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生物化学杂志。2010年3月12日；285(11): 8218–8226.
2010年1月6日在线发布。 数字对象标识：10.1074/jbc。M10.1000792
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PMID：20053993

c-Jun诱导乳腺上皮细胞侵袭和乳腺癌干细胞扩增*保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg

玄毛角,‡ 桑杰·卡蒂亚尔,‡ 尼科尔·威尔马思（Nicole E.Willmarth）,‡ 刘满然,‡ 马晓静,§ 尼尔·弗洛门伯格, 迈克尔·利桑蒂,‡和理查德·佩斯特尔‡¶,1
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摘要

乳腺癌细胞自我更新的分子机制有助于乳腺癌的进展和治疗抵抗。ErbB2癌基因在约30%的人类乳腺癌中过度表达。c-Jun是第一个细胞原癌基因，在人类乳腺癌中过度表达。然而，内源性c-Jun在乳腺肿瘤进展中的作用尚不清楚。在此，表达乳腺靶向ErbB2癌基因的转基因小鼠与c-六月飞行/飞行转基因小鼠检测内源性c-Jun在乳腺肿瘤侵袭和干细胞功能中的作用。c的切除-六月通过Cre重组酶减少ErbB2诱导的乳腺肿瘤的细胞迁移、侵袭和乳腺形成。蛋白质组分析确定了ErbB2表达诱导的分泌蛋白子集（干细胞因子（SCF）和CCL5），这些分泌蛋白依赖于内源性c-Jun表达。SCF和CCL5被鉴定为c-Jun转录诱导的。CCL5挽救了c-Jun缺陷乳腺癌细胞侵袭表型。SCF拯救了c-Jun不足的乳房生产。因此，内源性c-Jun有助于ErbB2诱导的乳腺肿瘤细胞侵袭和自我更新。

关键词：乳腺癌，细胞迁移，趋化因子，细胞因子，Jun转录因子，干细胞

介绍

控制癌细胞侵袭表型的机制目前被认为涉及细胞基因组的改变有助于侵袭表型的自主变化，或者涉及非细胞自主机制，其中异型旁分泌信号可能决定肿瘤的转移行为(1,2). 在这方面，已知来自肿瘤相关基质微环境中间充质细胞的异型信号可促进肿瘤生长和侵袭性(三). 另一种假设认为，肿瘤可能通过自我播种的过程生长和侵袭，这一过程是通过肿瘤前沿自我更新的细胞群（称为肿瘤干细胞）的扩张实现的(4,5).

c-Jun已在乳腺癌的侵袭前沿被发现，并与微血管密度增加相关(6). c-六月癌基因编码激活蛋白-1（AP-1）转录因子家族的一个成员，该转录因子家族通过亮氨酸拉链基序与Jun、Fos、激活转录因子（ATF）和Maf家族成员异源二聚体(7). c-Jun丰度的诱导调节参与细胞生长、增殖和发育过程的下游靶基因的活性(8). 丝裂原活化蛋白激酶的c-Jun N末端激酶亚群对c-Jun的磷酸化作用以细胞类型特异性的方式促进细胞凋亡并调节细胞迁移(9).

c-Jun的角色分析体内需要使用携带floxed c的转基因动物-六月等位基因（c-六月飞行/飞行)其中c-六月基因两侧有lox P位点，如c-六月−/−妊娠期间，小鼠死于心血管和肝脏缺陷(10). 小鼠胚胎成纤维细胞分析2派生自c-六月−/−或c-六月飞行/飞行小鼠确定c-Jun在调节表皮生长因子受体表达、细胞增殖和迁移中的作用(11,12). c（c）-六月−/−由于p53/p21的诱导，MEF发生与增殖缺陷相关的早衰CIP1级(13,14). 尽管在组织培养实验中，转化的乳腺上皮细胞中显性阴性c-Jun或野生型c-Jun的过度表达表明c-Jun在促进乳腺癌细胞增殖中的重要性(15)，内源性c-Jun在乳腺上皮细胞侵袭和祖细胞扩张中的作用之前尚不清楚。

上皮干细胞在乳腺肿瘤生长和侵袭中的潜在作用至关重要(1,5). 干细胞因子（SCF）通过其受体c-Kit调节造血干细胞增殖和迁移(16). SCF以可溶性形式分泌，并作为膜相关糖蛋白。配体结合诱导二聚化后激活的细胞内激酶包括c-Kit的反磷酸化，c-Kit是一种III型受体酪氨酸激酶(17)，但其他细胞因子和生长因子也可能有助于细胞迁移(18). CCL5表达与乳腺癌预后不良相关(19,20)已知可诱导基质金属蛋白酶的表达，从而增强细胞侵袭力(21). 母乳中含有高浓度的CCL5(22)CCL5由人类肿瘤产生(23,24). CCL5通过三个G蛋白偶联受体CCR1、CCR3和CCR5发挥作用，其中CCR5是MDA-MB-231细胞中CCL5的主要受体(25). 控制CCR5表达的分子机制及其在肿瘤发生中的作用尚不清楚。

鉴于临床研究显示c-Jun在人类乳腺癌中过度表达及其在乳腺肿瘤前沿的分布(6)，我们检测了内源性c-Jun在乳腺上皮细胞迁移中的作用及其在乳腺肿瘤细胞迁移、侵袭和干细胞扩增中的作用。利用表达MMTV-ErbB2的转基因小鼠与c-六月飞行/飞行，我们表明内源性c-Jun在ErbB2诱导的乳腺上皮细胞迁移和侵袭中起着关键作用。c-Jun通过基因启动子的转录激活诱导SCF和CCL5的丰度。c-Jun介导的SCF和CCL5诱导促进了自我更新乳腺上皮细胞群的扩大，并促进了细胞侵袭性。因此，c-Jun通过产生CCL5和SCF来调节乳腺肿瘤干细胞自我更新群体的扩大，以增强肿瘤侵袭力。

实验程序

转基因小鼠、表达质粒和启动子克隆

携带floxed c的转基因动物-六月等位基因，c-六月飞行/飞行，并且先前描述了MMTV-ErbB2转基因小鼠(12,26,27). 托马斯·杰斐逊大学动物护理和使用委员会（IACUC）批准了使用这些小鼠进行的所有实验程序。乳腺上皮细胞（MEC）的衍生和培养方法(28)和乳腺肿瘤细胞系(29)如前所述。

先前描述了编码腺病毒导向Cre（Ad-Cre）表达或控制病毒（Ad-null）表达的表达质粒(11). 通过将来自载体pMC-Cre-PGK-Hyg（来自P.Stanley博士）的cDNA作为EcoRI片段插入逆转录病毒表达质粒pMSCV-IRES-GFP，克隆了编码Cre的逆转录病毒的表达质粒(30). 使用针对Cre（MMS-106）的抗体通过Western blot证实pMSCV-IRES-GFP载体中Cre的表达(12). 大鼠c-Jun DNA的EcoRI片段(31)将其亚克隆到逆转录病毒表达载体MSCV-IRES-GFP中，形成MSCV-c-Jun-IRES-GFP。老鼠SCF公司通过从kit配体的5′-侧翼区域扩增2-kb片段克隆启动子(基特尔)基因插入pGL3-碱性荧光素酶报告载体SmaI位点(11). 之前描述过CCL5荧光素酶报告子(11).

试剂和抗体

SCF来自Peprotech Inc.（新泽西州落基山）。CCL5来自研发系统公司（明尼苏达州明尼阿波利斯）。抗c-Jun（H-79）兔多克隆抗体来自Santa Cruz Biotechnology（加州圣克鲁斯）。抗帕西林（5H11，05-417）小鼠单克隆抗体来自Millipore（Billerica，MA）。抗磷-帕西林（Tyr-118，44-722G）兔多克隆抗体来自BIOSOURCE（加利福尼亚州卡马里洛）。抗GDI兔多克隆抗体来自RTG Sol（马里兰州盖瑟斯堡）。罗丹明-球蛋白和4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚来自Sigma-Aldrich。BODIPY 650/665-指骨苷来自Molecular Probes Inc.（俄勒冈州尤金市）。

细胞培养、病毒细胞转导和报告基因检测

将细胞保存在补充有10%胎牛血清、100μg/ml青霉素和链霉素、4μg/ml胰岛素、10 ng/ml表皮生长因子、10 ng/ml霍乱毒素、1μg/ml氢化可的松的Ham’s F12中，并在5%CO中培养237°C时。如前所述进行哺乳动物培养(32). 如前所述，使用ALDEFLOUR分析和Sca-1染色测定醛脱氢酶（ALDH）活性(33,34). 之前描述过腺病毒的传播(35). 感染是在20倍的感染下进行的，细胞培养过夜，在实验分析之前更换培养基。逆转录病毒感染按说明进行(35). 使用GeneJuice转染试剂（EMD Biosciences，San Diego，CA）和Lipofectamine（Invitrogen）进行转染(36). 使用学生的t吨测试。

F-actin定量的显微镜和磷灰石染色

在6孔板中检测免疫阳性MSCV-IRES-GFP-和MSCV-Cre-IRES-GFP-转导的细胞。使用蔡司LSM 510 Meta激光共焦扫描显微镜的×20和×40物镜进行相位对比和荧光成像。如前所述进行罗丹明-球蛋白F-actin染色(30).

细胞粘附测定

96-well细胞表面基质涂层条状微孔组织培养板（无涂层，牛血清白蛋白，聚乙烯-我-赖氨酸、I型胶原、IV型胶原、纤维连接蛋白和层粘连蛋白）用于细胞粘附分析。在每个涂层孔的底部播种等量的细胞，并通过在37°C、5%CO的温度下培养平板使其粘附2计划间隔。含贴壁细胞的板条孔在1小时后取出，在1%戊二醛中固定10分钟，并用0.1%结晶紫染色30分钟。在磷酸盐缓冲盐水洗涤后，向每个孔中添加100μl 0.5%Triton X-100，通过在室温下轻轻摇晃培养板过夜来溶解细胞并提取染料。通过测量595nm处的吸光度，对提取的染料进行定量。对于每个细胞表面基质，从一个没有细胞植入的涂层孔中观察到背景。

细胞运动、迁移和侵袭的检测

将细胞置于塑料皿上，在含有10%胎牛血清、青霉素和链霉素各100μg/ml、4μg/ml胰岛素、10 ng/ml表皮生长因子、10 ng/ml霍乱毒素、1μg/ml氢化可的松的Ham’s F12培养基中培养过夜。使用蔡司倒置显微镜监测细胞运动。用CCD摄像机（2400型）按计划间隔采集视频图像，进行数字化，并使用MetaMorph 3.5软件将其存储为图像(38). 追踪细胞核的位置以量化细胞运动。使用MetaMorph软件以微米为单位计算细胞速度。在检查对细胞运动的影响之前，进行了3小时的分析。从起点到终点每20分钟测量一次净位移。每个点至少收集100个细胞的数据。

如前所述，使用Boyden室测定细胞在膜上的迁移(28,39). 通过向下腔添加CCL5（RANTES（调节激活正常T细胞表达和分泌））（浓度为10 ng/ml）或SCF（0.5 ng/ml），形成CCL5或SCF梯度。

三维侵入试验

三维侵入试验改编自小瓶等。(40). 简单地说，在24孔8-μm孔Transwell（Corning）的顶室中用吸液管吸取100μl 1.67 mg/ml鼠尾I型胶原（BD Biosciences）。将Transwell在37°C下培养过夜，使胶原蛋白凝固。然后将30000个细胞接种在Transwell膜的底部并允许其附着。无血清培养基放置在底部培养箱中，而5%的血清用作上部培养箱中的化学引诱剂。然后通过上述胶原将细胞化学吸引通过过滤器3天。将细胞固定在4%甲醛中，用0.2%Triton-X在磷酸盐缓冲盐水中渗透，然后用40μg/μl碘化丙啶染色2h。荧光分析采用共聚焦显微镜z（z）-从滤光片底部放大×10倍的截面（每4μm一个截面）。使用卡尔蔡司ZEN软件（2007 Light Edition）对碘化丙啶染色细胞进行三维重建。

细胞因子阵列分析

硝酸纤维素膜上发现的小鼠细胞因子阵列来自RayBiotech（Norcross，GA）。来自c的条件培养基-六月飞行/飞行或c-六月−/−通过在无血清火腿F12中培养细胞24–48小时来制备细胞。然后根据制造商的说明处理膜，以评估条件培养基中存在的分泌细胞因子和生长因子。

实时PCR和ELISA

所有基于凝胶的PCR和RT-PCR均使用Ex-Taq DNA聚合酶试剂盒（日本志贺县Takara Shuzo），使用中提到的寡核苷酸引物进行表1使用标准的异硫氰酸胍法提取RNA，RQ1-DNA酶I（Promega，Madison，WI）处理，并提取苯酚-氯仿。RNA定量在安捷伦2100生物分析仪（安捷伦科技，加利福尼亚州帕洛阿尔托）中进行，等量用于反转录反应。所有基因的引物都是使用Primer Express 5.1（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）设计的(表1)或参考文献。41.

表1

用于PCR、RT-PCR和实时定量RT-PCR分析的寡核苷酸引物列表(41)

基因方向序列5′→3′
c（c）-六月基因分型福沃德CTC ATA CCA GTT CGC ACA GGC GGC
反向CCG CTA GCA CTC ACG TTG GTA GGC
反向CAG GGC GTT GTG TCA CTG AGC T公司
RPL-19（DNA PCR）福沃德AAT GCT CGG ATG CCT GAG AA
反向CTC CAT GAG GAT GCG CTT GT公司
Cre重组酶福沃德TGC TCT GTC CGT TTG CCG公司
反向ATC GTG TCC AGA CCA GGC
RPL-19（用于RT-PCR）福沃德CTGAAGGTCAAAGGAATGTG公司
反向GGAGAGTCTTGATGATCTC公司
c（c）-六月（用于RT-PCR）福沃德AGA GCG GTG CCT ACG GCT ACA GTA A公司
反向CGA CGT GAG AAG GTC CGA GTT CTT G
18S rRNA福沃德AGGAATTCCCAGTAAGTGCG公司
反向GCCTCACTAAAACCATCCAA公司

对于ELISA，细胞接种在80%的汇流处，24小时后将生长培养基更换为含有0.1%牛血清白蛋白的基础培养基，并用磷酸盐缓冲盐水洗涤。48h后，收集条件培养基，以2000rpm离心5min，然后通过0.45μm膜过滤器过滤，获得上清液。根据制造商的建议，使用小鼠SCF和CCL5 ELISA试剂盒（RayBiotech）测量条件培养基中的SCF和CC L5，一式三份，并根据每个样本培养基中总蛋白水平进行归一化。实验至少进行了三次。

FACS分析

细胞标记和FACS分析基于参考文献。34,42，以及43经过修改。标记前，用正常大鼠IgG（1/100）和纯化大鼠抗鼠FcγIII/II受体抗体（1/100，克隆2.4G2，BD Pharmingen）封闭细胞30分钟，然后用藻红蛋白标记的大鼠抗小鼠CD24（1/50）（克隆M1/69，BD Farmingen）、Sca-1（1/50，和/或藻红蛋白/Cy5标记的大鼠抗人/小鼠CD44（1/50）（克隆IM7，BioLegend，加州圣地亚哥）1小时。所有实验均在4°C下进行。细胞分选在FACSCalibur细胞分选机（BD Biosciences）上进行。使用FlowJo软件（Tree Star，Inc.，Ashland，OR）对数据进行分析。

结果

内源性c-Jun促进编码c-Jun的双转基因小鼠中哺乳动物肿瘤细胞迁移方向性和速度的持久性飞行/飞行

c-Jun和JNK促进成纤维细胞迁移(9,11,12). 为了确定内源性c-Jun在肿瘤诱导的MEC细胞迁移和侵袭中的作用，将表达乳腺靶向ErbB2（MMTV-ErbB2）的转基因小鼠与c-六月飞行/飞行老鼠。MEC和乳腺上皮细胞肿瘤（MET）来源于这些小鼠的后代。对乳腺肿瘤衍生的上皮细胞系进行培养，并用腺病毒载体或表达Cre重组酶的载体进行处理(图1A类). c组c-Jun丰度降低-六月飞行/飞行经Ad-Cre处理的MET(图1B类). 删除了个单元格（共个）-六月相控显微镜显示扩散更大(图1C类和补充图1A类). 添加表达Cre的腺病毒导致出现600-bp片段，反映了切除的c-六月等位基因(补充图1B类).

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内源性c-Jun决定乳腺上皮性肿瘤细胞迁移速度。 A类，MMTV-ErbB2-c实验协议的示意图-六月飞行/飞行对双转基因小鼠肿瘤进行分析。B类，c的Western blot分析-六月飞行/飞行METs显示经Ad-Cre转导后c-Jun丰度降低。C类，来自c的乳腺上皮肿瘤细胞-六月飞行/飞行用Ad-Cre或Ad-null转导的细胞在伤口愈合试验中进行评估(B类).D类，c的视频显微镜-六月飞行/飞行或c-六月−/−细胞。E类利用视频显微镜数据测定MET细胞的细胞速度。误差线注明S.E。

然后用视频显微镜检查表达c-Jun或c-Jun缺失的乳腺上皮细胞的迁移特性。当c-六月+/+细胞迁移到伤口，c区迁移减少61.5%-六月−/−单元格(图1C类). 用视频显微镜比较表达或缺失c-Jun的乳腺上皮细胞。细胞迁移速度由视频显微镜测定，至少包括50个细胞(图1D类). c-Jun切除与接种后8-12小时细胞迁移速度降低71.5%有关(图1E类).

乳腺上皮肿瘤细胞c-Jun促进细胞侵袭

分析扩散的细胞表型，包括F-actin染色。来自c的MEC-六月飞行/飞行用免疫组织化学染色法对磷酸-帕西林进行局部粘连染色(黄色). 用4′，6′-二氨基-2-苯吲哚染色鉴定细胞核蓝色(图2A类). c-Jun缺失的细胞显示病灶接触呈向心分布。细胞直径增加，形态更为分散。F-肌动蛋白染色显示在c-六月+/+乳腺肿瘤细胞；然而，在c中-六月−/−MEC F-actin呈向心分布，与焦点接触染色的向心分布一致(图2A类).

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c-Jun减少乳腺上皮细胞粘附并增强侵袭性。 A类焦点接触的共焦显微镜（酪氨酸磷酸化帕西林黄色的，细胞核标记为4′，6′-二氨基-2-苯吲哚蓝色). 应力纤维的形成是由细胞中F-肌动蛋白的分布来界定的。注：焦点接触点以白色显示。B类，细胞粘附分析比较c-六月+/+和c-六月−/−细胞被镀在不同的基底上。不，非单元格；英国标准协会，牛血清白蛋白。C类和D类，对c进行了入侵检测-六月+/+和c-六月−/−遇见。指示活动侵入体的孔如所示黑色孔面积显示为平均值±S.En个=10个单独的图像。

在不同的表面上测定细胞粘附，以研究整合素参与细胞粘附的作用。ErbB2-c-六月飞行/飞行比较不同表面上的肿瘤衍生细胞。c的粘附力-六月−/−I型胶原和IV型胶原的MET增加，但纤维连接蛋白、聚-我-赖氨酸或层粘连蛋白。为了确定ErbB2乳腺肿瘤细胞浸润与c-Jun依赖的部位，进行了吞噬试验(图2C类). 侵袭面积用明胶中的孔来量化，以每细胞平方微米（μm）为单位2/单元格）。删除c-六月与红色荧光基质吞噬功能降低有关(图2C类)与细胞侵袭性降低相一致。

为了进一步研究内源性c-Jun在乳腺肿瘤细胞侵袭性中的作用，我们进行了Matrigel侵袭试验。对6个人类乳腺癌细胞系进行了Western blot分析(图3A类). HS578T和MDA-MB-231细胞中c-Jun的相对丰度更大。基质侵袭试验表明HS578T和MDA-MB-231细胞系的侵袭性更强(图3B类)在总共六个被检测的乳腺癌细胞系中。为了确定内源性c-Jun在基质胶侵袭中的作用，用扰乱的对照小干扰RNA或针对c-Jun的小干扰RNA处理HS578T细胞(图3C类). 相控显微镜下c-Jun蛋白丰度的减少与极化程度较低的形态有关(图3D类)减少了Matrigel的入侵(图3,E类和F类).

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内源性c-Jun促进乳腺肿瘤细胞侵袭。 A类，用所示抗体对人类乳腺癌细胞系进行Western blot。B类，三维Matrigel侵袭试验，其中侵袭细胞显示为红色向上表面迁移。C–F类c-Jun小干扰RNA处理HS578T细胞的Western blot(小干扰RNA) (C类)并通过相控显微镜进行形态评估(D类)或细胞侵袭的三维重建(E类)显示为相对侵袭的平均值±S.E.数据(F类).

c-Jun诱导CCL5和SCF表达

先前对来源于c的成纤维细胞进行的研究-六月−/−MEF显示，通过添加野生型成纤维细胞分泌的细胞因子，细胞迁移减少(11). 为了进一步研究c-Jun缺陷的ErbB2乳腺肿瘤细胞系中细胞迁移表型减少的机制，ErbB2-c的上清液-六月+/+细胞用于评估c-Jun介导的乳腺上皮肿瘤细胞迁移是否通过分泌因子(图4A类). 条件培养基(上清液)来自ErbB2-c-六月+/+细胞挽救了ErbB2-c的迁移缺陷-六月−/−细胞。为了确定控制c-Jun介导的细胞迁移的候选分泌蛋白，使用细胞因子阵列进行无偏见的蛋白质组分析。虽然乳腺癌细胞分泌的大多数细胞因子和趋化因子在野生型和c型之间保持不变-六月−/−c-Jun缺失后，MET细胞、细胞因子和趋化因子亚群发生改变(图4B类和补充图3). CCL5和SCF在c-六月删除(图4B类和数据未显示）。进一步分析以量化CCL5的相对表达和分泌。c的切除-六月与MET细胞分泌的CCL5丰度减少79%有关(图4C类). 定量PCR检测CCL5 mRNA丰度降低92.5%(图4D类).

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内源性c-Jun诱导CCL5和SCF。 A类MET在条件培养基作用下的跨井迁移(上清液)来自MET（c-六月+/+)或MET（c-六月−/−). 数据为平均值±S.E。B类，来源于c的ErbB2 MET分泌的蛋白的细胞因子阵列-六月+/+和c-六月−/−老鼠(n个= 2). 细胞因子和趋化因子相对丰度的关键差异确定了SCF和CCL5。定量分析如所示补充图3.C类，ELISA定量ErbB2乳腺肿瘤细胞分泌的CCL5的相对丰度(n个=6（对于c）-六月+/+和n个=9（对于c）-六月−/−).D类，定量PCR测定的CCL5相对mRNA丰度显示为平均值±S.En个= 4.E类，针对CCL5的添加进行Transwell迁移分析。F类，CCL5启动子的活性与荧光素酶报告基因相关。荧光素酶活性标准化为联合转染的β-半乳糖苷酶报告基因和荧光素素酶报告控制载体。数据为三次单独转染的平均值±S.E。

为了确定CCL5和SCF对乳腺上皮性肿瘤细胞迁移的贡献，进行了Transwell迁移分析。比较了c-六月飞行/飞行和c-六月−/−遇见。c迁移中的缺陷-六月−/−MET通过添加CCL5获救(图4E类). 将SCF添加到c-六月−/−MEC对c的迁移缺陷没有影响-六月−/−MET电池（数据未显示）。

为了确定内源性c-Jun是否诱导CCL5，评估了与荧光素酶报告基因相连的CCL5启动子。通过对比c-六月飞行/飞行和c-六月−/−3T3成纤维细胞(图4F类). 当按照转染效率标准化时，CCL5启动子活性因缺乏内源性c-Jun而降低93%(图4F类).

c-Jun介导的接触依赖性MET细胞生长通过c-Jun发生，但不影响增殖指数

为了确定c-Jun在决定细胞生长和更新的关键特性中的作用，进一步检测了MMTV-ErbB2肿瘤的乳腺上皮细胞。用Ad-Cre或对照载体（Ad-null）处理MMTV-ErbB2-MEC细胞系（MET），并使用一450以及细胞计数。增殖率在第1天和第5天没有变化(补充图2A类). 增殖标记Ki-67的丰度没有显著降低(补充图2，B类和C类). 相比之下，内源性c-Jun增强了接触依赖性生长，因为MEC野生型菌落大小增加了～2倍，使用菌落形成分析进行了评估(补充图1C类).

内源性c-Jun促进乳腺上皮肿瘤细胞自我更新

通过自我更新扩大细胞数量可能有助于肿瘤生长(1,5). 鉴于与c-Jun促进的生长优势相关的增殖指数无显著变化，我们研究了内源性c-Jun可能促进乳腺上皮祖细胞扩张的可能性。对MMTV-ErbB2衍生的MET细胞进行哺乳动物分析。METc生产的乳房球数量也相应减少-六月+/+与c相比-六月−/−(图5A类).

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c-Jun促进乳腺上皮性肿瘤干细胞扩增。 A类乳腺癌细胞系ErbB2的产生-六月+/+使用c-六月−/−.B类，CD24的比例−/CD44细胞+细胞通过FACS分析确定，并用作MEC祖细胞的替代标记。比较显示了在正常或乳房培养条件下生长的MET。C类，ALDH1活性通过ErbB2-c的FACS分析测定-六月+/+ 与ErbB2-c型-六月−/−MET细胞。DEAB公司，脱甲氨基苯甲醛；BAAA公司，BODIPY-氨基乙醛。D类c中的Sca-1染色-六月+/+ 与c（c）-六月−/−MET细胞。误差条注明S.E。

CD44亚群+/CD24型−乳腺癌细胞具有干/祖细胞特性(42). 尽管CD44是一个有争议的领域高的CD24型低的在非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠中，小鼠乳腺癌细胞富集为乳腺癌起始细胞，表达干细胞表面抗原，并形成乳房球(44). CD44的相对比例+/CD24型−在乳房培养中细胞增加（0.30与8.67%) (图5B类). c的切除-六月降低CD44的比例+/CD24型−MET增长了79.5%（8.67%与1.78%) (图5B类). ALDH活性增加的正常和肿瘤人乳腺上皮细胞具有干/祖细胞特性(33). 如前所述测量ALDH活性(33). 肿瘤细胞悬浮在含有ALDH1底物的缓冲液中(BAAA公司)与用去甲氨基苯甲醛孵育的阴性对照细胞进行比较(图5C类,DEAB公司)，一种特定的ALDH抑制剂。乳腺肿瘤干细胞显示ALDH1活性增加。切除c-Jun后，ALDH1阳性MET的相对比例降低了48.3%(图5C类). 最后，Sca-1被用作ErbB2转基因小鼠乳腺癌干细胞中富集的标记物(34). 内源性c的缺失-六月MET中的基因降低了Sca-1的比例+72.5%至30.4%的细胞(图5D类).

c的切除-六月MET中SCF丰度减少76.3%(图6A类). 尽管SCF不影响Transwell的迁移，但添加SCF后弥补了c-六月−/−MET乳房扩张(图6B类)增加CD24的比例−/CD44细胞+单元格2.2倍(图6C类). 总之，这些研究与乳腺上皮性肿瘤中内源性c-Jun诱导SCF和CCL5的表达和分泌的模型一致，这两种细胞分别促进乳腺上皮性癌前体细胞的扩增和肿瘤细胞的迁移(图6D类).

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SCF修复了c中的缺陷-六月−/−MET干细胞扩增。 A类，MET条件培养基的ELISA（c-六月+/+)与MET（c-六月−/−)对于SCF。B类，在存在或不存在SCF的情况下进行的乳房生产分析表明，当SCF添加到c-六月−/−MET。（所有数据均显示为n个= 4.)C类，CD44相对比例的荧光活化细胞分选高的CD24型低的细胞取自乳腺球，用SCF（10 ng/ml）或载体处理。误差线在中指示S.E面板A–C。D类，通过诱导SCF和CCL5（RANTES）的产生，c-Jun介导的细胞迁移和乳腺扩张的示意图。

讨论

目前的研究首次证明内源性c-Jun可促进MET细胞的生长、侵袭和肿瘤干细胞的扩增。乳腺肿瘤分泌SCF和CCL5的方式依赖于内源性c-Jun的丰度-六月−/−乳腺肿瘤细胞。SCF的加入挽救了c在乳球生成中的缺陷-六月−/−乳腺肿瘤。这个CCL5号机组和SCF公司基因启动子是c-Jun在培养的乳腺癌细胞中诱导的直接转录靶点(图4F类) (11). JNK抑制剂（SP600125，5μ米)c组CCL5启动子活性降低26.8%，SCF启动子活性下降25.0%-六月+/+单元格(补充图2E类). ErbB2抑制剂（AG-825，50μ米)c组SCF启动子活性降低，但CCL5启动子活性没有降低-六月+/+单元格(补充图2E类). 这些发现与c-Jun/JNK在激活SCF和CCL5启动子中的作用一致-六月+/+细胞。总之，这些研究与一种新的模型一致，在该模型中，c-Jun可以通过SCF的异型分泌增强肿瘤干细胞的扩增来增强乳腺肿瘤的生长。

其中，内源性c-Jun减少细胞粘附，增强乳腺上皮性肿瘤细胞的迁移和侵袭。c-Jun增强了迁移方向性的持续性。c-Jun促进成纤维细胞和角质形成细胞迁移(45,46). c-Jun通过诱导SCF分泌增强成纤维细胞迁移。相反，在乳腺肿瘤细胞中，CCL5而非SCF控制着细胞迁移。CCL5是基质细胞的化学吸引剂，包括表达CCR5受体的巨噬细胞(22,–24,47,48). 趋化因子CCL5由T-47D、MCF-7、MDA-MB-435和BT-20细胞分泌(19,49). 肿瘤相关巨噬细胞水平高与预后不良相关(50,51). 趋化因子CC家族被认为是单核细胞和T细胞迁移的主要介质。CCL5已被证明以异型方式产生间充质干细胞并增强CCR5的表达，从而诱导乳腺癌细胞的运动、侵袭和转移(三). 异型信号有助于乳腺癌的发生和发展，其部分来源于浸润的T细胞和肿瘤相关巨噬细胞。CC趋化因子CCL5与乳腺癌进展有关。c中应力纤维形成增加-六月−/−MET细胞与向心分布的局灶性接触相关，类似于c-六月−/−MEF细胞(12). c-Jun对MEF中迁移的诱导涉及c-Src的表达增加，c-Src-是c-Jun的直接靶点，这与当前的研究一致，即c-Jun在MEF中的Src丰度降低-六月−/−MEC公司。

本文的几条证据证明了c-Jun在促进MET祖细胞扩增中的重要作用。乳腺肿瘤干细胞的特点是细胞表面标记物CD24富集−/CD44细胞高的、ALDH1的产生、Sca-1的表达以及在缺乏血清的条件下作为乳房球的生长(52). 内源性c-Jun增强了ErbB2衍生乳腺上皮性肿瘤细胞系中的每一个特征。乳腺检测确定了自由浮动聚集体的数量和大小，此前已经证明，自由浮动聚合体可以保持自我更新的潜能，并分化为乳腺的所有细胞类型(53). 这种自我更新的检测是基于干细胞可以在凤尾鱼非依赖性条件下存活的想法。相反，分化细胞需要附着才能存活。肿瘤干细胞具有自我更新能力，驱动肿瘤复发和转移。小鼠和人类造血、神经干和祖细胞具有高ALDH1活性(54,–56). 从人类乳腺肿瘤中分离出的ALDH阳性细胞含有肿瘤干细胞群(33). 人类乳腺癌ALDH染色与预后不良相关(33).

一种无偏见的蛋白质组学方法表明，c-jun介导乳腺上皮干细胞扩张的机制涉及c-jun诱导SCF分泌。ErbB2-c中SCF的生成减少-六月−/−细胞和添加SCF挽救了有缺陷的乳房圈生产。乳腺肿瘤干细胞对治疗耐药和肿瘤复发的影响(37). c-Jun通过SCF诱导肿瘤干细胞的发现增加了SCF可能成为c-Jun表达乳腺肿瘤有用靶点的可能性。

补充材料

补充数据：

鸣谢

我们感谢Atenssa L.Cheek准备这份手稿。Kimmel癌症中心得到了美国国立卫生研究院癌症中心核心拨款P30CA56036（发给R.G.P.）的支持。

*这项工作得到了美国国立卫生研究院R01CA70896、R01CA75503和R01CA107382（对R.G.P.）以及R01CA120876（对M.P.L.）的全部或部分支持。该项目的部分资金也来自Ralph博士和Marian C.Falk医学研究信托基金以及宾夕法尼亚州卫生部（给共和党）的拨款。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg本文的在线版本（可在http://www.jbc.org)包含补充图1-3.

2使用的缩写如下：

MEF公司
小鼠胚胎成纤维细胞
SCF公司
干细胞因子
MEC公司
乳腺上皮细胞
遇见
乳腺上皮细胞瘤
JNK公司
c-Jun N-末端激酶
兰特斯
调节活化正常T细胞的表达和分泌
ALDH公司
醛脱氢酶
酶联免疫吸附试验
酶联免疫吸附试验
FACS公司
荧光激活细胞分选
逆转录聚合酶链反应
实时PCR
MSCV公司
鼠干细胞病毒
MMTV（多媒体电视）
小鼠乳腺肿瘤病毒
IRES公司
内部核糖体进入位点
GFP公司
绿色荧光蛋白
广告
腺病毒。

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文章来自生物化学杂志由以下人员提供美国生物化学和分子生物学学会