)在这些分化的干细胞制剂中观察到，所有神经元组的MCB荧光水平约为同一培养物中星形胶质细胞信号的40%(图5). 尽管我们在CY2-I神经元中测量到较高的活性氧生成率，但复合物IV的突变与神经元或星形胶质细胞中谷胱甘肽浓度的显著变化无关(图5). 复合物I（CY3-I）的严重突变不仅与线粒体中活性氧生成增加有关，还与神经元和星形胶质细胞中谷胱甘肽浓度的显著降低有关。CY3-I神经元的MCB荧光水平为对照（ES-I）的59±4%，星形胶质细胞为62±5%(P（P）两者均<0.001；n个=4个实验；图5). 因此，CY3-I细胞中的严重复合物I突变会导致氧化应激。

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图5

神经元和星形胶质细胞中的谷胱甘肽。MCB用于评估星形胶质细胞和神经元谷胱甘肽浓度。给出了MCB-谷胱甘肽加合物在稳态下的平均荧光强度。在CY3-I中，与其他细胞系相比，星形胶质细胞和神经元中的谷胱甘肽浓度降低。

线粒体膜电位

膜电位的维持是线粒体的一个基本特性。缺乏线粒体DNA（rho0）的细胞尽管不能进行任何氧化代谢，但仍保持适度的膜电位。线粒体膜电位的释放对细胞有许多后果，包括凋亡。我们发现复合物I的严重突变改变了神经元和星形胶质细胞线粒体膜电位的维持机制。在对照细胞和具有复合IV突变的细胞中，Δψ_米由呼吸链的质子泵活动维持。神经元和胶质细胞中的严重复合物I突变显著损害了氧化磷酸化。F水解ATP₁F类_哦-ATP酶（复合物V）在这些条件下发生，将质子泵过内膜并维持Δψ_米值得注意的是，具有相同突变的未分化胚胎干细胞通过呼吸链活性维持线粒体膜电位，因此，决定维持Δψ能力的特性_米通过ATP水解，神经元和胶质细胞似乎在分化时发生转换。考虑到与其他细胞类型相比，神经元的糖酵解活性较低（Snyder和Wilson，1983)线粒体疾病患者常见的癫痫等病理状态下，ATP摄入增加可能对神经元有害。这具有临床相关性，因为癫痫是线粒体DNA疾病的一个非常显著的特征，有证据表明线粒体脑肌病、乳酸酸中毒和中风样发作（MELAS）综合征患者中出现的中风样发作通常与癫痫发作有关（Betts等。,2006).

钙处理

一个有趣的观察结果是，在所用的实验条件下，细胞系对钙的正常处理。钙离子是神经元功能的核心，将电活动转化为分子信号。此外，细胞溶质Ca改变²⁺调控是进入各种细胞死亡途径的基础。因此，形成钙的因素²⁺瞬变在正常的神经元功能中可能具有重要意义。线粒体在这方面起着关键作用。Δψ_米为钙的积累提供强大的驱动力²⁺来自胞浆（Vasington和Murphy，1962; 卡拉福利等。,1964; Crompton和Heid，1978). 解偶联剂Δψ_米防止线粒体吸收钙²⁺从而改变胞质Ca的时间进程²⁺神经元的瞬变（Werth和Thayer，1994)和星形胶质细胞（Boitier等。,1999). Δψ的保存_米在所用条件下的所有细胞系中，这可能是对这些细胞系中正常钙处理的解释。

令人难过的是，在撰写本文的过程中，丹尼斯·柯比（Denise Kirby）病逝，作者想把这篇文章献给这位杰出的科学家和伟大的同事。