干细胞。作者手稿；PMC 2011年1月1日提供。
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Notch促进胶质瘤干细胞的放射抗性
,1,2,* ,三 ,4 ,4 ,三 ,1,2 ,4,*和1,2,*
王佳良
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蒂莫西·韦克曼
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贾斯汀·拉塔
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安妮塔·B·赫杰尔梅兰
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王晓凡
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丽贝卡·R·怀特
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杰里米·N·里奇
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布鲁斯·苏林格
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摘要
放射治疗是胶质瘤最有效的非手术治疗方法。然而，胶质瘤具有高度的放射抗性，复发几乎是普遍的。我们实验室和其他小组的结果表明，肿瘤干细胞对胶质瘤和乳腺癌的放射抗性有贡献。Notch通路与干细胞命运决定和癌症密切相关。在这项研究中，我们发现用γ-分泌酶抑制剂（GSIs）抑制Notch通路使胶质瘤干细胞对临床相关剂量的辐射更敏感。GSIs增强了胶质瘤干细胞的辐射诱导细胞死亡和克隆形成存活率，但不影响非胶质瘤细胞。同样，敲除Notch1或Notch2也会增加胶质瘤干细胞的放射敏感性。通过保护神经胶质瘤干细胞免受辐射的Notch1或Notch2组成型活性细胞内结构域的表达，证实了GSIs放射增敏作用的特异性。GSIs对Notch的抑制并没有改变胶质瘤干细胞在辐射后的DNA损伤反应，而是削弱了辐射诱导的Akt活化，上调了Mcl-1（Mcl-1s）截短凋亡亚型的水平。综上所述，我们的结果表明Notch在促进胶质瘤干细胞的放射抗性方面发挥着关键作用。抑制Notch信号传导有望提高目前神经胶质瘤放射治疗的效率。
介绍
恶性胶质瘤，包括间变性星形细胞瘤（世界卫生组织（WHO）III级）和多形性胶质母细胞瘤（WHO IV级）是最具破坏性的恶性肿瘤。尽管最近在治疗方面取得了进展，但恶性胶质瘤的治疗仍然是姑息性的。间变性星形细胞瘤的中位诊断后生存期不到3年，多形性胶质母细胞瘤的中位数诊断后生存时间为12-14个月[1,2,三]. 治疗的标准是对肿瘤进行最大限度的手术切除，然后进行放疗和化疗。胶质瘤通常对放射治疗有反应，但随后的复发几乎是不可避免的，这表明致瘤细胞杀伤不足[4]. 最近，具有干细胞样特性的癌细胞已被广泛应用于人类肿瘤中。肿瘤干细胞模型表明肿瘤的层次结构，肿瘤细胞在顶端的亚群驱动并维持人类肿瘤[5]. 通过选择CD133（prominin-1）细胞表面标记物，可以前瞻性地富集人脑胶质瘤和其他中枢神经系统肿瘤的癌干细胞[6,7,8,9,10,11]，尽管一些肿瘤可能不表达CD133，因此CD133阴性细胞可能仍具有肿瘤干细胞的特征[12,13]. 尽管脑肿瘤干细胞表达了某些神经和其他干细胞标记物（如CD133、武藏-1、Nestin、Sox2和Olig2），但肿瘤干细胞的定义仍具有功能性，需要持续的自我更新和肿瘤增殖。最近的报告提出，一些已建立的癌细胞系含有类似癌干细胞的细胞，但有力的证据表明，维持在前分化血清条件下的细胞获得的遗传差异并不反映原始肿瘤[14]. 我们的实验室先前证明，由于DNA损伤反应途径的优先激活，胶质瘤干细胞与匹配的非干细胞相比，对辐射更具抵抗力[7]. 其他研究小组也报告说，乳腺癌的癌干细胞相对抗辐射，这可能是由于癌干细胞中活性氧水平较低所致[15].
癌症干细胞在肿瘤对放射治疗的反应中的新作用促使人们研究这些细胞抗辐射的分子机制。其中之一是Notch信号通路。Notch通过与邻近细胞上的配体相互作用介导短程细胞通信[16]. Notch在调节正常干细胞的自我更新和决定细胞命运方面的工具作用已经得到了很好的证实[17]. 在哺乳动物中，Notch通过四个Notch受体（Notch 1-4）和五个配体（Jagged-1、-2和Delta-like-1、-3和-4）发出信号，这些都是I型跨膜蛋白[18]. Notch的激活涉及连续的蛋白水解裂解，最终导致Notch受体（NICDs）胞内结构域的释放和核移位，以及随后Notch依赖性转录的激活。γ-分泌酶复合物介导NICD释放的最后一个蛋白水解步骤，是Notch活化所必需的[19,20]. γ-分泌酶抑制剂（GSIs）已被用于阻断Notch信号在体外和体内.
Notch信号通路主要参与多种成体干细胞的维持，如乳腺[21,22]，肠道[23,24]和神经干细胞[25,26,27]通过促进自我更新和抑制分化。在广泛的人类肿瘤中发现了异常Notch活性，如白血病、乳腺癌和胶质瘤[28,29,30,31]. 考虑到Notch在干细胞和癌症生物学中的工具功能，发现Notch在癌症干细胞中起着重要作用就不足为奇了[32]. Notch抑制损害乳腺导管癌来源的乳腺起始细胞的自我更新能力就地[22]减少白血病干细胞的集落形成[33]. 通过表达NICD1激活Notch促进SHG-44胶质瘤细胞系的生长和神经球形成[34]. γ-分泌酶抑制剂（GSI-18）的Notch抑制可诱导髓母细胞瘤细胞系富集的CD133+细胞的凋亡和分化，并削弱这些细胞的致瘤能力。特别令人感兴趣的是，表达神经干细胞标记nestin的原始细胞中，GSI-18诱导的凋亡是nestin阴性细胞的10倍，这表明癌症干细胞具有优先的Notch依赖性[35].
最近有报道称，辐射后内皮细胞中的Notch通路被短暂激活，这可以通过上调Notch通路成分Jag1和Hey1来证明[36]. 我们利用药理学和基因靶向策略，探讨了Notch在调节胶质瘤干细胞放射抗性中的潜在作用，并进一步关注了潜在的分子机制。我们的研究结果表明，Notch抑制可以作为一种辅助方法来改善目前胶质瘤的放射治疗。
结果
γ-分泌酶抑制剂联合辐射对胶质瘤干细胞生长和克隆形成存活的影响
越来越多的证据表明，Notch通路在广泛的人类肿瘤和肿瘤干细胞中发挥着重要作用[32,37]. 最近的一项研究报道，辐射诱导内皮细胞中Notch通路成分的瞬时上调[36]，我们研究了Notch活性是否参与胶质瘤干细胞的放射反应。从作为直接异种移植物扩增的手术活检标本中分离出富含胶质瘤干细胞的短期培养物，这些标本已被证明能够维持肿瘤干细胞表型[38]. 本研究中专门使用的CD133+胶质瘤细胞的干细胞样特性，包括持续自我更新、干细胞标记物的表达、多谱系分化以及在系列异种移植试验中重演原始肿瘤的能力，已在我们以前的出版物中得到证明（补充图1和[6,7,39,40,41,42]). 我们使用Notch反应荧光素酶报告子观察到放射后胶质瘤干细胞中Notch依赖性转录激活的上调()，尽管代表性Notch靶基因（如Hes和Hey家族基因）的表达变化与实时定量PCR检测结果相比并不显著（数据未显示）。γ-分泌酶抑制剂DAPT或L685458对胶质瘤干细胞中Notch的抑制作用已通过Notch反应荧光素酶报告分析进行验证(). 在接受不同剂量的GSI治疗或不接受GSI治疗后，评估CD133+胶质瘤细胞的生长情况。GSIs在无辐射的情况下适度降低T4302 CD133+胶质瘤细胞的生长(，图1），但受到1、2或3 Gy辐射的细胞生长严重受损(，图2-4）。2-Gy辐射后第五天，假治疗组的总细胞数大约是GSI治疗组的4倍。相比之下，在未经辐射处理的情况下，与GSI处理的细胞相比，辐射后5天，假处理的细胞仅多25%（与DAPT处理的细胞比较）或60%（与L685458处理的细胞对比）。
γ-分泌酶抑制剂降低胶质瘤干细胞辐射后的细胞生长和克隆形成存活（A） 将Notch-responsive荧光素酶报告子与载体预混合，转染T4302 CD133+胶质瘤干细胞，以指导胶质瘤的组成性表达雷尼利亚荧光素酶。保持细胞未受辐射或照射3 Gy，然后收集细胞以测量所示时间点的荧光素酶活性。在本次和随后的荧光素酶分析中，萤火虫荧光素酶活性按内部控制标准化雷尼利亚对照组萤火虫荧光素酶活性和归一化萤火虫萤光素酶活性的值为1。数据表示为平均值±标准误差。（B） 用Notch-responsive荧光素酶报告子转染T4302 CD133+细胞，并用DMSO（载体）、2μM DAPT或0.5μM L685458处理一晚，然后收集细胞进行荧光素酶分析。（C） 用2μM DAPT或0.5μM L685458预处理T4302 CD133+细胞4小时，按照指示进行照射，并以每孔3000个细胞的速度在96-well板中三次校准。然后通过CellTiter-Glo-Luminescent cell Viability Assay（Promega）测定接下来五天的总活细胞数。对照组第1天的平均细胞滴度值为1。（D） 如图1C所示，对T4302 CD133+细胞进行预处理和辐照。然后将细胞接种形成神经球，并按方法所述测定存活部分。平均值±标准误差来自代表性实验中的8次重复。（E，F）T3359和T4105 CD133+细胞在单独使用GSI、单独使用3-Gy辐射或联合使用时的神经层形成如图1D所示。
克隆存活试验是评估辐射反应性的标准试验。在这项研究中，我们使用神经球形成作为胶质瘤干细胞克隆形成存活的替代标记。用二甲基亚砜、DAPT或L685458预处理T4302 CD133+胶质瘤细胞，并允许其在多个剂量水平下生长或照射。与检测的所有辐射剂量的对照组相比，经GSIs联合辐射处理的细胞的克隆形成存活率显著降低(，在1 Gy时p=0.012，在2 Gy和3 Gy时，p<0.001，通过单向方差分析）。还检测了GSIs对来源于T3359神经胶质瘤异种移植物的CD133+细胞的克隆生存的影响。GSIs始终抑制3Gy照射的T3359 CD133+细胞的神经球形成（单向方差分析，p<0.0001），但不抑制未照射细胞的神经圈形成（单向变异分析，p>0.05）(). 使用来自其他胶质瘤来源（如T4105和T4597）的CD133+细胞也证明了类似的结果(和数据未显示）。综上所述，这些结果强烈表明，γ-分泌酶抑制剂对Notch的抑制会降低胶质瘤干细胞的放射抗性。
γ-分泌酶抑制剂增强胶质瘤干细胞辐射诱导的细胞死亡
与sham处理的细胞相比，GSI处理的细胞中观察到明显更大的辐射诱导细胞死亡。放射治疗后两天，经车用处理的T4302 CD133+细胞含有约30%的死亡细胞，而在DAPT或L685458的存在下，60%的细胞死亡(，p=0.0002，通过单向方差分析）。相反，GSI对未经辐射处理的死亡细胞比率没有明显影响(单因素方差分析，p>0.05）。绝大多数经GSI处理的细胞在照射3 Gy后72小时内死亡。然而，过多的细胞碎片干扰了用于计数细胞数量的台盼蓝排除试验。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活是凋亡细胞死亡的标志，并与放射反应密切相关[43,44,45,46]. 使用基于发光的caspase-3/7分析，我们检测了Notch抑制如何影响作为细胞死亡替代标记的辐射诱导caspase激活。GSIs本身并没有显著改变sham-照射细胞中的caspase活性(，p＞0.05，通过单因素方差分析）。相比之下，GSIs与3-Gy辐射结合后，caspase活性在48小时增加约2倍，在72小时增加4倍(单因素方差分析，p<0.01）。使用来自多种胶质瘤来源的CD133+胶质瘤细胞检测到类似结果，包括T3359、T3691、T4105和T4597(和数据未显示）。在验证研究中，通过Annexin V（凋亡细胞的细胞表面标记物）的流式细胞术分析来评估凋亡细胞的死亡。辐射后48小时，DAPT和L685458均显著增加Annexin V阳性标记细胞(，p<0.01，通过单因素方差分析），尽管辐射后24小时效果不明显(单因素方差分析，p>0.05）。此外，根据半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶分析，DAPT在不同辐射剂量下（辐射暴露72小时后，1Gy时增加约2倍，2Gy和3Gy时增加3倍）增强了辐射诱导的细胞死亡(). DAPT的放射增敏作用表现出浓度依赖性，200 nM DAPT（IC50按照制造商的建议）仍然有效(，根据Student’st吨-测试）。总之，这些数据表明，使用γ-分泌酶抑制剂的Notch抑制使胶质瘤干细胞对辐射诱导的细胞死亡敏感。
γ-分泌酶抑制剂增强胶质瘤干细胞辐射诱导的细胞死亡（A） T4302 CD133+细胞用DAPT或L685458预处理4小时，并在3 Gy下照射。在辐射暴露后48小时，通过台盼蓝排斥试验测定死亡细胞的百分比。（B） 如图所示，用GSIs±辐射处理T4302 CD133+细胞。然后将细胞以每孔3000个细胞的速度在96 well板中进行电镀。通过将胱天蛋白酶活性标准化至相应的细胞滴度来确定相对的胱天蛋白酶3/7活性。（C，D）照上述方法测定照射后72小时T3359和T3691 CD133+细胞的相对caspase 3/7活性。（E） 按照图2A所述处理T4302 CD133+细胞。辐射暴露24或48小时后，根据制造商的说明，用FITC-结合的Annexin V抗体（BD Sciences）标记细胞，并用流式细胞仪进行分析。（F） 用2μM DAPT预处理T4302 CD133+细胞4小时，并在1、2或3 Gy照射或不照射。在照射后72小时测定相对caspase 3/7活性。（G） T4302 CD133+细胞在指定浓度下用DAPT预处理4小时，并在3 Gy照射。在照射后48或72小时测定相对caspase活性。
CD133-阴性胶质瘤细胞对γ-分泌酶抑制剂无反应
我们进一步确定Notch抑制是否影响胶质瘤CD133阴性部分的放射反应。按照类似的程序，对T4302 CD133阴性细胞经GSI治疗或不经GSI处理后的细胞死亡和辐射暴露后的克隆存活率进行了测定。有趣的是，在CD133阴性的胶质瘤细胞中，GSI治疗并没有显著促进caspase激活或损害克隆形成生存，无论照射剂量如何(单因素方差分析，p>0.05）。在克隆形成存活分析中，CD133阴性细胞在辐射前在干细胞培养基中培养过夜并用GSI进行预处理，并在辐射后两天换回补充血清的DMEM培养基。相反，如果在辐射后将CD133+胶质瘤细胞置于含血清的DMEM培养基中，并在单层中形成集落，则GSI治疗仍会抑制CD133+细胞的克隆形成存活（数据未显示）。因此，CD133阴性神经胶质瘤细胞对Notch抑制的抵抗力与辐射的联合作用并不是由于培养基的差异。综上所述，我们的数据表明，Notch抑制的放射增敏作用对胶质瘤的肿瘤干细胞部分具有特异性。
GSIs对Notch的抑制不会显著改变照射后T4302 CD133-阴性细胞的细胞死亡或克隆形成存活用2μM GSI或0.5μM L685458预处理T4302 CD133-阴性细胞4小时，并按照指示进行照射。（A） 在放射后48或72小时测定相对caspase 3/7活性，如（B）照射后，将6孔板中的T4302 CD133-细胞培养三周，固定并染色以计数菌落。存活部分按方法所述进行测定。
Notch1或Notch2组成活性胞内结构域的表达减弱GSI的放射增敏作用
GSI的底物除了Notch受体外，还包括50多种I型膜蛋白[47]. GSIs的放射增敏效应可能不一定通过抑制Notch介导。因此，我们通过表达作用于GSI下游的Notch1或Notch2（NICD1或NICD2）组成活性胞内结构域，验证了Notch在胶质瘤干细胞放射反应中的作用。使用定量实时PCR，上调Notch靶基因Hes4和Hes5，显示慢病毒介导的NICD1或NICD2表达激活了Notch通路()以及Notch应答报告人产生的荧光素酶活性增加(). 与亲代细胞相似，感染对照慢病毒的细胞在照射后对DAPT敏感(). 相反，表达NICD1或NICD2的细胞与对照细胞相比，无论DAPT治疗如何，都表现出明显较弱的辐射诱导细胞死亡(通过单因素方差分析，48小时时p=0.001，72小时时p<0.001，对照组与NICD1/NICD2）。此外，DAPT治疗未能增加NICD2表达时Annexin V阳性细胞的百分比(，p>0.05，NICD2 vs.NICD2+DAPT，按学生t吨-测试）。最后，NICD2的表达提高了T4302胶质瘤干细胞在放射治疗后的克隆形成存活率，而不考虑DAPT治疗(，p=0.004，NICD2与对照组的比较±DAPT；单因素方差分析显示，3Gy辐射时，NICD2+DAPT与对照组±DAPT相比p<0.01，而DAPT治疗并未显著改变辐射后NICD2表达细胞的克隆形成存活率(，NICD2 vs.NICD2+DAPT，p>0.05，按学生t吨-测试）。总之，我们的数据表明，NICDs的表达对Notch的激活减弱了GSIs的放射增敏作用，这表明GSIs的这些活性主要是通过抑制Notch介导的。
Notch1或Notch2胞内结构域的表达减弱GSIs的放射增敏作用（A） 用对照慢病毒或慢病毒感染T4302 CD133+细胞，直接表达NICD1或NICD2，并用嘌呤霉素筛选。通过实时定量PCR检测Notch1、Notch2和Notch靶基因、Hes4和Hes5的表达。（B） 对照组T4302细胞或表达NICD2的细胞转染Notch-dependent荧光素酶报告子，并用二甲基亚砜或2μM DAPT处理过夜。Notch依赖性转录活性通过荧光素酶报告子分析测定，如（C）对照细胞或表达NICD的细胞按照指示接受DAPT±辐射。在辐射后48或72小时测定相对caspase 3/7活性，（D）通过Annexin V染色测定凋亡细胞死亡，如，和（E）存活部分的测定如.
敲除Notch1或Notch2使胶质瘤干细胞对辐射敏感
单个Notch受体在某些肿瘤类型中可能具有不同的生物学功能[48]. 在人髓母细胞瘤中，已经证明Notch1或Notch2的组成性细胞内区域的表达似乎发挥相反的作用，Notch1作为肿瘤抑制因子，Notch2作为肿瘤启动子[49]. 在胶质瘤中，Notch1基因敲除会损害细胞生长和存活[50]. 通过NICD1或NICD2的表达，我们的结果表明这两种Notch受体都能促进胶质瘤干细胞的放射抗性。为了更好地了解单个Notch受体是如何参与放射反应的，我们通过慢病毒介导靶向Notch1或Notch2的shRNA表达，确定了Notch1和Notch2敲低对放射抗性的影响。通过实时定量PCR测定相应Notch受体和Notch靶基因的下调效率(). 与之前的报告一致，仅敲低Notch1就增加了T4302 CD133+细胞的凋亡细胞死亡。有趣的是，通过击倒Notch2也取得了类似的效果(). Notch1或Notch2表达降低的细胞对辐射诱导的细胞死亡高度敏感(，p<0.001，非靶向shRNA vs.Notch1/2 shRNA，单向方差分析）。一贯地，Notch1或Notch2的敲除严重损害了胶质瘤干细胞的克隆形成存活(). 当受到3-Gy辐射时，表达Notch1或Notch2特异性shRNA的胶质瘤干细胞很少形成神经球。这些结果进一步证实了Notch通路在调节放射抗性中的特殊作用，并提示胶质瘤干细胞的放射抗性可能需要多个Notch受体。
敲除Notch1或Notch2增加胶质瘤干细胞的放射敏感性T4302 CD133+细胞被慢病毒感染，慢病毒直接表达非靶向shRNA或Notch1或Notch2特异性shRNA（KD-Notch1或KD-Notch 2）。（A） 通过实时定量PCR测定Notch1、Notch2、Hes4或Hes5的相对mRNA水平。（B） 对细胞进行辐照和鉴定，以确定caspase 3/7的相对活性，如（C）比较对照组和Notch1或Notch2基因敲除的细胞的克隆形成存活率，如（D）辐射后两周，T4302 CD133+细胞在Notch敲除或不敲除的情况下形成的神经球的代表性图像（100×）。
Notch通路不会改变神经胶质瘤干细胞的DNA损伤反应
DNA损伤检查点反应在细胞对辐射的反应中起着关键作用[51,52]. 我们以前的研究表明，DNA损伤反应的激活增加与胶质瘤干细胞的放射抗性有关[7]. 为了确定Notch促进神经胶质瘤干细胞抗辐射的机制，我们首先评估了Notch通路是否影响辐射后检查点激酶的激活。两种GSI均未显著改变辐射后Chk1或Chk2的活化磷酸化(). 此外，即使在辐射24小时后添加DAPT，DAPT也会增加辐射诱导的细胞死亡(，p=0.0045，未治疗与24小时治疗，由Student’st吨-测试），而大量DNA损伤修复过程通常在辐射暴露后几个小时内完成[53]. 这些结果表明，DNA损伤反应与Notch通路的辐射防护功能无关。
Notch通路不改变胶质瘤干细胞的DNA损伤反应（A） T4302 CD133+细胞在照射前用DPAT或L685458预处理24小时。辐射暴露一小时后，收集细胞。通过免疫印迹法评估Chk1和Chk2的活化磷酸化水平。（B） 在辐射前4小时、24小时（−24小时或−4小时）或辐射后0小时、4小时和24小时用2μM DAPT处理T4302 CD133+细胞。在辐射暴露3天后测量相对caspase 3/7活性。
Notch通过调节PI3K/Akt途径和Mcl-1蛋白水平促进放射抗性
Notch的抑制使神经胶质瘤干细胞对辐射诱导的细胞死亡更敏感。Notch以上下文相关的方式通过不同的机制促进细胞存活，例如激活PI3K/Akt通路[54,55]以及前生存蛋白Bcl-2和Mcl-1的上调[56]. 我们比较了NICD2表达的T4302胶质瘤干细胞和DPAT、辐射或两者联合治疗的对照细胞中这些生存因子的变化。激活Akt丝氨酸473处的磷酸化被用作Akt活性的替代标记。在无辐射的情况下，DAPT对Notch的抑制和NICD2表达对Notch激活均未明显影响Akt活性。放射后24小时和48小时，磷酸化-S473 Akt水平逐渐升高()经DAPT治疗后减弱(). 相反，NICD2的表达增强了辐射诱导的Akt激活，辐射后48小时DAPT部分减弱但没有消除这种激活(). 我们的实验室最近报道，Akt活性对胶质瘤干细胞的存活至关重要[40]. 根据这一发现，PI3K抑制剂LY294002或Akt抑制剂III的治疗增加了T4302胶质瘤干细胞的细胞死亡，无论有无辐射(). NICD2的表达没有克服LY294002或Akt抑制剂III的凋亡作用，这表明PI3K/Akt通路在Notch下游起支持细胞生存的作用(). 有趣的是，NICD2的表达并没有降低PTEN的水平，PTEN是PI3K/Akt通路的主要负调控因子。相反，NICD2的表达增加了PTEN水平，这与放射治疗无关。检测的胶质瘤干细胞中的PTEN是否具有功能尚待确定，我们的结果表明Notch并没有通过抑制PTEN来激活PI3K/Akt通路。
Notch通路通过Akt通路和Mcl-1调节胶质瘤干细胞的放射抗性T4302 CD133+细胞感染对照慢病毒或慢病毒直接表达NICD2。细胞用2μM DPAT预处理4小时，并暴露于3-Gy辐射。照射后24或48小时收集受照细胞，照射后48小时收集未受照细胞。通过免疫印迹法评估磷酸化Akt（S473）、总Akt、PTEN、Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、磷酸化p53（S15）、总p53和PUMA的蛋白水平。使用肌动蛋白作为加载对照。（B） 对照细胞或NICD2表达细胞在辐射暴露前用10μM PI3K抑制剂LY294002或50μM Akt抑制剂III（SH-6）预处理4小时。在辐射暴露后48小时测定caspase 3/7的相对活性。
抗凋亡Bcl-2蛋白，包括Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1，是细胞存活的重要启动子[57]. Bcl-2和Bcl-xL的水平没有因辐射或Notch改变而明显改变(). 有趣的是，辐射降低了全长抗凋亡Mcl-1（Mcl-1）的水平L（左）)同时增加了Mcl-1（Mcl-1）截短亚型的水平S公司) ()，由于BH1和BH2结构域的丢失而导致凋亡[58]. DAPT治疗降低Mcl-1L（左）并增加了Mcl-1S公司辐射之后。相反，NICD2表达将天平转向Mcl-1L（左）有或没有辐射处理(). 这些结果表明，Mcl-1之间的平衡L（左）和Mcl-1S公司与胶质瘤干细胞的放射后存活有关，这种平衡受Notch通路调节。
Notch和p53之间的功能相互作用很有趣，因为Notch可以激活p53[59,60]或抑制p53[61]以细胞类型特定的方式。作为细胞放射反应的重要调节因子，p53活性可能参与Notch的放射保护功能。我们的结果表明，NICD2的表达在无辐射的情况下增加了p53水平，并增强了辐射诱导的p53激活(). 此外，NICD2上调了p53靶基因PUMA的表达。这些结果与之前的研究一致，研究表明Notch1上调胶质瘤中的p53[60]表明Notch的辐射保护功能不是通过抑制p53介导的。
讨论
脑癌治疗的根本改进需要开发新的治疗范式。替莫唑胺是一种口服甲基化化疗药物，当与外照射同时使用并辅以辅助治疗时，它成为新诊断胶质母细胞瘤的标准治疗药物[三]这表明联合治疗和放射治疗可能会改变生存曲线。尽管替莫唑胺有好处，但胶质母细胞瘤仍然对辐射高度耐药[4]. 我们最近证实，胶质瘤的癌干细胞部分比非肿瘤胶质瘤细胞更耐辐射[7]. 鉴于胶质瘤干细胞具有较高的致瘤能力，这一范式表明，破坏胶质瘤干电池的放射抗性可能会增强放射治疗的疗效。我们已经证明，检查点激酶抑制剂Chk1/2可使胶质瘤干细胞对辐射致敏[7]. 然而，由于正常细胞在放射反应中对这些分子的共同依赖性，DNA损伤检查点抑制剂的治疗指数可能有限[62]. 在目前的研究中，我们描述了Notch信号在胶质瘤干细胞中的一种新的放射防护作用。我们的结果表明，使用GSI或Notch1/2特异性shRNA抑制Notch使胶质瘤干细胞对辐射敏感。为了进一步支持这些观察结果，通过表达NICD1或NICD2激活Notch可促进神经胶质瘤干细胞的放射抗性。表达NICD1或NICD2的细胞对GSI的放射增敏功能具有抵抗力，因为NICDs作用于GSI介导的Notch抑制的下游。综上所述，这些药理学和遗传学方法均表明，Notch活性与胶质瘤干细胞的放射抗性密切相关，表明Notch途径可能是改善胶质瘤放射治疗的潜在治疗靶点。
在各种人类肿瘤中，特别是白血病和乳腺癌中，Notch通路成分的突变突出了Notch的致癌作用[63]. 据报道，约50%的人类T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）中存在Notch1激活突变，使其成为该病中最常见的致癌事件[31]. 约50%的人类乳腺癌中检测到Notch抑制剂Numb缺失[29,30]. 多形性胶质母细胞瘤细胞系和手术活检标本中也存在Notch通路成分的上调表达[28]. 最近出现了Notch通路在维持脑肿瘤干细胞中的关键作用[37]. 我们的结果表明Notch的放射防护功能对CD133+胶质瘤干细胞是特异的。GSI治疗不会明显改变受照非干细胞胶质瘤细胞的细胞死亡或克隆形成存活。这些研究表明，干细胞特异性途径，如Notch，可能是潜在的治疗靶点，而使用全肿瘤的研究可能无法轻易认识到这一点。
Notch通路可以以上下文相关的方式促进或抑制肿瘤发生。例如，小鼠表皮中Notch1缺失或显性阴性MAML1突变体的表达会导致皮肤增生和随后的皮肤肿瘤[64,65]. 在髓母细胞瘤中，NICD2的表达促进肿瘤生长，而NICD1具有肿瘤抑制作用[49]. 相反，敲除Notch1会损害胶质瘤细胞系的增殖和存活[50]. 利用慢病毒介导的NICD1/2或Notch1/2特异性shRNAs的表达，我们的数据表明，Notch1和Notch2都能促进胶质瘤干细胞的放射抗性，尽管每个Notch受体的相对作用尚不明确。为什么在胶质瘤干细胞中，单个Notch受体的敲除比GSI对Notch的综合抑制表现出更高的毒性，仍有待阐明。毒性可能涉及shRNA的脱靶效应或微小RNA/短发夹RNA途径的过饱和[66]. 此外，这些结果表明，膜结合Notch受体可能在尚未被识别的胶质瘤中具有重要的生物学功能。每个Notch受体在调节胶质瘤干细胞放射抗性中的具体作用超出了本研究的范围，但定义每个Notch接收器的放射防护功能将非常重要，因为针对全身癌症治疗的特定Notch中和抗体正在临床开发中，在治疗环境中可能会产生明显的不利影响。Notch1调节肠干细胞命运决定和肠内稳态[23,24]. 使用GSI治疗阿尔茨海默病的临床试验主要与胃肠毒性有关[67,68]这可能是由于GSI抑制Notch1所致。如果除Notch1外的Notch受体对胶质瘤干细胞的放射抗性也是必不可少的，那么专门针对这些受体的小分子或抗体，而备用的Notch1可以在胶质瘤中实现类似的放射增敏作用，并降低肠道毒性。
我们的结果表明，Notch抑制辐射后胶质瘤干细胞最显著的生物学后果是辐射后3天内发生的细胞死亡急剧增加，这表明Notch与胶质瘤干电池的辐射后存活密切相关。根据这些观察结果，Notch活性改变了受照射胶质瘤干细胞中Akt的激活和Mcl-1的水平。PI3K/Akt通路的激活在Notch的辐射防护功能中起着重要作用，我们的结果表明，PI3K或Akt抑制剂可消除NICD2的辐射防护活性。PI3K/Akt途径在细胞生长、增殖和生存的许多方面都具有深刻的功能[69]. 我们之前描述了PI3K/Akt通路与胶质瘤干细胞生长和存活之间的重要联系[40]. 这些发现的证实来自对小鼠髓母细胞瘤模型的研究，在该模型中，癌干细胞由干细胞标记物和血管周围位置定义，但没有功能验证。在这些研究中，放射后髓母细胞瘤干细胞中的PI3K/Akt通路被激活，这是放射后细胞生存所必需的[70]. 与我们的发现一致，Akt的抑制使髓母细胞瘤干细胞对辐射敏感[70]. 最近有报道称，Mcl-1是发育过程中和DNA损伤后神经前体存活的关键调节因子[56,71]. Akt活性促进Mcl-1抗凋亡亚型的表达L（左）[72]. 因此，调节Mcl-1之间的辐射后平衡L（左）Notch的Mcl-1s可能通过Akt介导。NICD2的表达增加了PTEN（负调节Akt活性）和p53（不依赖于辐射暴露）的水平，表明这两种蛋白的活性可能与Notch的辐射防护功能没有直接关系。然而，髓母细胞瘤干细胞在辐射中存活并经历p53依赖性细胞周期阻滞，其中PTEN是辐射诱导的p53激活所必需的[70]. 因此，在胶质瘤干细胞中，Notch诱导的PTEN和p53可能通过促进细胞周期阻滞间接降低辐射后的细胞死亡。然而，由于这两种蛋白的抑瘤功能，它们在胶质瘤干细胞放射反应中的具体作用尚待阐明。总之，我们的研究和其他小组的结果说明了一种信号通路，它与神经胶质瘤干细胞和潜在的其他类型癌症干细胞的放射反应的调节密切相关。该途径在多个水平上提供了多种潜在的治疗靶点，包括上游Notch受体、下游激酶（PI3K，Akt）和促/抗凋亡分子（Mcl-1L（左）和Mcl-1S公司).
产生Notch受体活性胞内结构域的最后一个蛋白水解步骤依赖于γ-分泌酶复合物[19,20]. 由于γ-分泌酶复合物介导β-淀粉样肽的产生，而β-淀粉状肽是阿尔茨海默病淀粉样斑块的前体，因此大量γ-分泌蛋白酶抑制剂已被开发用于治疗阿尔茨海默氏病[73]. 鉴于GSIs具有抑制Notch的活性，GSIs在多种肿瘤类型（如T-ALL）中的抗癌效果也得到了积极检测[74]，乳腺癌[75]卡波西肉瘤[76]，髓母细胞瘤[77]，肠腺瘤[24]默克公司生产的一种γ-分泌酶抑制剂MK0752正在乳腺癌和儿童中枢神经系统恶性肿瘤患者中进行临床试验（clinicaltrials.gov）。我们的研究表明，GSIs单独在胶质瘤中仅显示有限的生长抑制作用，而与放射治疗相结合，GSI可能通过提高胶质瘤干细胞的放射敏感性而提供显著的治疗益处。因此，由于GSIs的单药治疗试验可能没有显示出显著的抗肿瘤疗效，因此需要进一步努力评估GSIs与辐射联合使用的临床益处。考虑到Notch在调节干细胞行为和癌症生物学中的普遍作用，有理由推测Notch抑制的放射增敏作用并不局限于胶质瘤，可能是一种广泛有用的治疗模式。
材料和方法
胶质瘤干细胞的富集和细胞培养
从人类手术标本（T3359、T3691、T4105、T4302和T4597）中分离出富集或去除胶质瘤干细胞的匹配培养物，这些标本立即植入免疫低下小鼠（裸鼠BALB/c）中根据我们和其他研究中描述的方法，在胶质瘤模型中保存肿瘤干细胞[7,38,39,40,41,42]. 简单地说，对肿瘤进行解剖，在厄尔的平衡盐溶液中清洗，用木瓜蛋白酶消化（新泽西州莱克伍德市沃辛顿生物化学），并通过70μm细胞过滤器过滤以去除组织碎片。在稀释的磷酸盐缓冲盐水溶液（0.25×）中溶解红细胞。然后在细胞分选之前，在干细胞培养基（补充有B27、表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的神经基底培养基，20 ng/ml，Invitrogen，Carlsbad，CA）中培养分离细胞过夜，以回收细胞表面抗原。使用CD133微球试剂盒（加利福尼亚州奥本市Miltenyi Biotec）通过磁性分选分离CD133−和CD133+组分。CD133−细胞保存在含有10%胎牛血清（Invitrogen）的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中，但在实验前至少24小时在干细胞培养基中培养，以控制细胞培养基的差异。含10%胎牛血清（Invitrogen）的（DMEM）的癌干细胞特性，但在实验前至少24小时在干细胞培养基中培养，以控制细胞培养基的差异。CD133阳性细胞的肿瘤干细胞特性通过荧光原位杂交、系列神经圈分析和异种移植分析得到证实，但缺乏肿瘤干细胞的培养物不会引发肿瘤([7,38,39,40,41,42]和数据未显示）。
抗体、DNA构建物、慢病毒和其他试剂
从Cell Signaling Technology（丹弗斯，马萨诸塞州）购买的抗体包括磷光体S296-Chk1（2349）、总Chk1（2355）、磷光体T68-Chk2（2661）、总Chk2（2662）、磷光-S473 Akt（#9271）、总Akt，#9272）、PTEN（#9556）、磷化-S15-p53（#9286）、Bcl-2（#2870）、Bcl-xL（#2764）、Mcl-1（#4572）、Puma（#4976）。本研究中使用的其他抗体包括p53抗体（#sc-126，加州圣克鲁斯生物技术公司）和肌动蛋白抗体（马萨诸塞州比利科雷市米利波）。pcDNA3-Notch1构造由Spyros Artavanis博士善意提供-哈佛大学Tsakonas。通过PCR扩增Notch1胞内结构域的编码序列（氨基酸残基1744–2556），并通过EcoRI和NotI位点亚克隆到慢病毒载体pCDH-CMV-EF1-puro（System Biosciences，Mountain View，CA）。pcDNA3-NICD2是约翰·霍普金斯大学查尔斯·埃伯哈特博士的一份礼物。NICD2编码序列通过BamHI和NotI位点亚克隆到pCDH-CMV-EF1-puro中。pLKO-shNotch1构造是哥伦比亚大学阿道夫·费兰多博士的一份礼物。pLKO-shNotch2构建物购自Open Biosystems（亚利桑那州亨茨维尔，克隆ID，TRCN0000056426）。如前所述，慢病毒在293FT细胞中用包装质粒psPAX2和pCI-VSVG产生[42]. LY294002、Akt抑制剂III（SH-6）和γ-分泌酶抑制剂DAPT（N-[N-（3,5-二氟苯基）-L-丙氨酸基]-苯甘氨酸叔丁酯）或L685458，（5S）-（叔丁氧羰基氨基）-6-苯基-（4R）羟基-（2R）苄基己酰基）-L-leu-L-苯甲酰胺）购自Calbiochem（NJ Gibbtown）。
辐射
用AGFA X-RAD 320照射系统以0.85 Gy/min的速度照射CD133+细胞的单细胞悬浮液或CD133-阴性细胞的单层培养物。
生长曲线、胱天蛋白酶3/7测定法和克隆生存测定法
细胞被慢病毒感染或按图图例所述进行治疗。在辐射后，将细胞以每孔3000个细胞的速度分三次放入96周的平板中。使用CellTiter-Glo分析试剂盒（密歇根州麦迪逊市Promega）测量5天内的细胞数。对照组在第1天的平均细胞滴度值为1。所有其他相关细胞滴度均相应归一化。
根据制造商的说明，使用caspase-Glo 3/7分析（Promega）测量辐射后48或72小时的caspase活性。将caspase活性归一化为相应的细胞滴度，以获得相对的caspase 3/7活性。
为了测量克隆形成存活率，将CD133+胶质瘤细胞以每孔50个细胞的速度放置在24孔板中，每孔100个细胞用于1Gy照射，或每孔500个细胞用于2Gy或3Gy照射。每组8孔。电镀14天后，对含有50多个细胞的神经球进行评分。或者，将CD133阴性胶质瘤细胞三次接种在6孔组织培养板中，对于sham-照射组，每孔100个细胞，对于1Gy照射的细胞，每孔200个细胞，或者对于2Gy或3Gy照射细胞，每孔500个细胞。照射后21天，细胞固定后用0.5%结晶紫染色。对由50多个细胞组成的菌落进行评分。为了确定存活分数，将每个辐射剂量下的神经球数量归一化为相应的未辐射对照组的神经球数。
荧光素酶检测
Notch-responsive荧光素酶报告子购自SABiosciences（Frederick，MD），该报告子预先与内部控制构建物混合，用于指导雷尼利亚荧光素酶。FuGene 6（Roche）将荧光素酶报告子转染细胞。通过双荧光素酶分析系统（Promega）测定荧光素素酶活性。
实时PCR
总RNA使用RNeasy试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚Qiagen）制备，并使用iScript cDNA合成试剂盒（加州Hercules BioRad）逆转录成cDNA。使用SYBR-Green Mastermix（SABiosciences，Frederick，MD）在Bio-Rad-iCycler系统上进行实时PCR。PCR产物经熔融曲线验证。阈值周期（CT型)每个基因的值均归一化为CT型β-肌动蛋白和HPRT1（次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1）。所用引物如下：Notch1，正向5′-CGC ACA AGG TGT CTT CCA G，反向5′-AGG ATC AGT GGC GTC GTG；槽口2，正向5′-TGG TGG CAG AAC TGA TCA AC，反向5′-CTG CCC AGT GAG CAG AT；Hes4，正向5′-TGG ACG CCC TCA GAA AAG，反向5′-GCT CCG CAG GTG TCT CAC；Hes5，前进5′-TGG AGA AGG CCG ACA TCC T，后退5′-GGC GAC GAA GGC TTT GC。
致谢
我们要感谢Spyros Artavanis-试剂：Tsakonas、Charles Eberhart、Adolfo Ferrando、John Alberta。我们还感谢马克·德赫斯特的有益讨论。
工具书类
1DeAngelis LM公司。脑肿瘤。N英格兰医学杂志。2001;344:114–123.[公共医学][谷歌学者] 2Grossman SA，Batara JF。多形性胶质母细胞瘤的当前治疗。塞明·昂科尔。2004;31:635–644.[公共医学][谷歌学者] 三。Stupp R、Mason WP、van den Bent MJ、Weller M、Fisher B等。胶质母细胞瘤放射治疗加伴随和辅助替莫唑胺。N英格兰医学杂志。2005;352:987–996.[公共医学][谷歌学者] 4.Furnari FB、Fenton T、Bachoo RM、Mukasa A、Stommel JM等。恶性星形细胞胶质瘤：遗传学、生物学和治疗途径。基因发育。2007;21:2683–2710.[公共医学][谷歌学者] 5Clarke MF、Dick JE、Dirks PB、Eaves CJ、Jamieson CH等。癌症干细胞——现状和未来方向的展望：AACR癌症干细胞研讨会。癌症研究。2006;66:9339–9344.[公共医学][谷歌学者] 6鲍S，吴强，茶树菇S，郝Y，李Z，等。干细胞样胶质瘤细胞通过血管内皮生长因子促进肿瘤血管生成。癌症研究。2006;66:7843–7848.[公共医学][谷歌学者] 7Bao S，Wu Q，McLendon RE，Hao Y，Shi Q，等。胶质瘤干细胞通过优先激活DNA损伤反应促进放射抗性。自然。2006;444:756–760.[公共医学][谷歌学者] 8Singh SK、Hawkins C、Clarke ID、Squire JA、Bayani J等。人脑肿瘤起始细胞的鉴定。自然。2004;432:396–401.[公共医学][谷歌学者] 9Galli R、Binda E、Orfanelli U、Cipeletti B、Gritti A等。人类胶质母细胞瘤致瘤性干样神经前体的分离和表征。癌症研究。2004;64:7011–7021.[公共医学][谷歌学者] 10Singh SK、Clarke ID、Terasaki M、Bonn VE、Hawkins C等。人类脑肿瘤中癌症干细胞的鉴定。癌症研究。2003;63:5821–5828.[公共医学][谷歌学者] 11Hemmati HD、Nakano I、Lazaref JA、Masterman-Smith M、Geschwind DH等。儿童脑肿瘤可产生癌干细胞。美国国家科学院院刊。2003;100:15178–15183. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 12Beier D、Hau P、Proescholdt M、Lohmeier A、Wischhusen J等。CD133（+）和CD133。癌症研究。2007;67:4010–4015.[公共医学][谷歌学者] 13.儿子MJ、Woolard K、Nam DH、Lee J、Fine HA。SSEA-1是人类胶质母细胞瘤中肿瘤起始细胞的富集标记物。细胞干细胞。2009;4:440–452. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 14Lee J、Kotliarova S、Kotlianov Y、Li A、Su Q等。与血清培养细胞系相比，在bFGF和EGF中培养的胶质母细胞瘤衍生的肿瘤干细胞更能反映原发性肿瘤的表型和基因型。癌细胞。2006;9:391–403.[公共医学][谷歌学者] 15Diehn M、Cho RW、Lobo NA、Kalisky T、Dorie MJ等。癌症干细胞中活性氧水平与放射抗性的关系。自然。2009;458:780–783. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Lai EC。Notch信号：细胞通讯和细胞命运的控制。发展。2004;131:965–973.[公共医学][谷歌学者] 17干细胞系统中的千叶S.Notch信号。干细胞。2006;24:2437–2447.[公共医学][谷歌学者] 18Wu J，Bresnick EH。缺口信号的基本原理：受体水平是如何调节的。生物化学科学趋势。2007;32:477–485.[公共医学][谷歌学者] 19.Huppert SS、Le A、Schroeter EH、Mumm JS、Saxena MT等。Notch1加工缺陷等位基因纯合小鼠的胚胎致死率。自然。2000;405:966–970.[公共医学][谷歌学者] 20Armogida M，Petit A，Vincent B，Scarzello S，da Costa CA等。早老素缺乏的胚胎小鼠成纤维细胞中内源性β淀粉样蛋白的产生。自然细胞生物学。2001;三:1030–1033.[公共医学][谷歌学者] 21Dontu G、Jackson KW、McNicholas E、Kawamura MJ、Abdallah WM等。Notch信号在人类乳腺干细胞/祖细胞细胞脂肪测定中的作用。乳腺癌研究。2004;6：R605–615。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 22Farnie G、Clarke RB。乳腺干细胞与乳腺癌——Notch信号的作用。干细胞版次。2007;三:169–175.[公共医学][谷歌学者] 23Fre S、Huyghe M、Mourikis P、Robine S、Louvard D等。Notch信号控制肠道中未成熟祖细胞的命运。自然。2005;435:964–968.[公共医学][谷歌学者] 24.van Es JH、van Gijn ME、Riccio O、van den Born M、Vooijs M等。Notch/gamma-分泌酶抑制将肠隐窝和腺瘤中的增殖细胞转化为杯状细胞。自然。2005;435:959–963.[公共医学][谷歌学者] 25Hitoshi S、Alexson T、Tropepe V、Donovil D、Elia AJ等。Notch通路分子对哺乳动物神经干细胞的维持（但不是生成）至关重要。基因发育。2002;16:846–858. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 26Hitoshi S、Seaberg RM、Koscik C、Alexson T、Kusunoki S等。哺乳动物外胚层原始神经干细胞在Notch信号控制下分化为确定性神经干细胞。基因发育。2004;18:1806–1811. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Nakamura Y、Sakakibara S、Miyata T、Ogawa M、Shimazaki T等。bHLH基因hes1作为CNS干细胞神经元承诺的阻遏物。神经科学杂志。2000;20:283–293. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 28Kanamori M、Kawaguchi T、Nigro JM、Feuerstein BG、Berger MS等。Notch信号激活对人类多形性胶质母细胞瘤的作用。神经外科杂志。2007;106:417–427.[公共医学][谷歌学者] 29Pece S、Serresi M、Santolini E、Capra M、Hulleman E等。Numb over Notch引起的负调控缺失与人类乳腺癌的发生有关。细胞生物学杂志。2004;167:215–221. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30Politi K、Feirt N、Kitajewski J.Notch在乳腺发育和乳腺癌中的研究。Semin癌症生物学。2004;14:341–347.[公共医学][谷歌学者] 31Weng AP、Ferrando AA、Lee W、Morris JPt、Silverman LB等。人类T细胞急性淋巴细胞白血病中NOTCH1的激活突变。科学。2004;306:269–271.[公共医学][谷歌学者] 32Bolos V、Blanco M、Medina V、Aparicio G、Diaz-Prado S等。癌症干细胞中的缺口信号。临床转化肿瘤。2009;11:11–19.[公共医学][谷歌学者] 33.Gal H、Amariglio N、Trakhtenbrot L、Jacob-Hirsh J、Margalit O等。AML衍生干细胞的基因表达谱；与造血干细胞相似。白血病。2006;20:2147–2154.[公共医学][谷歌学者] 34张XP，郑G，邹L，刘HL，侯LH，等。Notch激活促进人脑胶质瘤细胞的增殖和神经干细胞样集落的形成。分子细胞生物化学。2008;307:101–108.[公共医学][谷歌学者] 35Fan X、Matsui W、Khaki L、Stearns D、Chun J等。Notch通路抑制会耗尽干细胞并阻碍胚胎性脑肿瘤的植入。癌症研究。2006;66:7445–7452.[公共医学][谷歌学者] 36Scharpfenecker M、Kruse JJ、Sprong D、Russell NS、Ten Dijke P等。电离辐射改变PAI-1/ID-1平衡并激活内皮细胞中的notch信号。国际放射肿瘤生物学杂志。2009;73:506–513.[公共医学][谷歌学者] 37Wang Z、Li Y、Banerjee S、Sarkar FH。Notch在干细胞和癌症中的新作用。癌症快报。2009;279:8–12. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 38Shu Q，Wong KK，Su JM，Adesina AM，Yu LT等。新鲜手术标本的直接原位移植在髓母细胞瘤和神经胶质瘤的临床相关小鼠模型中保留了CD133+肿瘤细胞。干细胞。2008;26:1414–1424.[公共医学][谷歌学者] 39Bao S，Wu Q，Li Z，Sathornsumetee S，Wang H，等。通过L1CAM靶向肿瘤干细胞抑制胶质瘤生长。癌症研究。2008;68:6043–6048. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 40Eyler CE、Foo WC、LaFiura KM、McLendon RE、Hjelmeland AB等。脑癌干细胞对Akt抑制表现出优先敏感性。干细胞。2008;26:3027–3036. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 41李忠，鲍S，吴强，王华，埃勒C，等。低氧诱导因子调节胶质瘤干细胞的致瘤能力。癌细胞。2009;15:501–513. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 42Wang J，Wang H，Li Z，Wu Q，Lathia JD，等。维持胶质瘤干细胞需要c-Myc。《公共科学图书馆·综合》。2008;三：e3769。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 43Coelho D、Holl V、Weltin D、Lacornerie T、Magnenet P等。Caspase-3样活性决定了MOLT-4人白血病细胞电离辐射后的细胞死亡类型。英国癌症杂志。2000;83:642–649. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 44Essmann F，Engels IH，Totzke G，Schulze Osthoff K，Janicke RU。MCF-7乳腺癌细胞对电离辐射的凋亡抵抗独立于p53和细胞周期控制，但由缺乏胱天蛋白酶-3和咖啡因抑制事件引起。癌症研究。2004;64:7065–7072.[公共医学][谷歌学者] 45Kirsch DG、Doseff A、Chau BN、Lim DS、de Souza-Pinto NC等。Bcl-2的Caspase-3依赖性裂解促进细胞色素c的释放。生物化学杂志。1999;274:21155–21161.[公共医学][谷歌学者] 46Michelin S，del Rosario Perez M，Dubner D，Gisone P.在发育中大鼠大脑神经细胞前体的辐射诱导凋亡中caspase-3的活性增加和参与。神经毒理学。2004;25:387–398.[公共医学][谷歌学者] 47Beel AJ，Sanders CR。γ分泌酶和其他膜内蛋白酶的底物特异性。细胞分子生命科学。2008;65:1311–1334. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 49Fan X、Mikolaenko I、Elhassan I、Ni X、Wang Y等。切口1和切口2对胚胎性脑肿瘤的生长有相反的影响。癌症研究。2004;64:7787–7793.[公共医学][谷歌学者] 50Purow BW、Haque RM、Noel MW、Su Q、Burdick MJ等。Notch-1及其配体Delta-like-1和Jagged-1的表达对胶质瘤细胞的存活和增殖至关重要。癌症研究。2005;65:2353–2363.[公共医学][谷歌学者] 51Kastan MB、Bartek J.Cell-cycle检查站和癌症。自然。2004;432:316–323.[公共医学][谷歌学者] 52Sancar A、Lindsey-Boltz LA、Unsal-Kacmaz K、Linn S.哺乳动物DNA修复的分子机制和DNA损伤检查点。生物化学年度收益。2004;73:39–85.[公共医学][谷歌学者] 53Singh NP，McCoy MT，Tice RR，Schneider EL。单个细胞中低水平DNA损伤定量的简单技术。实验细胞研究。1988;175:184–191.[公共医学][谷歌学者] 54Palomero T、Sulis ML、Cortina M、Real PJ、Barnes K等。PTEN突变缺失诱导T细胞白血病对NOTCH1抑制的抵抗。自然医学。2007;13:1203–1210. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 55Sade H，Krishna S，Sarin A.Notch-1的抗凋亡作用需要T细胞中p56lck依赖的Akt/PKB介导的信号传导。生物化学杂志。2004;279:2937–2944.[公共医学][谷歌学者] 56Oishi K、Kamakura S、Isazawa Y、Yoshimatsu T、Kuida K等。Notch通过不同于调节神经发生的机制促进神经前体细胞的存活。开发生物。2004;276:172–184.[公共医学][谷歌学者] 57Youle RJ，Strasser A.BCL-2蛋白家族：介导细胞死亡的相反活性。Nat Rev Mol细胞生物学。2008;9:47–59.[公共医学][谷歌学者] 58Bae J、Leo CP、Hsu SY、Hsueh AJ。MCL-1S是抗凋亡BCL-2家族成员MCL-1的剪接变体，编码一种仅含有BH3结构域的促凋亡蛋白。生物化学杂志。2000;275:25255–25261.[公共医学][谷歌学者] 59Ban J、Bennani-Baiti IM、Kauer M、Schaefer KL、Poremba C等。EWS-FLI1抑制尤因肉瘤中NOTCH激活的p53。癌症研究。2008;68:7100–7109. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 60Purow BW、Sundaresan TK、Burdick MJ、Kefas BA、Comeau LD等。Notch-1通过p53调节表皮生长因子受体的转录。致癌。2008;29:918–925. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 61Mungamuri SK，Yang X，Thor AD，Somasundaram K。Notch1的生存信号：雷帕霉素（mTOR）依赖性抑制p53的哺乳动物靶点。癌症研究。2006;66:4715–4724.[公共医学][谷歌学者] 62Willers H，Dahm Daphi J，Powell SN。DNA辐射损伤的修复。英国癌症杂志。2004;90:1297–1301. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 63Bolos V、Grego-Bessa J、de la Pompa JL。Notch信号在发育和癌症中的作用。Endocr版本。2007;28:339–363.[公共医学][谷歌学者] 64Nicolas M、Wolfer A、Raj K、Kummer JA、Mill P等。Notch1在小鼠皮肤中起到抑癌作用。自然遗传学。2003;33:416–421.[公共医学][谷歌学者] 65Proweller A，Tu L，Lepore JJ，Cheng L，Lu MM，等。缺口信号受损促进新生鳞癌的形成。癌症研究。2006;66:7438–7444.[公共医学][谷歌学者] 66Grimm D、Streetz KL、Jopling CL、Storm TA、Pandey K等。细胞microRNA/短发夹RNA通路过度饱和导致的小鼠死亡率。自然。2006;441:537–541.[公共医学][谷歌学者] 67Fleisher AS、Raman R、Siemers ER、Becerra L、Clark CM等。针对阿尔茨海默病患者使用γ分泌酶抑制剂产生淀粉样β的第2阶段安全性试验。神经系统科学。2008;65:1031–1038. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 68Wong GT、Manfra D、Poulet FM、Zhang Q、Josien H等。γ-分泌酶抑制剂LY-411575的慢性治疗抑制β-淀粉样肽的生成，并改变淋巴生成和肠细胞分化。生物化学杂志。2004;279:12876–12882.[公共医学][谷歌学者] 69轩尼诗BT、Smith DL、Ram PT、Lu Y、Mills GB。利用PI3K/AKT通路发现抗癌药物。Nat Rev药物发现。2005;4:988–1004.[公共医学][谷歌学者] 70Hambardzumyan D、Becher OJ、Rosenblum MK、Pandolfi PP、Manova-Todorova K等。PI3K通路调节体内髓母细胞瘤放射后血管周围小生境中癌干细胞的存活。基因发育。2008;22:436–448. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 71Arbour N、Vanderuit JL、Le Grand JN、Jahani Asl A、Ruzhynsky VA等。Mcl-1是中枢神经系统发育和DNA损伤后细胞凋亡的关键调节因子。神经科学杂志。2008;28:6068–6078. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 72王JM，赵JR，陈伟，郭美林，颜俊杰，等。抗凋亡基因mcl-1通过含有CREB的转录因子复合物通过磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信号通路上调。分子细胞生物学。1999;19:6195–6206. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 73Imbimbo英国石油公司。阿尔茨海默病：[γ]-分泌酶抑制剂。今日药物发现：治疗策略。2008;5:169–175. [谷歌学者] 74O'Neil J、Calvo J、McKenna K、Krishnamoorthy V、Aster JC等。激活T-ALL小鼠模型中的Notch1突变。鲜血。2006;107:781–785. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 75Rasul S、Balasubramanian R、Filipovic A、Slade MJ、Yague E等。抑制γ-分泌酶可诱导乳腺癌细胞G2/M期阻滞并触发细胞凋亡。英国癌症杂志。2009;100:1879–1888. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 76Curry CL、Reed LL、Golde TE、Miele L、Nickoloff BJ等。γ分泌酶抑制剂阻断Notch激活并诱导Kaposi肉瘤细胞凋亡。致癌物。2005;24:6333–6344.[公共医学][谷歌学者] 77Hallahan AR、Pritchard JI、Hansen S、Benson M、Stoeck J等。SmoA1小鼠模型表明，切口信号对声波刺猬诱导的髓母细胞瘤的生长和存活至关重要。癌症研究。2004;64:7794–7800.[公共医学][谷歌学者] 
