精氨酸酶II限制宿主防御幽门螺杆菌通过减弱巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶的翻译

细菌、细胞和培养条件

幽门螺杆菌按照描述生长和使用SS1(12,38)感染的多重性（MOI）定义为细菌与真核细胞的比率。柠檬酸杆菌如前所述种植和使用(39,40). 巨噬细胞被活细菌或用法国压榨机制备的裂解物激活(13)，并且如所述在裂解液中测定MOI(12). 对于杀菌研究幽门螺杆菌通过过滤器支架从巨噬细胞中分离(13). 当添加活细菌时，使用不含抗生素的培养基(11,13,14). 共培养24小时后，通过连续稀释和培养来测定细菌的杀伤作用，并比较有或无巨噬细胞共培养样品的菌落生长。小鼠巨噬细胞系RAW 264.7保持在完整的DMEM中(13). 实验中，培养基改为无L-精氨酸、无血清的DMEM，补充0.3%的BSA，如前所述(13). 然后添加所需浓度的L-精氨酸(13).

老鼠

所有动物实验均由范德比尔特大学动物护理和使用委员会（田纳西州纳什维尔）批准。C57BL/6野生型（WT）小鼠取自杰克森实验室（马里兰州巴尔港）。C57BL/6精氨酸2^−/−这些老鼠是Brendan Lee（德克萨斯州休斯顿贝勒医学院）送的礼物，在纳什维尔退伍军人事务医疗中心饲养。在8周龄时使用雄性小鼠。如前所述分离腹腔巨噬细胞(14)并用于无L-精氨酸、无血清的DMEM。此外，给小鼠灌胃5×10⁸ 幽门螺杆菌100μl中的SS1布鲁氏菌属肉汤或肉汤。在一些研究中，在饮用水中用0.1%（w/v）BEC处理小鼠(40)从感染前1天开始，共持续3天。在接种后2天处死小鼠，切除胃并用于分离胃巨噬细胞，按所述进行(13).

NO的测量

NO、亚硝酸盐（NO）氧化代谢物的浓度₂⁻)，由格里斯反应评估(9–11,13,14).

实时PCR

如前所述，使用iNOS、Arg1和β-actin的引物(10,13). 对于Arg2，我们使用产生234-bp产物的引物，如下所示：正、5′-GGATCCAGAAGGTGATGGAA-3′和反义、5′-AFAGCGAGCAACCTGT-3′。提取mRNA，按所述合成cDNA(13)和2μl用于iNOS、Arg1、Arg2和β-actin与iQSYBR绿色Supermix（Bio-Rad）的实时PCR。热循环条件和用于计算相对表达式的方法如下所述(13).

免疫印迹分析

RAW 264.7细胞用幽门螺杆菌各图中所示的不同时间点的裂解物。如前所述，对巨噬细胞进行裂解，并对iNOS和β-肌动蛋白进行蛋白质印迹(13). 为了检测Arg2，我们使用了一种山羊多克隆抗体（L-20），该抗体是在圣克鲁斯生物技术公司（加利福尼亚州圣克鲁斯）生产的抗鼠Arg2抗体，稀释度为1:500。为了检测Arg1，使用一种针对人类Arg1产生的小鼠多克隆抗体（BD Transduction Laboratories，San Jose，CA），稀释度为1:2000。

流式细胞术检测iNOS蛋白

刺激后，将细胞清洗、固定、渗透，并用抗iNOS抗体染色，然后按所述进行流式细胞术(13).

iNOS的翻译分析

有或无RAW 264.7巨噬细胞的后刺激幽门螺杆菌在有或无BEC的情况下裂解产物，蛋白质被代谢标记为[³⁵S] 蛋氨酸和iNOS翻译分析(13,14).

siRNA在巨噬细胞中的瞬时转染

ODC siRNA转染按所述进行(14). 对于Arg2敲除，我们使用siRNA双靶向核苷酸1168–1186，如下所示：sense，5′-GGCAUUCGAAGGAGAUtt-3′；反义，5′-AUCUGUCCUGAAUGCCtt-3′。扰乱siRNA和转染和激活条件如所述(14,38).

细胞溶质和线粒体部分的精氨酸酶活性

根据制造商的说明，使用Calbiochem（加利福尼亚州La Jolla）的细胞质/线粒体分馏试剂盒对RAW 264.7细胞进行裂解和分馏。将两个级分的蛋白质与0.1μM L-鸟嘌呤一起孵育-¹⁴C-Arg（NEN，Boston，MA）在37°C下24小时，精氨酸酶活性按所述进行测定(41).

Arg2和线粒体的免疫荧光染色

RAW 264.7电池（1×10⁴)镀在四孔室玻璃载玻片中。处理后，将MitoTracker Red（Invitrogen）以100 nM的浓度添加到细胞培养物中30分钟。用PBS清洗细胞，并将其固定在3.7%的甲醛中。然后将细胞在100%冷冻甲醇中渗透，清洗，并在室温下用Background Sniper（加州康科德市Biocare Medical）封闭细胞1小时。细胞在室温下用一级抗体到二级精氨酸（1:200稀释；Santa Cruz Biotechnology）培养1小时，然后在室温下使用FITC-标记的驴抗羊二级抗体（1:1000稀释）培养45分钟。用DAPI对细胞进行核染色。如前所述，对载玻片进行干燥、安装和可视化(39).

胃巨噬细胞NO生成和iNOS蛋白表达分析

将分离的胃巨噬细胞接种在96孔板中。不₂⁻浓度通过Griess反应测定，iNOS蛋白通过流式细胞术测定(13).

幽门螺杆菌诱导巨噬细胞Arg2定位于线粒体

因为我们发现精氨酸酶的抑制对iNOS和NO的产生有显著影响，所以我们探讨了幽门螺杆菌更深入地研究精氨酸酶亚型的诱导。RAW 264.7巨噬细胞被刺激幽门螺杆菌在6小时内，我们已经证明对幽门螺杆菌(10,12,13,42)和Arg1和Arg2 mRNA水平通过实时PCR定量(图3A类). Arg2 mRNA水平随着幽门螺杆菌在L-精氨酸存在下刺激4倍（0.1-1.6 mM），BEC对这种诱导没有影响(图3A类). 值得注意的是，在缺乏L-精氨酸的情况下，Arg2 mRNA水平较高，与iNOS的作用类似(图1B)正如我们所描述的，这可能是由于L-精氨酸缺乏引起的细胞应激(13). 我们证实，Arg1 mRNA水平没有被上调幽门螺杆菌BEC不影响Arg1水平(图3B).

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图3

Arg2被上调幽门螺杆菌刺激巨噬细胞并定位于线粒体。Arg1(A类)和Arg2(B)实时PCR检测mRNA表达。将数据标准化为β-肌动蛋白，并表示为在0.4 mM浓度的L-精氨酸下与未感染的对照细胞相比增加了倍。数据是三个单独实验的平均值±SEM。C类在有或无BEC（90μM）的情况下，Arg2和β-肌动蛋白的代表性Western blot显示，细胞在刺激后24小时收获，每条通道装载20μg蛋白质。使用和不使用BEC处理的样品的印迹与相同的抗体一起培养，并暴露在相同的薄膜上。D类，线粒体和细胞溶质部分的精氨酸酶活性幽门螺杆菌-刺激巨噬细胞，在激活后18小时进行评估。数据是两个单独实验的平均值±SEM*第页<0.05比较幽门螺杆菌-将受刺激细胞转化为未受刺激对照细胞的胞质部分；^§第页<0.05比较线粒体部分和细胞溶质部分幽门螺杆菌-刺激细胞。E、 FITC检测Ab染色巨噬细胞对小鼠Arg2的免疫荧光显微照片（绿色）；线粒体用MitoTracker（红色）标记，细胞核用DAPI染色。

当评估Arg2蛋白水平时幽门螺杆菌L-精氨酸刺激。当L-精氨酸水平高于0.1 mM时，这一点没有改变，BEC对受刺激的Arg2水平没有影响(图3C类). 当细胞缺乏L-精氨酸时，没有可检测到的Arg2蛋白表达幽门螺杆菌尽管Arg2 mRNA水平增加，但仍会受到刺激。这与我们之前的研究结果一致，即巨噬细胞中发生全局蛋白质翻译需要生理水平的L-精氨酸（0.1mM）(13).

Arg2有一个先导序列，可以将其靶向线粒体(43). 因此，我们在以下条件下测定了Arg2在巨噬细胞中的亚细胞定位幽门螺杆菌刺激。当比较细胞溶质和线粒体组分中的精氨酸酶活性时，只有线粒体组分在幽门螺杆菌刺激(图3D类). 与此一致，幽门螺杆菌通过与线粒体共定位的免疫荧光检测诱导Arg2染色显著增加(图3E类).

精氨酸酶抑制对iNOS蛋白表达的影响在另一种肠道病原体中没有观察到，C.啮齿动物

因为我们能够证明Arg2通过影响iNOS蛋白水平来限制NO的生成幽门螺杆菌-刺激巨噬细胞，我们试图确定这种效应是否对幽门螺杆菌为了解决这个问题，我们使用了小鼠大肠杆菌诱导病原体C.啮齿动物，我们已经证明在体内诱导iNOS和Arg1(40). 与相同幽门螺杆菌、啮齿动物螺杆菌裂解物刺激RAW 264.7细胞产生NO，BEC增强了NO的生成(图4A类). 与它对幽门螺杆菌-当细胞被激活时，添加BEC不会导致iNOS蛋白水平增加C.啮齿动物(图4B). 尽管幽门螺杆菌仅诱导Arg2蛋白表达，C.啮齿动物刺激导致Arg2适度增加，Arg1水平显著增加。综上所述，这些数据表明精氨酸酶抑制巨噬细胞NO生成的机制因这些病原体而异。

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图4

精氨酸酶抑制增加NO生成，但不增加iNOS蛋白水平C.啮齿动物-刺激巨噬细胞。RAW 264.7巨噬细胞在含有0.4 mM L-精氨酸的无精氨酸和无血清DMEM中培养。A类，用刺激细胞幽门螺杆菌或C.啮齿动物（C.rod）在存在或不存在精氨酸酶抑制剂BEC（90μM）的情况下裂解24小时。不₂⁻在上清液中测量。数据是四个单独实验的平均值±SEM**第页< 0.01; ***第页在使用相同细菌处理的细胞中，将−BEC（单独培养基）与+BEC进行比较，结果<0.001。B24小时后对iNOS、Arg2、Arg1和β-肌动蛋白进行Western blotting，每条泳道装载20μg蛋白质。显示了典型的Western印迹；在另外两个实验中观察到类似的结果。使用相同的膜测定所示的所有蛋白质水平。用刺激的样品中的斑点幽门螺杆菌或C.啮齿动物与同一抗体一起孵育，并暴露在同一张自显影胶片上。

敲除Arg2增加NO生成和iNOS蛋白水平

因为幽门螺杆菌选择性诱导Arg2，我们试图确定Arg2的敲除是否与BEC具有相同的效果，BEC抑制Arg1和Arg2(35,36). 通过siRNA的转染，我们能够在幽门螺杆菌-受刺激的RAW 264.7巨噬细胞(图5A类). 在用Arg2-siRNA转染的细胞中，我们观察到幽门螺杆菌-刺激NO生成(图5B). 尽管Arg2的击倒对幽门螺杆菌-刺激的iNOS mRNA水平(图5C类)通过Western blot分析，它导致iNOS蛋白水平持续增强(图5D类)经密度测定证实(图5E类).

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图5

Arg2压下幽门螺杆菌-受刺激的巨噬细胞增加NO生成和iNOS蛋白表达。RAW 264.7巨噬细胞转染Arg2 siRNA或干扰对照siRNA（Scr），并用幽门螺杆菌在MOI为100时裂解。实验是在所示的L-精氨酸浓度下进行的。A类，击倒Arg2幽门螺杆菌-在0.4 mM L-精氨酸中培养的受刺激巨噬细胞，在刺激6小时后通过实时PCR对mRNA表达进行评估。B、Arg2敲除对NO的影响₂⁻生产依据幽门螺杆菌-24小时后测量刺激巨噬细胞*第页< 0.05; **第页< 0.01; 和***第页<0.001，将Arg2 siRNA与相同浓度L-精氨酸的加扰对照进行比较。数据是重复进行的两个单独实验的平均值±SEM。C类刺激6h后用实时PCR检测iNOS mRNA水平。将数据标准化为β-肌动蛋白，并以0.4 mM L-精氨酸浓度下与未感染对照组相比的倍数增加表示。D类刺激24小时后通过Western blotting评估iNOS蛋白水平。显示了一个具有代表性的斑点。在两个实验中观察到类似的结果。E类iNOS蛋白印迹通过密度计进行分析，并归一化为β-肌动蛋白。数据是两个单独斑点的平均值±SEM*第页Arg2 siRNA与加扰对照相比<0.05。

当Arg2缺乏的腹腔巨噬细胞受到幽门螺杆菌体外

为了证实Arg2限制巨噬细胞NO生成的研究结果，我们还使用了从WT和Arg2分离的初级腹腔巨噬细胞^−/−老鼠。培养6小时后幽门螺杆菌WT小鼠细胞中Arg2的裂解物、mRNA水平显著增加(图6A类)，而Arg1水平没有增加(图6B). WT和Arg2的腹腔巨噬细胞iNOS mRNA水平也增加^−/−老鼠(图6C类). 共培养24小时后幽门螺杆菌，Arg2缺乏的腹腔巨噬细胞产生的NO明显多于WT巨噬细胞(图6D类). 由于细胞数量有限，我们使用流式细胞术检测iNOS蛋白，我们之前已经证明该蛋白高度敏感，并且与通过免疫印迹法评估的巨噬细胞iNOS蛋白质水平密切相关(13). iNOS蛋白水平伴随着幽门螺杆菌对WT细胞的刺激，在Arg2缺乏的腹膜巨噬细胞中进一步上调(图6D类, 6E类).

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图6

当Arg2缺乏的腹腔巨噬细胞受到幽门螺杆菌体外试验。从C57BL/6 WT和Arg2中分离出巨噬细胞^−/−小鼠、计数和电镀。细胞受到刺激幽门螺杆菌在100的MOI下裂解6小时以检测mRNA水平，24小时以检测蛋白质水平。Arg2（A），Arg1(B)和iNOS(C类)实时PCR检测mRNA表达。所有实时PCR数据均标准化为β-肌动蛋白，在0.4mM浓度的L-精氨酸下，与未感染的对照相比增加了一倍。实时PCR数据是四个单独实验的平均值±SEM**第页< 0.01; ***第页<0.001与WT控制；^§第页< 0.05;^§§§第页<0.001 vs WT+HP(A类,C类).D类，否₂⁻生产。数据是每组使用三只小鼠进行的两个单独实验的平均值±SEM***第页与WT对照组相比<0.001；^§§§第页<0.001比较Arg2^−/−至WT。E类流式细胞术检测iNOS蛋白水平。数据是四个单独实验的平均值±SEM**第页< 0.01; ***第页与WT对照组相比<0.001；^§§第页与Arg2相比<0.01^−/−至WT。F类，腹腔巨噬细胞iNOS蛋白水平的代表性直方图；请注意，Arg2向右移动的幅度较大^−/−+与WT+HP相比，HP。

精氨酸酶在幽门螺杆菌-受刺激的巨噬细胞增强NO生成和细菌杀伤

我们已经报道巨噬细胞产生iNOS依赖性NO可以杀死幽门螺杆菌增加L-精氨酸的可用性增强了这种效果(13,14). 在目前的研究中，我们发现Arg2限制巨噬细胞中NO的生成和iNOS的翻译。因此，我们试图确定抑制精氨酸酶是否会增强细菌杀灭。对于这些实验，我们使用了一个transwell系统，其中幽门螺杆菌放置在过滤器支架上方，将细菌从巨噬细胞中分离出来，以防止细菌被吞噬作用杀死。在该模型中，精氨酸酶抑制也使巨噬细胞产生显著更多的NO，以响应幽门螺杆菌(图7A类). 与此同时，对幽门螺杆菌过滤器支架上方(图7B). 为了确定BEC杀灭过程中的变化是否与NO有关，我们使用了cPTIO，一种NO清除剂，可以快速将NO转化为NO₂然后转换为NO₂⁻(44). 正如预期的那样，cPTIO增加了NO₂⁻暴露于任何一种物质的细胞的巨噬细胞上清液中的水平幽门螺杆菌单独或幽门螺杆菌加上BEC。值得注意的是，我们在50-350μM的剂量范围内测试了cPTIO，并在这些研究中使用了100μM，因为它对NO的影响₂⁻在这种浓度下，生成趋于平稳。重要的是幽门螺杆菌单独或幽门螺杆菌cPTIO加上BEC组(图7B). 这些数据表明精氨酸酶对细胞外NO生成的限制幽门螺杆菌有助于这种病原体的生存。

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图7

精氨酸酶抑制增加巨噬细胞NO生成和对幽门螺杆菌用NO清除剂减弱。现场幽门螺杆菌放置在transwell过滤器支架上方，在1×10的24孔板中培养⁶在含有0.4 mM L-精氨酸的无精氨酸和无血清DMEM中，以100的MOI培养RAW 264.7细胞24小时。BEC使用浓度为90μM，NO清除剂cPTIO使用浓度为100μM。共培养24h后，通过连续稀释和培养来测定细菌的杀灭率。A类精氨酸酶抑制和NO清除剂对NO的影响₂⁻级别**第页在−cPTIO组中，+BEC与−BEC的差异<0.01；^#第页+cPTIO组中+BEC与−BEC的差异<0.05；^§§第页在−BEC组中，+cPTIO与−cPTIO的差异<0.01；^¶第页+cPTIO组与+BEC组中的−cPTIO相比<0.05。B，通过比较在有或无BEC和/或cPTIO的情况下与巨噬细胞共培养或无巨噬细胞共培养样品的菌落生长来确定细菌杀伤率（%）*第页−cPTIO组+BEC与−BEC的差异<0.05；^§第页在−BEC组中，+cPTIO与−cPTIO的差异<0.05；^¶¶第页+cPTIO组与+BEC组中的−cPTIO相比<0.01。数据是三个单独实验的平均值±SEM。

体内抑制精氨酸酶可增加胃巨噬细胞的NO生成和iNOS蛋白水平幽门螺杆菌-受感染的小鼠

因为我们报告Arg2在幽门螺杆菌-受感染的胃组织(10)，我们现在确定精氨酸酶是否在体内抑制iNOS。巨噬细胞浸润的峰值时间点为接种后48小时(45). 因此，我们测定了饮用水中BEC（0.1%w/v）的施用效果(40)免疫小鼠48 h后胃巨噬细胞iNOS蛋白和NO水平的变化幽门螺杆菌在单独饮用水的小鼠中，NO生成量仅略有增加，但巨噬细胞幽门螺杆菌-用BEC治疗的感染小鼠的NO生成增加了2.6±0.5倍(图8A). 此外，从胃巨噬细胞中分离出的iNOS蛋白水平显著增加幽门螺杆菌-用BEC治疗的受感染小鼠(图8B, 8C类). 相反，经BEC处理的小鼠iNOS mRNA水平没有增加（数据未显示）。这些数据表明，体内抑制精氨酸酶可有效恢复胃巨噬细胞对幽门螺杆菌通过增强iNOS蛋白合成。

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图8

体内抑制精氨酸酶可增加胃巨噬细胞中NO的生成和iNOS蛋白水平。C57BL/6小鼠在灌胃5×10之前，在饮用水中连续给予0.1%BEC溶液24小时⁸ 幽门螺杆菌继续用BEC治疗48小时，处死小鼠，然后分离胃巨噬细胞。A类，细胞培养72小时，NO₂⁻测定上清液中的产量。数据是两个单独实验的平均值±SEM，每组使用三只小鼠**第页将HP+BEC与Ctrl-BEC进行比较，结果<0.01。^§§第页将HP+BEC与HP-BEC进行比较，结果<0.01。B，在分离出胃巨噬细胞后立即通过流式细胞术评估iNOS蛋白水平。数据是每组三只小鼠的平均值±SEM**第页< 0.01; ***第页与WT–BEC相比<0.001；^§§§第页将HP+BEC与HP-BEC进行比较，结果<0.01。C类，胃巨噬细胞iNOS蛋白水平的代表性直方图；注意，右移增加，表明来自幽门螺杆菌-用BEC治疗的受感染小鼠与仅用水治疗的受影响小鼠相比。

这项工作得到了退伍军人事务部医学研究办公室（给K.T.W.）以及国家卫生研究院拨款R01DK053620和R01AT004821（给K.S.W.）的资助。N.D.L.得到了国家癌症研究所的T32CA009592和国家普通医学研究所的F31GM083500的支持。流式细胞术核心服务由范德比尔特大学医学中心消化疾病研究中心提供，该中心由国家卫生研究院拨款P30DK058404支持。A.P.G.和T.S.得到了Philippe基金会的资助。

我们感谢Jordan Wolff在精氨酸酶活性检测方面提供的技术援助。