美国国家科学院院刊。2010年3月2日；107(9): 4329–4334.
髓系细胞衍生血管内皮生长因子的缺失加速纤维化
,a、，b ,一 ,一 ,一 ,一 ,一 ,c（c） ,c（c） ,d日和a中，1
克里斯蒂安·斯托克曼
一加州大学圣地亚哥分校生物科学部分子生物学科，邮编：92093；
b德国埃森D-45122杜伊斯堡-埃森大学法国生理研究所；
Yann Kerdiles公司
一加州大学圣地亚哥分校生物科学部分子生物学科，邮编：92093；
马克·诺马克斯坦斯基
一加利福尼亚大学圣地亚哥分校生物科学系分子生物学科，邮编92093；
亚历山大·魏德曼
一加州大学圣地亚哥分校生物科学部分子生物学科，邮编：92093；
武田北彦
一加州大学圣地亚哥分校生物科学部分子生物学科，邮编：92093；
安德鲁·多登斯
一加州大学圣地亚哥分校生物科学部分子生物学科，邮编：92093；
安东尼奥·托雷斯-科拉多
c（c）加利福尼亚大学洛杉矶分校分子、细胞和发育生物学系，加利福尼亚州90095；和
路易斯·伊鲁埃拉·阿里斯
c（c）加利福尼亚大学洛杉矶分校分子、细胞和发育生物学系，加利福尼亚州90095；和
维克托·尼泽特
d日加利福尼亚大学圣地亚哥分校儿科和斯卡格斯药学与药物科学学院，加利福尼亚州拉霍亚，邮编92093
兰德尔·S·约翰逊
一加州大学圣地亚哥分校生物科学部分子生物学科，邮编：92093；
一加利福尼亚大学圣地亚哥分校生物科学系分子生物学科，邮编92093；
b德国埃森D-45122杜伊斯堡-埃森大学法国生理研究所；
c（c）加利福尼亚大学洛杉矶分校分子、细胞和发育生物学系，加利福尼亚州90095；和
d日加利福尼亚大学圣地亚哥分校儿科和斯卡格斯药学与药物科学学院，加利福尼亚州拉霍亚，邮编92093
由加州大学圣地亚哥医学院洛杉矶分校Michael Karin编辑，2010年1月15日批准（2009年11月16日收到供审查）
作者贡献：C.S.和R.S.J.设计的研究；C.S.、Y.K.、M.N.、A.W.、N.T.、A.D.、A.X.T.-C.、L.I.-A.、V.N.和R.S.J.进行了研究；C.S.、L.I.-A.、V.N.和R.S.J.分析数据；C.S.和R.S.J.撰写了这篇论文。
- 补充资料
支持信息
GUID:A049D7E3-8CDF-4EAC-9E60-103209E3EA77
指南：C3D40EDE-503A-4393-9E07-3A7922D16491
摘要
组织损伤会引发一系列复杂的事件，以恢复结构和生理稳态。炎症细胞浸润和血管重塑都是这一过程的关键。然而，炎症和血管生成的一般作用，更具体地说，炎症细胞衍生VEGF在这方面的意义尚不清楚。为了确定炎性细胞衍生VEGF在临床相关和慢性炎症损伤（肺纤维化）中的作用，我们删除了髓系细胞中的VEGF-a基因。在小鼠肺纤维化模型中，骨髓细胞中VEGF的缺失导致血管形成显著减少；然而，它会加重纤维化组织的损伤。伴随着上皮细胞存活率的显著下降和肌成纤维细胞侵袭率的显著增加。受损肺中髓样血管内皮生长因子（VEGF）丢失后，纤维化程度急剧增加，这也表现为低氧诱导因子（HIF）表达水平和Wnt/β-连环蛋白信号水平的增加。这表明由髓系细胞衍生的VEGF驱动的血管生成过程对预防纤维化损伤至关重要。
关键词：血管生成、纤维化、缺氧、炎症
肺损伤引发一系列复杂的愈合反应，通常涉及广泛的炎症(1). 在肺纤维化炎症期浸润肺部的髓样细胞中，巨噬细胞是主要的细胞群，也以其释放大量VEGF的能力而闻名(2). 血管生成，尤其是血管生成因子VEGF的表达在肺纤维化中的意义尚存在争议(三——5)然而。在肺组织中，最近的研究表明，VEGF的传递可以加重肺纤维化，但可以缓解肺动脉高压，这突出了其作用的复杂性(6). 然而，目前尚不清楚血管生成是纤维化发生的先决条件，还是仅仅是一种没有因果关系的旁观者现象，或者它是预防过度纤维化的必要补偿机制(三).
缺氧被认为是一种促纤维化刺激物，以多种方式促进纤维化的发展。细胞缺氧适应的关键介质是低氧诱导因子（HIF），其中HIF-1和HIF-2是研究最广泛的。HIF-1和HIF-2是基本的螺旋环螺旋转录因子，由氧敏感性α亚基和组成性表达的β亚基组成(7). 体外实验表明，慢性缺氧对胶原蛋白合成有强烈刺激作用(8,9)和许多参与细胞外基质重塑和上皮-间充质转化的基因是已知的HIF靶基因(10); 反过来，HIF也被认为参与了组织纤维化的发展(11). 除了调控参与血管生成、氧气输送和葡萄糖代谢的基因外(12)缺氧和HIF已被证明影响Wnt/β-catenin信号(13,14)典型的Wnt/β-catenin途径调节着成纤维细胞增殖、肌成纤维细胞分化和上皮-间充质转化等关键过程，因此是组织纤维化发展的主要途径(5,15——18).
因此，一个关键问题是，由肺损伤炎症驱动的血管生成在多大程度上对这一过程有利或有害，它是否能缓解损伤和损伤后的组织缺氧，以及它是否有助于损伤组织的慢性炎症导致的纤维化。为了解决这些问题，我们使用骨髓系细胞中血管生成因子VEGF-a的组织特异性缺失来确定先天免疫系统细胞表达VEGF-a-如何影响纤维化过程。我们发现髓系细胞表达VEGF-A是内皮细胞修复和再上皮化的一个关键方面，并且在没有血管内皮细胞的情况下，纤维化显著加速。
结果
骨髓细胞中VEGF-A的缺失增加了博莱霉素治疗动物的肺纤维化。
为了更好地确定VEGF在肺损伤和纤维化炎症反应中的作用，我们在髓系细胞中创建了VEGF的靶向缺失。VEGF-A外显子3的两个等位基因均位于loxP位点（VEGF）旁的小鼠+（f）/+（f）) (19)被交叉到由溶菌酶M启动子（LysMCre/VEGF）驱动的Cre重组酶表达背景中+（f）/+（f）) (20). 这导致突变（Mut）小鼠中VEGF基因的组织特异性缺失，80%以上的孤立中性粒细胞或腹腔巨噬细胞被切除(21,22).
在肺部，对损伤的异常愈合反应被认为是肺纤维化的发病机制之一(1). 我们评估了髓系细胞源性VEGF对已建立的引起严重肺纤维化的肺损伤模型中血管重塑和组织修复的影响。静脉注射博莱霉素后，VEGF-Mut小鼠与WT同窝小鼠相比，肺纤维化的组织学症状加重，胶原沉积显著增加(). 为了确定VEGF Mut动物肺纤维化加重的组织病理学征象是否转化为影响肺气体交换的生理相关表型，我们测量了用生理盐水或博莱霉素治疗的WT和VEGF Mut动物在无氧阈值下的摄氧量。与我们的组织学研究结果一致，用博莱霉素治疗的VEGF-Mut小鼠的摄氧量显著降低()进一步表明，这些动物的晚期纤维化改变是阻碍肺泡毛细血管单位内气体交换的主要扩散屏障。
骨髓细胞中VEGF的缺失导致肺损伤后纤维化和胶原沉积增加。(A类)28天后，腹腔注射博莱霉素（10 mg/kg，每周两次）对小鼠肺部进行三色染色。骨髓细胞中缺乏VEGF的Mut小鼠表现出严重的组织病理学纤维化迹象。(B)腹腔注射博莱霉素或用生理盐水治疗28天后，从Mut小鼠和同窝WT小鼠的整个右肺进行胶原蛋白测定(n个= 5–7). (C)耗氧量（VO）评估2)静脉注射博来霉素或用生理盐水治疗21天后，Mut和WT小鼠的无氧阈(n个= 5). 误差条显示SEM。（比例尺：100μm）
多肺组织中肌成纤维细胞形成增加。
肺纤维化的组织病理学特征是受损肺组织中成纤维细胞和肌成纤维细胞大量增加，同时II型肺细胞丢失(1). 我们对成纤维细胞标记物成纤维细胞特异性蛋白-1（FSP）进行了免疫荧光检测()肌成纤维细胞标记物α-平滑肌肌动蛋白（SMA）和II型肺细胞标记物甲状腺转录因子1（TTF-1）()在盐处理和博莱霉素处理（静脉注射）动物的肺切片上。对每个标记物的定量分析显示，VEGF Mut动物与WT同窝动物相比，成纤维细胞和肌成纤维细胞数量增加，II型肺细胞显著减少(). 这些观察结果证实了早期的组织病理学和胶原沉积结果，表明骨髓细胞中缺乏VEGF的动物发生了更迅速和广泛的肺纤维化进展。
骨髓细胞衍生的VEGF的缺失导致肺损伤后成纤维细胞和肌成纤维细胞数量增加，II型肺细胞减少。(A类)静脉注射博莱霉素或用生理盐水治疗28天后，检测Mut和WT小鼠肺中标记FSP阳性的成纤维细胞。(B)静脉注射博来霉素或盐水治疗28天后Mut和WT小鼠肺切片中FSP覆盖像素面积的定量分析(n个= 4). (C)静脉注射博莱霉素或用生理盐水治疗28天后，用特异标记物SMA和TTF-1同时免疫检测Mut和WT小鼠肺中的肌成纤维细胞和II型肺细胞。(D类)静脉注射博来霉素或盐水治疗28天后Mut和WT小鼠肺切片中SMA和TTF-1覆盖像素面积的定量分析(n个= 4). 误差条显示SEM。（比例尺：100μm）
髓细胞中VEGF-A的缺失不会影响浸润。
为了确定髓样细胞中VEGF的缺失是否影响其在损伤后浸润肺组织的能力，我们通过免疫组织化学和流式细胞术分析了博莱霉素治疗的WT和VEGF-Mut动物的髓样细胞群。尽管在每个病例中都观察到髓系（尤其是巨噬细胞）中各种细胞的增加，但在WT和VEGF Mut动物中细胞募集的水平和分布是相似的(图S1). 因此，巨噬细胞迁移到肺组织的能力不受其释放VEGF的能力的显著影响。
创伤后突变株的VEGF-A水平和内皮细胞数量显著降低。
肺纤维化病变经常表现出血管密度的异质性增加，一个现存的重要问题是血管生成因子的释放是否导致纤维化的发展，或者相反，它是否是一种预防更严重纤维化改变的代偿机制(三,5,6). 通过Western Blot分析检测全肺裂解物中的VEGF蛋白，发现与未经治疗的小鼠或博莱霉素治疗的VEGF-Mut小鼠相比，WT小鼠腹腔注射博莱霉素后VEGF水平显著升高(). 后一项观察表明，损伤组织中VEGF的重要来源来自浸润的髓样细胞。这一发现与实体瘤中VEGF来源的定量形成了鲜明对比，在实体瘤中，我们已经表明髓细胞中的VEGF对总组织VEGF水平的贡献微不足道(22). 随着VEGF水平的升高，我们检测到纤维化肺组织中VEGF受体2（VEGFR2）的磷酸化增加，这是通过检测VEGFR2免疫沉淀后的磷酸化酪氨酸残基来评估的；该试验可用于测量受体活化，髓系细胞中VEGF的丢失导致肺部VEGFR2的活化降低().
髓样细胞中VEGF的消融导致VEGF水平降低、VEGFR2磷酸化，并损害纤维化肺的血管生成。(A类)静脉注射博莱霉素或用生理盐水治疗21天后，对VEGF-Mut和同窝WT小鼠的整个左肺裂解液中的VEGF进行免疫印迹。(B)静脉注射博莱霉素或用生理盐水治疗21天后，从Mut和同窝WT小鼠的整个左肺裂解液中免疫沉淀VEGFR2后，进行VEGFR2和磷酸酪氨酸（对-Tyr）的免疫印迹。(C)用光子发射法定量分析静脉注射博莱霉素或生理盐水治疗21天后Mut和WT小鼠整个左肺裂解液中的VEGF信号(n个= 5). (D类)静脉注射博来霉素或用生理盐水治疗21天后，Mut和WT小鼠整个左肺裂解液中对-Tyr与VEGFR2信号的比值作为受体活化的测量(n个= 5). (E类)静脉注射博莱霉素或生理盐水治疗28天后，用标记物CD34在Mut和WT小鼠切片上对肺血管进行免疫检测。(F类)静脉注射博来霉素或盐水治疗28天后Mut和WT小鼠肺切片中CD34覆盖像素面积的定量分析(n个= 4). 误差条显示SEM。（比例尺：100μm）
为了确定VEGF水平和VEGFR2激活的基因型特异性差异是否转化为血管化的改变，我们对治疗和未治疗的肺进行了血管密度分析。如所示博莱霉素（i.p.）对WT小鼠的治疗导致纤维化病灶周围血管密度的不均匀增加和纤维化病灶中心血管稀疏的典型模式。然而，在用博莱霉素（i.p.）治疗的VEGF-Mut小鼠中，血管密度的增加显著降低().
我们假设，WT动物中先前未检测到的血管的形成是一种补偿机制，可以实现组织修复、恢复组织内环境稳定和防止纤维化。有趣的是，缺氧可以诱导或触发许多导致组织纤维化的过程。例如，研究表明肺成纤维细胞在低氧浓度下增殖(23). 缺氧在很大程度上通过HIF发挥作用，也参与了上皮-间充质细胞转化和肌成纤维细胞分化的过程(24). 因此，Mut动物血管生成受损可能导致纤维化病灶内组织灌注和氧气输送不足，从而加速肺纤维化的进展。
创伤后VEGF-Mut动物肺部HIFs和缺氧标记物的表达升高。
对全肺细胞核提取物的分析表明，在经盐处理的动物中，HIF-1α和HIF-2α几乎无法检测到。在博来霉素处理（i.p.）的小鼠中，野生型动物的肺显示出HIF-1α和HIF-2α的显著诱导；然而，VEGF Mut动物肺部HIF两种亚型的核数量进一步增加(). 此外，CD34的同步免疫检测+血管系统、HIF调节酶和低氧标记物碳酸酐酶IX（CA-IX）显示CA-IX在纤维化区域的表达，与WT对照组相比，VEGF-Mut动物的肺中CA-IX的表达更为显著(). 值得注意的是，在纤维化病变中，缺氧和HIF-调节基因CA-IX在毛细血管稀疏区域的表达尤其增强().
骨髓细胞中缺乏VEGF的动物的纤维化肺中HIF的激活增加，Wnt/β-catenin信号增加。(A类)静脉注射博莱霉素或用生理盐水治疗21天后，对VEGF Mut或同窝WT小鼠的整个左肺核提取物中的HIF-1α和HIF-2α进行免疫印迹。(B)用光子发射法定量分析静脉注射博莱霉素或生理盐水治疗21天后Mut和WT小鼠整个左肺核提取物中的HIF-1α信号(n个= 5). (C)用光子发射法定量分析注射博莱霉素或生理盐水治疗21天后Mut和WT小鼠整个左肺核提取物中的HIF-2α信号(n个= 5). (D类)静脉注射博莱霉素或用生理盐水治疗28天后，同时免疫检测Mut和WT小鼠肺切片中的CD34和CA-IX。(E类)腹腔注射博莱霉素或生理盐水治疗21天后，免疫印迹法检测Mut和WT小鼠左肺核提取物中的β-连环蛋白和细胞周期蛋白D1以及左肺细胞质提取物中的E-cadherin。(F类)用光子发射法定量分析静脉注射博莱霉素或生理盐水治疗21天后Mut和WT小鼠整个左肺核提取物中的β-catenin信号(n个= 5). (G公司)用光子发射法定量分析腹腔注射博莱霉素或生理盐水治疗21天后Mut和WT小鼠整个左肺核提取物的cyclin D1信号(n个= 5). (H（H）)腹腔注射博来霉素或用盐水治疗21天后，通过光子发射测量的来自Mut和WT小鼠的整个左肺细胞质提取物的E-钙粘蛋白信号的定量分析(n个= 5).
多动物纤维化肺中Wnt/β-连环蛋白信号的激活增加。
在参与肺纤维化发展的各种信号通路中，Wnt/β-catenin通路被确定为最重要的；它与关键的纤维化过程有关，包括肺成纤维细胞的增殖及其分化为肌成纤维细胞(5,16——18). 也有报道称Wnt/β-catenin信号可以通过缺氧以HIF依赖的方式触发(13,14). 如所示与盐水处理相比，博莱霉素处理的WT小鼠（i.p.）肺细胞核提取物的β-catenin蛋白水平增加，表明β-catentin从细胞质向细胞核的易位增加，这是β-catening信号传导的关键步骤(25,26). 定量分析表明，与WT小鼠相比，博莱霉素治疗（i.p.）VEGF Mut小鼠的肺中β-连环蛋白的核水平显著增加().
Wnt/β-catenin信号通路的主要下游成分cyclin D1的表达也有类似结果(27). 尽管在盐处理动物的核提取物中几乎检测不到细胞周期蛋白D1，但博莱霉素处理（i.p.）WT动物的肺中细胞周期蛋白D_1蛋白水平增加，并且VEGF-Mut小鼠的肺中周期蛋白D_（1）的量进一步显著升高(). 与Wnt/β-catenin信号增强一致，我们观察到VEGF Mut动物肺细胞质部分上皮标记物E-cadherin水平降低().
讨论
在这项研究中，我们发现骨髓细胞中VEGF的特异性缺失会导致纤维化加重和胶原沉积增加，表明炎症细胞衍生的VEGF是肺损伤后血管重塑所必需的，并且这种重塑过程可以恢复组织内环境稳定，防止肺纤维化的发展。
此外，我们报告说，突变体大大降低了受损组织中VEGF的总体水平，VEGFR2的激活减少，血管生成受损。这表明骨髓细胞是肺损伤后和肺纤维化期间VEGF不可或缺的来源。有趣的是，巨噬细胞和II型肺细胞是肺中VEGF的两个主要来源。然而，我们观察到博莱霉素诱导的损伤后II型肺细胞逐渐丢失。这相当于失去了肺中VEGF的一个主要来源，留下髓细胞，尤其是巨噬细胞，作为VEGF剩余的有效来源。一贯地，髓系细胞中VEGF缺失后，我们观察到总体VEGF水平显著下降。
相比之下，以前使用各种方法（包括小分子抑制剂）抑制血管生成，特别是VEGF信号传导的研究报告称肺纤维化减轻(28——30). 值得一提的是，在这些研究中，VEGF抑制的时间点仅限于初始肺损伤的早期事件，或VEGF的抑制作用更广泛地超出了血管生成的抑制作用。此外，这些研究中使用的一些化合物不仅抑制VEGF信号，而且对PDGF受体和基本FGF信号有影响(28).
调和这些结果时需要考虑的一点是Chaudhary等人的研究(28)，抑制剂化合物与博莱霉素同时给药。在肺损伤期间，血管渗漏和凝血级联反应的发生可能是导致炎症和随后纤维化的关键起始事件。因此，在这些实验中，VEGF抑制剂可能通过这种方式抑制早期损伤并预防或减缓肺纤维化；在这种情况下，这种治疗将超过或掩盖VEGF抑制对后续修复过程的影响。在我们的模型中，VEGF的缺失仅限于浸润性髓细胞，因此在最初的肺损伤发挥主要作用后才有效。因此，该模型使我们能够研究VEGF对初始损伤后修复过程的影响，包括再上皮化和再上皮化。
在其他使用沙利度胺的研究中(30)或VEGFR2抑制剂SU5416(29)为了改善肺纤维化，不仅抑制了血管生成，而且抑制了髓细胞的浸润，从而抑制了这些细胞释放各种炎性和促纤维化细胞因子。因此，通过消除肺纤维化发展过程中的炎症阶段，这些结果可能至少有部分偏差。
我们发现，骨髓细胞中特异性VEGF的消融导致肺损伤后肺纤维化加重，表明骨髓细胞衍生VEGF具有保护作用。骨髓细胞分泌VEGF的保护作用可能归因于多种机制。我们发现骨髓细胞中的VEGF失活可阻止肺损伤后血管的形成。然而，WT对照动物中新形成的血管系统可能满足受损组织增加的代谢需求，并使组织修复和恢复体内平衡。尽管修复过程显然不足以完全恢复组织内稳态，即使存在髓系细胞衍生的VEGF，髓系细胞中VEGF失活后加速纤维化的观察强烈证明，髓系细胞VEGF驱动的血管重塑是延缓肺纤维化发展的必要条件。此外，骨髓细胞衍生的VEGF可能是内皮细胞的生存信号，有助于组织结构和稳态的保存。我们观察到，在缺乏髓细胞源性VEGF的情况下，肺损伤后II型肺细胞的丢失显著增加。总的来说，Mut小鼠的肺VEGF水平显著降低，这一发现增加了VEGF本身作为II型肺细胞营养因子的可能性，而II型肺泡细胞是其生存所必需的。
血管供应不足会影响氧气和营养物质向正在修复的组织的输送(31,32). 缺氧已被证明通过HIF介导的转录反应增加胶原蛋白和纤维前因子的生成，如纤溶酶原激活物抑制剂-1、金属蛋白酶组织抑制剂-1和结缔组织生长因子(33——35). 此外，缺氧和TGF-β在成纤维细胞产生某些胶原蛋白方面表现出协同作用(36,37). 在这里，我们观察到用博莱霉素治疗后HIF蛋白、缺氧和HIF调节的标记蛋白CA-IX增加；这种增加在Mut动物中更为明显。有趣的是，已有研究表明，肾细胞中HIF-1的激活是肾纤维化的早期事件，HIF-1α的缺失可防止肾纤维化改变(24). 随着博莱霉素治疗后肺纤维化的发展，我们观察到E-cadherin的下调，这在VEGF-Mut小鼠中更为明显。一些研究报告称，HIF-1和HIF-2是E-cadherin表达的有效抑制因子(38——40). 这表明组织灌注水平降低以及伴随的HIF激活与肺纤维化的发病机制有关。它进一步认为血管生成减少是肺纤维化加重的直接原因。最后，我们的发现与肾脏和肝脏等其他器官的观察结果一致，在这些器官中，血管生成抑制和随后的缺氧促进了纤维化(41,42).
髓系细胞中缺乏VEGF的动物的纤维化肺显示核β-连环蛋白和细胞周期蛋白D1水平升高，后者是Wnt/β-连环素信号通路的主要下游成分(27)表明Wnt/β-catenin信号增加。据报道，缺氧可通过HIF依赖性方式触发Wnt/β-catenin信号传导(13,14)Wnt/β-catenin通路参与肺成纤维细胞增殖和肌成纤维细胞分化的调节(5,16——18). 与这些结果一致，我们观察到来自Mut动物的纤维化肺中肌成纤维细胞数量增加。VEGF Mut动物中观察到的Wnt/β-catenin信号增加可能是这些动物中肌成纤维细胞形成增加的触发因素，通过观察成纤维细胞在缺氧条件下的转分化和常住肺成纤维细胞暴露于缺氧后的持续增殖，这一假设得到了加强(23).
这些数据表明，髓细胞是损伤后VEGF不可或缺的来源，髓细胞衍生VEGF驱动的血管重塑是防止异常纤维化愈合所必需的。尽管这一发现与VEGF表达或抑制更广泛的研究不同，但它与内皮细胞组织特异性VEGF缺失导致肺纤维化的研究结果一致(43)，认为VEGF的组织特异性递送是其在损伤中功能的一个重要方面。反过来，髓系细胞中VEGF的缺失导致血管生成受损，HIF的激活增加，Wnt/β-catenin信号增加。通过Wnt/β-catenin途径增加的信号传导触发肌成纤维细胞的积聚，导致肺纤维化加重。综上所述，这些观察结果表明，骨髓细胞衍生VEGF驱动的血管生成过程是肺组织修复的重要组成部分，因此是纤维化组织损伤的关键抑制剂。
材料和方法
动物。
所有动物都被安置在国际实验动物护理评估和认证协会批准的设施中，动物实验是按照国家卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行的。
通过将VEGF-A外显子3的两个等位基因与loxP位点（VEGF+如果/+（f）) (19)在由LysM启动子驱动的Cre重组酶表达的背景下，该启动子对髓系细胞（LysMCre/VEGF）具有特异性+（f）/+（f）) (20).
诱导肺损伤和纤维化。
对于博莱霉素诱导的肺纤维化，8–12周龄的雌性LysMCre Mut小鼠和WT同窝小鼠经腹腔注射博莱霉素（10 mg/kg，每周两次；钙生物化学）或生理盐水，并在指定的时间点收集肺部。
组织学方面，动物接受PBS/EDTA和4%（wt/vol）多聚甲醛（PFA）的心脏灌注。在取出之前，用4%PFA给肺部充气，然后用4%（wt/vol）PFA固定过夜。或者，将左肺和右肺分离并在液氮中快速冷冻。
组织学、免疫组织化学和免疫荧光。
对于H&E染色、三色染色和免疫染色，用二甲苯将5μm切片脱蜡，并用分级乙醇重新水化。通过在柠檬酸盐缓冲液中煮沸切片10分钟进行抗原提取。切片根据常规免疫组织化学程序进行染色，并通过Vectastain ABC试剂盒（Vector Laboratories）进行可视化。
本研究中使用的主要抗体如下：1:200稀释度的生物素化大鼠抗F4/80抗体（Serotec）、1:200稀释率的大鼠抗CD34抗体（Novus）、1:500稀释度的小鼠抗SMA-α抗体（Chemicon）、1:2000稀释度的兔抗TTF-1抗体（Abcam）、1:20稀释度的兔子抗VEGF抗体（Calbiochem）、兔子抗S100A4抗体（FSP）1:500稀释（Dako）和1:500稀释的兔抗CA-IX（Novus）。荧光结合Alexa 488和Alexa 568（Invitrogen）被用作次级抗体。
组织学标记物的定量分析。
为了定量分析组织内免疫组织化学标记物的分布，使用徕卡DMR显微镜和SPOT RT彩色摄像系统（Diagnostic Instruments，Inc.）将切片拍摄成TIFF图像，并将其面积（像素数）使用Image J程序（国家卫生研究所）测量每个标记标记的面积，并计算为DAPI覆盖面积的百分比。
胶原蛋白测定。
根据制造商的说明，使用Sircol分析（生物色素）对肺胶原蛋白含量进行量化。
厌氧阈值测量时的吸氧量。
未经训练的盐水或博莱霉素处理的WT小鼠和VEGF-Mut小鼠在封闭式模块化跑步机（哥伦布仪器）上运行，气流（O2和CO2)使用Paramax传感器系统（Columbus Instruments）监测跑步机进出室内的情况，并使用Oxymax软件（Columbos Instrument）进行分析。小鼠以15 m/min的初始速度奔跑，速度每2 min增加2 m/min2吸收和CO2监测小鼠的释放，直到达到呼吸交换率≥1的无氧阈值。
免疫沉淀和免疫印迹。
将整个左肺在裂解缓冲液中均质，并按照标准程序进行Western blotting。使用以下抗体：兔抗血管内皮生长因子（Calbiochem）、兔抗HIF-1α（Novus）、山羊抗HIF-2α（R&D Systems）、小鼠抗β-连环蛋白（BD Biosciences）、鼠抗E-cadherin（BD bioscience）和鼠抗β-肌动蛋白（Sigma）。对于VEGFR-2的免疫沉淀，使用500μg裂解液。本研究中使用了以下抗体：兔抗VEGFR-2（Santa Cruz）和HRP-结合抗磷酸酪氨酸（4G10；Millipore）。为了进行定量分析，使用荧光扫描仪扫描膜，并使用ImageQuant软件（GE Healthcare）确定信号强度。
流式细胞术。
取出肺部并切成小块，然后在37°C的摇壶中在RPMI 1640（Invitrogen）中0.1%胶原酶a（Roche）中培养45分钟。在用低渗裂解缓冲液处理并通过70μm细胞过滤器（BD Biosciences）之前，将得到的单细胞悬浮液造粒并在PBS中冲洗。在使用标准方案用荧光偶联抗体标记之前，每个条件下100万个细胞被Fc Block（BD Biosciences）培养。使用FACSCalibur流式细胞仪（BD Biosciences）采集数据，并使用FlowJo软件（Tree Star）进行分析。
统计分析。
使用Prism 4.0软件（GraphPad软件）进行统计分析。统计显著性是由一个不成对的t吨测试。
致谢
我们感谢美国哮喘基金会（V.N和R.S.J.）、德意志基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft Grant）的支持STO 787/1-1; （致C.S.）和格兰特WE 2475/1-1号机组（致A.W.）和美国国立卫生研究院拨款CA82515号（对R.S.J.说）。
工具书类
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