一个适用于整个小鼠大脑的健壮、高通量Cre报告和表征系统

各种脑细胞类型的强荧光标记

新的报告系是用不同的Cre系培育而成的(表1)测试报告基因的表达，并与现有的Rosa26-EYFP系进行比较¹⁸通过ISH在mRNA水平上直接比较皮层中Cre激活的报告基因表达(图1c)，Rosa26-EYFP报告线显示整个皮层的EYFP信号较弱。与Rosa-EYFP相比，Ai2系的EYFP-表达增强，尽管仍处于中等水平。Ai3、Ai6和Ai9系的报告基因表现出类似的强表达；研究发现，在这些细胞系中，报告基因在单细胞水平上的表达接近于在强表达细胞中的表达您的1-EYFP小鼠¹。在上述所有其他Cre-reporter杂交的其他脑区也观察到类似的结果表1（未显示数据）。

为了量化Rosa26EYFP、Ai2和Ai3的ISH信号的表达差异，它们都使用相同的EYFP探针进行ISH，使用为Allen Mouse Brain Atlas开发的算法计算每个感兴趣区域（AOI）的相对光密度，即集成光密度（IOD）比²⁴。将每一条报告线与普遍存在的EIIa-核心交叉，将整个大脑切片作为AOI的小鼠进行比较(图1d)从Rosa26-EYFP到Ai2，再到Ai3，表达水平的增加非常显著（在所有成对比较中p<0.001）。此外，EYFP的定量RT-PCR(图1e)在小鼠小脑上进行，其中每个报告细胞系与Pcp2-Cre杂交，Pcp2-Cre是一种在小脑中驱动Purkinje细胞特异性表达的Cre系。Rosa26-EYFP中EYFP转录物的扩增需要的周期明显多于Ai2或Ai3中的周期（差异大于3个PCR周期，两种比较中的p<0.001），而Ai2和Ai3之间的差异很小（约0.4个PCR周期），但仍然显著（p=0.021）。

与ISH和qPCR结果一致，所有报告品系均显示中度（Ai2）到强（Ai3、Ai6、Ai9和Ai14）的天然荧光。特别是，Ai6、Ai9和Ai14在全身显示出明亮的荧光（例如。补充图5在线），这将极大地促进体内成像。在成人大脑中，当与同一Cre系杂交时，不同的新报告系总体上呈现出相似的表达模式，具有不同程度的荧光强度(图2a-b)，均显著强于Rosa26-EYFP，其天然荧光大多低于检测水平，需要免疫组织化学（IHC）染色才能显示其表达。虽然EYFP和td番茄荧光均匀分布在细胞及其过程中，但Ai6 ZsGreen荧光主要局限于细胞体，从而形成点状细胞标记模式(图2a-b和补充图6在线）。

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图2

在新的报告行中显著增强了荧光标记。（a–b）与同一Cre驱动系交叉的不同报告系的荧光比较：第二部分-（a）中的Cre，以及聊天-（b）中的Cre。IHC表明使用抗GFP进行免疫染色。与在轴突投射中也可见的td番茄荧光不同，ZsGreen荧光主要局限于细胞体。比例尺，500μm。（c）单神经元荧光定量第二部分-Cre/Rosa26 EYFP，个人2-Cre/Ai2或第二部分-Cre/Ai3小鼠，在暴露时间为140 ms（无饱和）的切片图像上。对三种类型的神经元进行量化，即小脑浦肯野细胞（cb，上面板）、皮层神经元（ctx，中面板）和海马CA1锥体神经元（hpc，下面板）。相对强度=对象（单元格）的强度–背景的强度。对于Ai2和Ai3中的每一个，n=30个神经元从每个区域的3个部分随机选择。对于Rosa YFP，在浦肯野细胞定量中只使用了从一个切片中随机选择的n=10个神经元，因为其他两个切片不可检测。***p<0.001。绘制的值为平均值±SEM。（d–h）td番茄标记的不同细胞类型的不同形态：（d）齿状颗粒细胞；（e） 皮层中间神经元；（f） 浦肯野细胞；（g） 小脑Bergmann胶质细胞；（h） 树突棘。（i）大脑皮层第6层神经元的丘脑皮质投射Ntsr1号机组-Cre/Ai14小鼠。（j）将rAAV-Cre注射到体感皮层的Ai14小鼠的皮层丘脑投射。（k） 体内麻醉患者视皮层2/3层td番茄表达神经元（红色）和OGB负载神经元（绿色）的双光子成像Wfs1型-Tg2-CreERT2/Ai9鼠标。比例尺，50μm。

为了更客观地评估不同荧光蛋白的荧光强度，将TetraSpeck荧光珠（4.0μm）直接铺在切片上，并作为标准，比较不同脑切片中荧光标记细胞的亮度(补充图7在线）。评估的天然荧光强度按以下顺序增加：Rosa-EYFP<Ai2（EYFP）<Ai3（EYFP）<Ai9（tdTomato）=Ai14（tdTomaso）<Ai6（ZsGreen），而不管使用哪种Cre品系。单细胞水平荧光信号的进一步量化(图2c)在Rosa26-EYFP、Ai2或Ai3分别与第二部分-Cre不仅在Purkinje细胞中诱导重组，而且在其他地方也有部分重组，特别是在海马体和视觉皮层。小脑Purkinje细胞、皮层神经元和海马CA1锥体细胞的Ai3标记明显强于Ai2（所有比较中均p<0.001），而Rosa26-EYFP的标记基本上无法检测到。综上所述，这些数据表明，新的报告基因系增强了报告基因的表达，并且从Ai2到Ai3还有进一步的改进。Ai2和Ai3之间的差异表明WPRE序列改善了我们系统中的转录和/或蛋白质表达。

随着报告基因表达的显著增强，在各种Cre-driver系中很容易检测到比先前报告中预期更多的重组细胞，例如Slc6a3系列-Cre公司²⁵和第二部分-Cre公司²⁶(补充图8在线），其中Cre介导的重组先前被认为仅限于使用Rosa26-LacZ或Rosa26-EYFP报告小鼠的某些细胞类型。这些结果表明，要么新的报告株对低水平Cre更敏感，导致对Cre阳性人群进行更彻底的鉴定，要么在以前的报告株中更多的细胞中发生了Cre介导的重组，但由于低报告表达而未被检测到。

Ai9和Ai14中的强td番茄天然荧光允许在共焦显微镜下直接显示不同细胞类型（兴奋性、抑制性或胶质）的精细结构细节，如树突棘和薄轴突(图2d–h). 此外，可以使用这些报告线绘制长距离轴突投影。例如，将Ai14繁殖到Ntsr1号机组-Cre线，已知标记皮层第6层兴奋性神经元²⁷导致皮质丘脑投射物的强烈标记(图2i). 一种表达Cre的重组腺相关病毒（rAAV-Cre）也与这些报告株系一起用于绘制轴突投影图。将rAAV-Cre病毒注射到Ai14小鼠的体感皮层后，皮质丘脑、皮质胼胝体和皮质脊髓的投射物均呈强荧光(图2j和数据未显示）。强大的td番茄天然荧光还可以通过体内双光子成像，其中td番茄阳性神经元（红色）和钙染色神经元（绿色）很容易区分(图2k). td番茄阳性神经元的树突也清晰可见（如小红点）。

Cre重组模式的系统表征

利用为生成艾伦小鼠脑图谱而开发的系统(http://mouse.brain-map.org)²⁴，已开发出一个特征化管道，以系统地评估整个小鼠大脑中的基因表达模式，这些模式由不同的Cre-driver系定义。该管道的优势在于，在覆盖整个大脑的截面上生成特征数据，获得高分辨率图像，ISH数据注册到艾伦参考地图集²⁸并可用于信息学数据挖掘，所有表征数据均公开显示在http://transgenicmouse.alleninstitute.org/.

迄今为止，我们已经系统地描述了20多个Cre-driver品系(表1). 这些包括其他研究人员先前生成的一组具有代表性的Cre线，这里首次报道了这些线的综合特征，以及我们生成的一系列新Cre线。包括以下类型的数据。（1） Cre或报告基因的比色ISH（CISH）显示单细胞分辨率下的mRNA表达。（2） 双荧光灯就地报告基因与另一个感兴趣基因（原始靶基因或另一个细胞型标记）的杂交（DFISH）显示了模式重演的程度或细胞类型的一致性。（3） 报告基因的XFP天然荧光或IHC显示报告基因在整个大脑的蛋白质水平上的表达(例如 图2a-b). 表征示例如所示补充图9的联机聊天-创建。

使用先前开发的算法进行信息学图像处理²⁹ISH数据集可以提供有关基因表达定位的其他信息。例如，我们评估了EYFP在Slc6a3型-Cre/Ai3鼠标。在Slc6a3系列-Cre公司²⁵，Cre靶向多巴胺转运体基因(Slc6a3系列)在多巴胺能神经元中表达。与ISH相比Slc6a3型EYFP基因本身的表达更为广泛，不仅存在于多巴胺能神经元中，例如位于腹侧被盖区（VTA）/黑质，与Slc6a3系列(图3a，左侧面板），但也存在于其他脑区，大多稀疏分散，但也聚集在基底前脑的某些区域(例如 图3a，右侧面板）、皮质杏仁核区域和脑干（数据未显示）。已将EYFP ISH数据注册到艾伦参考地图集(图3b)，其中每个部分与检测到的ISH信号一起放入3D参考体积。使用Brain Explorer将表达模式进一步可视化为3D模型³⁰将解剖分区覆盖在每个截面上。然后提取每个截面最近的艾伦参考地图集平面，以帮助识别感兴趣区域。使用这种方法，基底前脑中的EYFP阳性细胞簇定位于终纹床核（BST，图3b，红色箭头）。这一预测与之前的研究一致，这些研究表明多巴胺转运体可能在发育过程中在BST中瞬时表达³¹.

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图3

ISH特征数据的信息处理。（a）EYFP（绿色）与Slc6a3系列（红色）在Slc6a3系列-DFISH生产的Cre/Ai3鼠标。在VTA/黑质区域（左侧面板），EYFP主要与Slc6a3系列（>90%的细胞被联合标记），表明多巴胺神经元中预期的Cre重组。在基底前脑区（右侧），EYFP阳性细胞簇为Slc6a3系列-消极。比例尺，200μm。（b）EYFP ISH数据来自Slc6a3系列-Cre/Ai3小鼠被数字化并注册到艾伦参考地图集，允许进行解剖搜索和比较。两个已登记的EYFP ISH数据部分显示为重叠有解剖分区。EYFP表达出现在两个部分（白色和红色箭头）。

BAC转基因Cre驱动系的建立

含有直接Cre和可诱导CreERT2的质粒以及Frt位点旁的可选标记（Frt-Neo-Frt）用于所有后续靶向包含感兴趣基因的BAC。质粒的Cre-Frt-Neo-Frt部分用侧翼寡核苷酸进行PCR扩增，该寡核苷酸设计为与感兴趣的BAC具有50bp同源臂。使用的特定BAC克隆为：RP23-476E22A930038C07瑞克，RP23-405O19用于Wfs1型，RP23-405B24用于Scnn1a型，和RP23-116K19用于8030451F13瑞克.RedET重组⁴³将经序列验证的PCR产物插入每个BAC上特定基因位点的ATG起始位点。利用FLP重组从BAC中去除新霉素选择标记。在原核注射之前，去除RP23 BAC主干中存在的野生型loxP位点。质粒构建由Gene Bridges GmbH（德国海德堡）完成。

使用NucleoBond BAC100试剂盒（Clontech）制备原核注射用BAC DNA，并在Sepharose CL4b柱上线性化和纯化。通过脉冲场凝胶电泳分析组分，以确定线性化BAC DNA浓度最高和载体DNA浓度最低的样品。将线性化BAC DNA以1纳克/μl的浓度注射到C57BL/6 x B6C3F1合子中。

转基因小鼠特性

所有实验程序均由艾伦脑科学研究所动物护理和使用委员会（IACUC）根据NIH指南批准。所有特征均使用P56岁或以上的成年小鼠进行。具有特征的小鼠具有混合遗传背景，包含50-75%的C57BL/6背景和129个或来自不同Cre系的其他背景。为了通过荧光蛋白的天然荧光或IHC对荧光蛋白进行系统表征，使用胶带转移技术对灌注的大脑进行冷冻切片，然后直接或在抗体染色后对切片进行DAPI染色，并使用自动荧光显微镜捕获图像。从灌注脑中取100μm厚的切片，用于荧光标记细胞的共焦成像。为了通过比色ISH或DFISH系统表征基因表达，艾伦研究所建立了组织处理、探针杂交、图像采集和数据处理的管道。使用Allen Mouse Brain Atlas空间映射平台进行信息学信号识别、映射和量化^24,29在该管道中，图像序列经过预处理（白底和裁剪），然后注册到C57BL/6J小鼠大脑的三维信息学参考图谱中²⁸。此注册使数据能够显示在2D截面或重建的3D体积中。

他莫昔芬诱导

三苯氧胺首先溶于乙醇（20 mg/500μl）中，然后将该溶液与980μl玉米油混合，最终浓度为20 mg/ml。然后用加热速度真空除去乙醇。在约2个月大的含有CreERT2的小鼠体内注射大约200μl三苯氧胺溶液（200 mg/kg），每天注射一次，持续5天。对动物进行不良反应监测，如果这些不良反应明显，则停止治疗。治疗结束一周后，按照下文所述对动物进行ISH或XFP定位处理。

比色法就地杂交（CISH）

用于处理组织RNA的系统就地杂交（ISH）、尼塞尔染色、图像采集和数据处理用于生成艾伦小鼠脑图谱(http://mouse.brain-map.org)使用了。框架、工作流程和设备已在前面进行了描述²⁴并可在文档中的数据生成过程中找到–补充资料艾伦小鼠脑图谱部分(http://mouse.brain-map.org/pdf/ABADataProductionProcesses.pdf). 有关在ISH中使用的Cre或报告特异性探针的信息可以在转基因小鼠数据库中找到(http://transgenicmouse.alleninstitute.org/).

双荧光灯就地杂交（DFISH）

双荧光灯就地杂交（DFISH）是基于CISH协议，如前所述⁴⁴简言之，用地高辛（DIG）或二硝基苯基-11-UTP（DNP；Perkin Elmer）标记核糖探针。将DIG-标记探针和DNP-标记探针同时杂交，并使用抗DIG-HRP（Perkin Elmer）和酪氨酸酶生物素或抗DNP-HRP（珀金Elmer。分别用链霉亲和素Alexa-Fluro 488（Invitrogen/Mollecular Probes）或抗-DNP-Alexa-Fluor 555（Invit罗gen/Molular Probe）标记生物素或DNP来检测信号。在莱卡Autostainer上用200 ng/ml的DAPI（Invitrogen/Mollecular Probes）溶液对载玻片进行染色，DAPI溶液缓冲在TNT中，并用添加5.0%Dabco防褪色剂（Sigma）的Hydromatrix安装介质覆盖载玻片。图像是根据数据生成过程中描述的DM6000B徕卡显微镜上采集的缝合瓷砖创建的(http://mouse.brain-map.org/pdf/ABADataProductionProcesses.pdf)除了使用DAPI信号建立聚焦和边界框之外。

胶带转移切片

胶带转移部分是在配备有Instrumedics胶带转移系统的徕卡3050 S低温箱上完成的，该系统包括紫外线聚合室和加热垫。一卷Instrumedics磁带上的旗帜被切成了单独的旗帜。将载玻片涂上50μl溶液B粘合剂，并让其风干。在进行切片之前，将幻灯片放在保温垫上。胶带旗的粘性表面位于组织的块面上。在将一部分切割并提升到胶带旗上后，将其放在保温垫上的滑梯上。使用刷子对胶带标记施加压力，使其完全层压到载玻片上。在对载玻片的所有胶带标记进行层压后，将载玻片放入紫外光聚合装置中，该装置随后被激活。紫外光治疗后，用镊子取出胶带标记，使部分粘在载玻片上。

XFP的定位和免疫组织化学（IHC）

用4%多聚甲醛在0.1 M PB中灌注动物。大脑在4°C下再固定18小时。然后在4°C的PBS中用20%（w/v）蔗糖对大脑进行冷冻保护过夜。将大脑埋入OCT中，并使用胶带转移法切割25μm冰冻切片。对于XFP的直接成像，切片进行DAPI染色，并如上所述覆盖滑动。对于单标记免疫荧光，切片在含有0.3%Triton X-100和5%正常山羊血清（NGS）的PBS中在室温下孵育30分钟。切片在4°C下与抗GFP（Abcam；1:1000稀释）孵育过夜。切片在含有1%NGS的PBS中漂洗30分钟，在山羊抗兔IgG Alexa Fluor 488（Invitrogen；1:400稀释）中室温孵育2小时，在含有1%NGS的PBS中漂洗10分钟，并在PBS中漂洗30分钟。然后切片进行DAPI染色并如上所述盖上盖子。XFP或IHC成像与DFISH自动荧光显微镜方法相同。

共焦成像

使用徕卡SM2000R滑动切片机将灌注脑切片至100μm。使用BD CarvII旋转圆盘共焦成像系统（BD Biosciences）对切片进行成像，该系统连接到Leica DM6000B显微镜上，视情况使用Leica 20x/0.70 NA、40x/12.5 NA油或100x/1.4 NA油透镜。使用Spot Boost EM CCD相机收集图像。图像是用IPLab Software（Scanalytics Inc.）拍摄的。

体内双光子成像

定制的双光子扫描显微镜⁴⁵使用了Mai-Tai DeepSee激光器（光谱物理）。用0.7%异氟烷在20:80，O2:N2混合物中麻醉小鼠并进行通气，并使用注射镇静剂氯丙噻嗪（1-2 mg/kg）进行镇静剂镇静剂。通过开颅手术窗，使用贴片吸管将钙指示染料俄勒冈州绿BAPTA-1（OGB）大量注入小鼠视觉皮层V1的2/3层⁴⁶两个不同的2光子激发波长，即分别使用.950nm和800nm来区分红色tdTomato标记的细胞与OGB信号。使用605nm的tdTomato滤光片和525nm的OGB滤光片采集图像。在不同深度（100–400μm）采集图像。

表达Cre的重组腺相关病毒（rAAV-Cre）

将EGFP-Cre（Addgene）克隆到pAAV-MCS载体（Stratagene）中。合成的重组病毒载体被包装在血清型8和高滴度病毒（约10¹³基因组拷贝（gc）/ml）由哈佛基因治疗计划（HGTI）制作。为了可视化来自体感皮层的投射，1-2μl rAAV EGFP Cre（1.6×10¹³将gc/ml）注射到麻醉的Ai14小鼠中，在相应的立体定位坐标下，使用连接到Picospritzer（Parker Hannifin）的玻璃微移液管。通过多次低压吹气缓慢给药，以将组织损伤降至最低（10 psi，10-20 ms持续时间，2 Hz和10 min/μl）。然后将小鼠回收并单独饲养，直至用于进一步分析。

RT-qPCR定量EYFP转录水平

解剖组织并立即将其储存在4°C的RNALater（Ambion）中，直到RNA分离。使用TRIzol试剂（Invitrogen）从均质组织中分离RNA，并使用MagMax-96总RNA分离试剂盒（Ambion）纯化RNA。RNA浓度标准化为100 ng/μl。使用SuperScript III第一链合成试剂盒（Invitrogen）和寡核苷酸（dT）和随机引物的混合物，在每个反转录（RT）反应中使用等量（约800 ng）的总RNA。每一个反应都用逆转录酶（RT+）或不使用（RT-）重复进行，以控制任何潜在的基因组DNA污染。使用cDNA进行实时qPCR（从1/20^第个基因特异性引物对和阳性对照引物对Gapdh公司，使用SYBR Green PCR Master Mix（罗氏）。每个样品在Roche LightCycler实时PCR系统上进行4次重复。在完成实时qPCR实验后，测定了所得扩增子的热变性曲线，以确保在不同样品中检测到相同的特异扩增子。使用基因特异性引物达到荧光阈值所需的周期数与Gapdh公司引物（ΔCp）用于测量相对mRNA丰度。

我们非常感谢由Paul Wohnoutka领导的整个Atlas制作团队和由Chinh Dang领导的艾伦研究所信息技术团队的专业支持，没有他们的支持，工作就不可能完成。我们感谢Amy Bernard在建立DFISH过程中做出的重大贡献，Leonard Kuan负责ISH数据量化，Robert Hunter负责协调转基因小鼠生产。我们还感谢以下研究人员提供了各种研究材料：Roger Tsien用于tdTomato DNA构建，Liqun Luo用于Rosa-CAG靶向构建，Karl Deisseroth用于WPRE DNA构建，Brian Sauer via Addgene用于Cre和EGFP-Cre DNA构建，Pierre Chambon负责CreERT2 DNA构建，PhiC31o、FLPo和pPGKnootpAlox2 DNA构建通过Addgene进行Philippe Soriano，Andras Nagy负责G4 ES细胞系，Guillermo Oliver负责Six3合金-Cre小鼠、Nathaniel Heintz通过突变小鼠区域资源中心（MMRRC）为Ntsr1号机组-Cre小鼠和Xiaoxi Zhuang为Slc6a3系列-Cre小鼠。这项研究由艾伦脑科学研究所资助，并由国家卫生研究院（NIH）向曾浩（H.Zeng）拨款（MH085500）。作者感谢艾伦研究所的创始人保罗·G·艾伦和乔迪·巴顿的远见、鼓励和支持。