通过胶原受体强制诱导肌成纤维细胞分化依赖于哺乳动物的隔膜（mDia）^*

细胞

人类胚胎肾（HEK-293）细胞或人类牙龈成纤维细胞（HGF；第5-12代）在37°C下在含有10%胎牛血清和1:10稀释的抗生素溶液（0.17%w/v青霉素v、0.1%硫酸庆大霉素和0.01%μg/ml两性霉素）的完整DME培养基中培养。细胞保存在加湿的培养箱中，培养箱中充满95%的空气和5%的CO₂和用0.01%胰蛋白酶（Invitrogen，Burlington，ON）传代。在力实验之前，细胞在含有0.5%血清的DME培养基中培养，用珠培养，并在不同的时间段施加力。

强制应用

如前所述，使用了力生成模型(19,20). 如前所述，磁铁矿2μm直径的磁珠（Spherotech，Lake Forest，IL）涂有胶原蛋白(20)，用磷酸盐缓冲盐水冲洗，贴在培养细胞的背表面。使用陶瓷永磁体（Jobmaster，Mississauga，ON）产生张力（0.6 pN/μm²) (21)垂直于细胞背面。为了将机械感觉事件的检查限制在珠子内化之前的一段时间内（通过FITC-胶原蛋白涂层珠子的台盼蓝淬灭测定），只对细胞施加60分钟的力。

胶原蛋白珠相关蛋白质

将胶原或BSA涂层磁铁矿2μm直径珠（Spherotech）附着到7×10⁶细胞以10:1的珠/细胞比培养30分钟。通过刮取冰镇细胞骨架提取缓冲液（0.5%Triton X-100，50 m）收集细胞和胶原蛋白包裹的磁珠米氯化钠，300米米蔗糖，3米米氯化镁₂pH 6.8），含有蛋白酶抑制剂。BSA涂层珠通过非特异性相互作用附着在细胞上，并允许比较与广泛膜蛋白相关的蛋白质与与β1整合素相关的蛋白质(22,——24). 用侧拉磁铁将珠从细胞裂解液中分离出来。用样品缓冲液从珠子中去除珠子相关蛋白，进行定量（通过BCA分析），在SDS-PAGE凝胶上分离，并对指定的特定蛋白进行免疫印迹。

免疫荧光和共焦显微镜

将细胞贴在珠子上，使其扩散并与胶原珠结合30分钟。细胞用3%甲醛固定在PBS中，用0.2%Triton X-100渗透，然后用适当的一级抗体染色，然后用FITC或罗丹明标记的二级抗体染色。通过共焦显微镜（Leica，Heidelberg，Germany；40×，1.4数字孔径油浸透镜）测定珠子周围蛋白质染色的空间分布。获得了标称厚度为1-μm的横向光学截面。

siRNA敲除

使用以下序列的siRNAs（Dharmacon）对人类mDia和gelsolin进行特异性抑制：mDia(25)-5′-AAGGCAGACCACACUCU-3′，5′-AGGAAGUGGCUCUUUU-3′；凝胶蛋白(26)-5′-GCAUCGGUAUGAGACUU，3′-AGUCUUUCAUACCUUU-3′。从Silencer®Select验证的siRNA（Ambion）中获得对人ROCK1的抑制，序列如下：5′-CGUUAGAACAGAGUAAUU-3′，5′-UUACCUCUUUUCUAACCUU-3′。用基因特异性siRNA转染细胞（200 n米)或使用DharmaFECT转染试剂2以GFP（Dharmacon）为靶点的阴性对照siRNA转染48小时。如果实验中还需要转染cDNA结构，则siRNA转导总共72小时。细胞在磷酸盐缓冲液中洗涤，用Laemmli缓冲液溶解，并进行免疫印迹以评估siRNA依赖性敲除的疗效。转染后和力实验前，将细胞在含有0.5%血清的DME培养基中孵育。

转染和萤光素酶启动子研究

用765碱基对的大鼠SMA荧光素酶构建物（科罗拉多大学丹佛分校Raphael Nemenoff）或SRF报告子（p3D·ALuc）荧光素酶构建物转染细胞(27)并与β-半乳糖苷酶构建物联合转染，作为对照，以使转染效率的变化正常化。根据制造商的说明，使用FuGENE 6（罗氏应用科学公司）进行转染。在最初36 h内，将细胞与正常生长培养基（DME培养基中的5%血清）孵育，然后在血清减少条件下（DME培养液中的0.5%血清）培养过夜。转染24小时后，用胶原蛋白包衣珠负载细胞，并在特定时间段内施加磁力。收集细胞，并按所述测定荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性(28). 将转染数据计算为与标准化为β-半乳糖苷酶活性的基础启动子活性相比的倍数变化。

α-SMA的转录激活

肌动蛋白聚合需要将肌动蛋白单体组装成细丝，这是一个从肌动蛋白单体释放肌动蛋白相关转录因子-a（MRTF-a）并使MRTF迁移到细胞核以调节转录的过程(18). 张力作用于成纤维细胞触发肌动蛋白组装和胞质MRTF-A核移位(10)，然后可以调节血清反应元件（SRE）调节的基因表达(28). 我们检测了强制诱导MRTF-A易位是否需要mDia。在内源性MRTF-A免疫染色的人牙龈成纤维细胞中，免疫荧光图像显示强制作用后MRTF-A的核易位(图2A类). MRTF-A核质或细胞质定位细胞百分比的量化显示，在转染不相关（绿色荧光蛋白）siRNA作为阴性对照的细胞中，用力60分钟后，MRTF-A-核移位细胞百分比增加了3.5倍(第页< 0.01). 相比之下，用siRNA敲低mDia处理的细胞，强制诱导MRTF-A核移位的细胞百分比没有变化(图2B类,第页> 0.2).

在单独的窗口中打开

图2。

强制诱导的MRTF-A核易位依赖于mDia。 A类免疫荧光图像显示了用无关或mDia siRNA处理的细胞中MRTF-A的核移位状态，用胶原蛋白包被的磁珠培养，然后施加或不施加力。这个白色箭头显示细胞核中存在MRTF-A。用DAPI染色细胞以显示细胞核(蓝色)和MRTF-A免疫染色(绿色)和mDia(红色).B类力作用60min后进行免疫荧光图像定量。数据为显示MRTF-A核移位的细胞百分比的平均值±S.E。在每个实验组中，对25个细胞进行定量。

机械力诱导的MRTF-A核移位不足以介导SRE调节的基因表达(30). MRTF-A还需要与其他转录共激活物相关，尤其是血清反应因子（SRF）(18). 为了确定力是否改变了这种机械传导模型中SRF的表达，我们进行了时间进程实验，其中细胞与SRF报告基因（3D.a；荧光素酶读数）和lacZ公司构造，然后施加力。这个SRF报告子包含来自肌动蛋白启动子的“D”结合位点的三个拷贝，并且只对肌动蛋白/MRTF通路作出反应(27). 对胶原包被的珠子施加力2小时导致SRF启动子活性增加3.5倍(第页<0.02）。在用siRNA预处理以敲低mDia的细胞中，用力2小时后，用力诱导的SRF-reporter活性降低了33%(第页<0.02）与正常mDia水平的力加载细胞相比(图3B类). 利用突变型mDia研究了mDia对SRF表达的潜在调节(13). 用DN-mDia构建物转染的细胞没有表现出强制诱导的SRF报告活性增加，并且基线表达低于未处理细胞。然而，用组成活性（CA）-mDia构建物转染细胞，与未转染细胞中的用力作用相比，在用力作用或不用力作用的细胞中，SRF报告活性提高了2.7倍。

在单独的窗口中打开

图3。

力诱导SRF激活需要mDia。 A类，在NIH 3T3细胞中测量了标准化为β-半乳糖苷酶的力诱导的SRF萤光素酶启动子活性。在一个时间过程中（1至4小时）用力刺激细胞。与基本启动子活性相比，启动子活性表现为折叠变化。B类在转染mDia siRNA、DN-mDia、CA-mDia或载体对照的细胞中施加力2小时后，测量SRF启动子活性。

SRF和MRTF-A可以上调SRE调节基因的转录活性，包括SMA(10,31). 由于上述数据表明，mDia可以影响强制诱导的MRTF-A核移位，我们检测了mDia对强制诱导的SMA启动子活性的影响。用SMA-核糖核酸酶启动子构建物转染细胞并用siRNA mDia处理后，细胞没有明显增强(第页>0.2）力诱导的SMA启动子活性，但用无关siRNA处理的细胞增加了1.75倍(第页< 0.02,图4A类). 同样，在转染DN-mDia的细胞中，力诱导的SMA启动子活性没有增加。与基线水平相比，CA mDia的转染导致SMA启动子活性增加9倍，这在使用或不使用武力的细胞中是无法区分的。

在单独的窗口中打开

图4。

力诱导的SMA激活依赖于mDia。 A类，在NIH 3T3细胞中施加4 h力后，测量归一化为β-半乳糖苷酶的力诱导SMA-淀粉酶启动子活性。用mDia siRNA、DN mDia或CA mDia处理细胞。B类，共聚焦细胞图像(F类)或不带(法国试验标准)施力4小时后，在单个胶原蛋白包被珠周围显示mDia与FITC-结合抗体和SMA与TRITC-结合抗体的染色。相同细胞的DIC图像显示珠子的位置。注意，用mDia的siRNA处理的细胞没有检测到mDia。

通过免疫染色和共焦显微镜，我们评估了施力后mDia和SMA在胶原珠处的空间定位。施力4小时后，mDia和SMA在胶原涂层珠上的定位增强，这与诸如mDia之类的formins可能在局部粘连中充当近端机械传感器的概念一致(9,15)在未经强制处理的细胞中，mDia引起的荧光强度几乎没有变化(图4B类)在用mDia-siRNA处理的细胞中，珠状物周围的SMA积累很少。

mDia在SMA表达中的相对贡献

除了上述mDia对强制诱导的SMA转录的影响外，先前的研究还确定了gelsolin和ROCK在调节SMA表达中的作用(8,10). 为了确定这些途径中每一条对强制诱导的SMA表达的相对贡献，我们比较了降低gelsolin、ROCK和mDia的表达对强制诱导SMA启动子活性的影响。在用siRNA预处理以击倒gelsolin、ROCK或mDia的细胞中，与含有无关siRNA的强制加载细胞相比，强制诱导的SMA启动子活性分别降低了60、68和80%(图5A类). 在双siRNA敲除后，gelsolin和Rho激酶的siRNA联合敲除导致SMA启动子活性额外（75%）降低。

在单独的窗口中打开

图5。

gelsolin、ROCK和mDia通路在SMA表达中的相对贡献。 A类用siRNA预处理NIH 3T3细胞以击倒gelsolin、ROCK或mDia。施加力4小时后，测量归一化为β-半乳糖苷酶的力诱导SMA-淀粉酶启动子活性。免疫印迹显示以GAPDH作为负荷控制物敲除gelsolin、ROCK和mDia的效果。B类，测量细胞中MRTF-A的核移位。在细胞中施加或不施加siRNA击倒gelsolin、ROCK和mDia的力60分钟后，对免疫荧光图像进行量化。对细胞进行MRTF-A染色(绿色)用DAPI识别细胞核的位置(蓝色). 数据为每个实验组25个细胞中MRTF-A核易位细胞的平均±S.E.百分比。

由于张力介导的MRTF-A核转位是SMA启动子激活所必需的，我们比较了凝胶蛋白、ROCK和mDia对力诱导的MRTF-A核转位的影响。定量内源性MRTF-A免疫染色的固定细胞表明，凝胶蛋白、ROCK和mDia-siRNA敲除抑制了强制诱导的MRTF-A-核移位(图5B类). 然而，三个治疗组之间MRTF-A核易位的减少量没有显著差异(第页> 0.2).