吉西他滨的内在化学耐药性与胰腺癌细胞系中FAK的组成和层粘连蛋白诱导的磷酸化有关

细胞培养、转染和稳定克隆的产生

胰腺癌细胞系均购自ATCC（美国马里兰州罗克维尔）。AsPC-1、Panc-1和BxPC-3在RPMI 1640（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）中生长，补充10%（v/v）热灭活胎牛血清（Gemini Bio-Products，Woodland，CA，US），而MiaPaCa-2细胞在DMEM中生长。所有细胞在含5%CO的增湿大气中保持在37°C₂传代后通过台盼蓝排除法常规检查细胞活力，结果始终>95%。在所有使用Gem或5-FU的实验中，细胞在处理前静置6小时。

线性化pcDNA 6.2-GW/EmGFP-miR载体（Invitrogen）能够通过一个结构体增加单个靶基因的敲除，用于基于载体的RNAi干扰（RNAi）分析。该载体可以使用人巨细胞病毒直接早期启动子在大多数哺乳动物细胞中表达用于RNAi分析的microRNA。靶序列的选择标准如前所述[27]. 按照制造商的说明进行质粒构建。RNAi载体（FAK RNAi1，FAK RNAi2）是通过将退火的DNA寡核苷酸连接到线性化载体中而产生的，用于抑制人类FAK基因（GenBank:{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_153831.2”，“term_id”：“27886591”，“term_text”：“NM_153831.2}NM_153831.2). 控制载体pcDNA 6.2-GW/EmGFP-miR-neg编码mRNA，不针对任何已知脊椎动物基因。FAK RNAi1质粒中的退火寡核苷酸为：

5'TGTGAGAAATTTCTCTCACGCTGGTTGGCCACTGACTGACCAGCGTGAGAAATTTCT3'（顶绞线）

5'CCTGAGAAAATTTCTCACGCTGGTCAGTCAGTCATGCCAAACCAGCGTGGAGAGAAATTTC3'（底部绞线）。

FAK RNAi2质粒中的退火寡核苷酸为：

5'TGTGTTCACCTTCTTCTCTGAGGTGTTTTGGCCACTGACACACCACTCAAAGAGGTGAA 3'（顶股）

5'CCTGTTCACCTTCTTTTGAGGTCAGTCAGTCATTGGCCAAAAACACCTCAGAAAGGTGAAC 3'（底部绞线）。

FRNK是使用以下正向和反向引物从Kenneth M.Yamada博士（美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）善意提供的pRKvsv-FRNK质粒进行PCR扩增的：

5'CCGGATCGATGGAATCCAGAGACAGGCTAC 3'和5'CCG GATTCTCAGTGCCGTGTCTGCCCTA3'。PCR产物经BamHI和EcoRI酶切后克隆到pcDNA3.1中，生成pcDNA3.1-FRNK质粒。空白pcDNA3.1质粒作为对照。

按照制造商的建议，使用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen）瞬时转染细胞。使用标准方案，选择稳定的克隆用于抗杀鼠素（pcDNA 6.2-GW/EmGFP-miR）或G418（pcDNA3.1）[27]. 使用四个单独克隆的池来避免伪影。以转染载体质粒的亲代细胞和细胞池为对照。在功能分析前24小时，从培养基中去除G418或速效杀菌素。

LN上的细胞培养

细胞培养塑料涂有LN（10μg/cm²)在37°C下保持2小时。用PBS将涂有LN的培养皿冲洗三次。在所有使用LN的实验中，在进行实验之前，将细胞血清饥饿24小时。然后将细胞分布在LN包被的（LN）或对照（塑料）孔上，并在SITA培养基（补充有30nM硒、5μg/ml胰岛素、10μg/ml转铁蛋白、0.25%（w/v）BSA、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI 1640）中培养。

蛋白质印迹

按照规定处理细胞，然后使用蛋白酶抑制剂混合片和磷酸酶抑制剂混合片PhosSTOP（德国曼海姆罗氏应用科学公司）在RIPA缓冲液（美国伊利诺伊州罗克福德皮尔斯生物技术公司）中进行裂解。通过BCA测定法（Pierce）测定蛋白质浓度。全细胞裂解物在100°C下热变性10分钟，然后在8-12%梯度SDS-PAGE上运行。SDS-PAGE后，将蛋白质电转移到硝化纤维素膜上，用每个一级抗体进行印迹，在二级抗体中培养，然后用增强化学发光试剂（英国巴克市Amersham Pharmacia Biotech）和BioMax MR-1射线胶片（中国厦门柯达）进行检测。使用图像分析软件image Pro-Plus（Media Controlnetics，Silver Spring，MD，USA）通过密度计对带强度进行半定量分析。

免疫荧光

细胞生长在玻璃盖玻片上，并在室温下用4%多聚甲醛固定20分钟。然后用一级抗pFAK（pY397）抗体孵育固定细胞过夜，用PBS洗涤，并在室温下用与FITC（绿色）结合的二级抗体再次孵育1小时。用Hoechst 33342染色细胞核（蓝色）。将单独与二级抗体孵育的细胞用作对照。盖玻片安装在载玻片上，细胞由徕卡TCS-SP2共焦扫描显微镜观察（德国莱卡微系统海德堡股份有限公司）。

细胞活力测定

MTT法测定细胞活力。对数生长的细胞以每孔5×103的速度在96周的平板中培养，并允许其粘附6小时。然后在没有或存在不同浓度的5-FU或Gem的情况下培养细胞，培养时间如结果所示。处理后，将10μL MTT添加到每个孔中以评估细胞活力，并在37°C下4小时后，将紫蓝色MTT formazan沉淀物溶解在100μL DMSO中，并使用Vmax微孔板分光光度计（加利福尼亚州桑尼维尔市分子器件）在570 nm处测量光密度。每个实验至少重复三次，一式四份。使用Microsoft Excel软件计算抑制细胞增殖50%所需的Gem浓度（IC50），并进行半对数曲线拟合和回归分析。

克隆形成试验

使用软琼脂克隆形成试验评估菌落形成。将0.5 ml RPMI1640（含10%胎牛血清和0.5%琼脂）涂布在24孔板的底部。将平板储存在4°C下，使琼脂冷冻。按照结果中的规定处理细胞，将细胞与含有10%胎牛血清和0.35%琼脂的RPMI1640混合，并将其放置在之前以500个细胞/孔（每组三个孔）制备的24孔板上。然后将板转移到37°C。14-18天后，用显微镜手动计数菌落，并用MTT染色观察菌落。

细胞凋亡的细胞核形态学分析

细胞凋亡是通过核浓缩来判断的。将蒸馏后的载玻片放在6孔板的表面上，然后如上所述涂覆或不涂覆LN。将细胞接种到载玻片上，静置6小时，然后在指定时间内用或不用Gem处理。处理后，用PBS清洗玻片，用4%聚甲醛固定细胞10分钟。再次用PBS冲洗玻片，并向每个玻片中添加0.1 ml浓度为2μg/ml的Hoechst 33342，在室温下黑暗中培养15分钟。用PBS洗涤玻片三次，用Motic荧光显微镜检查细胞并拍照。

流式细胞术检测细胞凋亡

根据制造商的说明，使用Annexin-V-FITC/PI试剂盒（BD），通过FACSCalibur流式细胞仪（BD。

FAK RNAi和FRNK过度表达均降低Panc-1细胞中FAK和Akt的磷酸化

我们使用两种不同的质粒下调具有较高组成型pFAK（pY397）水平的Panc-1细胞中的FAK磷酸化。正如预期的那样，瞬时转染实验表明，这两种方法均可抑制Panc-1细胞中的FAK磷酸化。与非转染和载体转染对照相比，RNAi质粒的瞬时转染（FAK RNAi1和FAK RNAi2）导致FAK蛋白水平下调，随后pFAK（pY397）水平降低（图。​（图3A），3A级)而转染pcDNA3.1-FRNK质粒可降低pFAK水平，而不会改变FAK的总表达（图。​（图3B3B公司).

在单独的窗口中打开

图3

FAK RNAi和FRNK过表达对Panc-1细胞FAK表达和磷酸化的影响Western blot分析显示，瞬时转染FAK RNAi质粒（FAK-RNAi1和FAK-RNAi2）五天（A）或pcDNA3.1-FRNK质粒（FRNK）三天（B）的Panc-1细胞中FRNK、总FAK和pFAK（pY397）的表达。亲代细胞及其各自的载体转染细胞（RNAi载体）作为对照。C、 以短梗霉素为选择标记，获得了来自Panc-1细胞的FAK RNAi2质粒转染（i-Pool 1，i-Clone 3）和载体转染（i vector）克隆。蛋白质印迹显示pFAK（pY397）、p-Akt（pS473）、p-ERK1/2及其总蛋白在细胞中的表达。D、 以G418为选择标记获得pcDNA3.1-FRNK质粒转染（Pool 1，Clone 2）和空载体转染（vector）克隆。Western blot显示pFAK（pY397）、p-Akt（pS473）、p-ERK 1/2及其总蛋白在细胞中的表达。用抗β-肌动蛋白抗体对膜进行探测，以确保每条通道中的蛋白质负载均匀。

获得转染FAK RNAi2、pcDNA3.1-FRNK的Panc-1细胞的单个克隆和池，并检测FAK和pFAK（pY397）的总表达。在稳定克隆中观察到的结果与瞬时转染实验相似（图。3C-D公司). Akt和ERK1/2是FAK下游的两种关键激酶，它们对调节细胞生存至关重要。与pFAK（pY397）水平降低一致，稳定转染FAK RNAi2或pcDNA3.1-FRNK质粒的Panc-1细胞显示Akt磷酸化降低。然而，总Akt、总ERK1/2和pERK1/2的水平没有受到影响。RT-PCR分析还显示，稳定转染FAK RNAi2的Panc-1细胞中FAK mRNA水平降低（数据未显示）。

这些结果证实，FAK RNAi和FRNK过度表达均降低了Panc-1细胞中FAK和下游激酶Akt的磷酸化。为了避免因使用转染细胞的单个克隆而产生伪影，将四个单个克隆池用于进一步的实验。

FAK RNAi和FRNK过度表达增强Gem诱导的Panc-1细胞的细胞毒性和凋亡

通过MTT和克隆试验测定细胞毒性。Gem以时间依赖的方式显著抑制Panc-1细胞的活性（图。​（图4A，4A级，左）。与亲本细胞和载体细胞相比，过表达FRNK的稳定池细胞在增殖方面没有显著差异。然而，过度表达FRNK的池细胞对Gem治疗的敏感性增加。Gem处理72小时后，过度表达FRNK的池细胞的存活率降低约20%（P<0.05）（图。​（图4A，4A级，右侧）。克隆测定也获得了类似的结果（图。​（图4B4B类).

在单独的窗口中打开

图4

FRNK过表达对Gem诱导Panc-1细胞化疗耐药的影响A、在使用或不使用10μM Gem处理24、48和72小时后，通过细胞增殖试验测定亲本Panc-1细胞、空载体转染（vector）细胞和pcDNA3.1-FRNK质粒转染（Pool 1）细胞的细胞活力。结果表示为活细胞与未经Gem处理的亲代细胞相比的百分比（左）。在Gem处理后72小时，对细胞活力进行统计比较。条形代表三个独立实验的平均值±SE.*，P<0.05，与未经Gem处理的亲代细胞相比；#，与使用Gem治疗的亲代或载体细胞相比，P<0.05（右）。B、 将亲代Panc-1细胞、载体和池1细胞用或不用10_MGem处理24小时。然后将细胞胰蛋白酶化并等量接种到24孔板中进行克隆形成分析。14至18天后，计算菌落的平均数量（左）。通过比较各组与未经Gem处理的亲代细胞的菌落数来确定抑制率。条形代表三个独立实验的平均值±SE.*，P（P）<0.05，与未经Gem治疗的亲代细胞相比；^#,P（P）<0.05，与使用Gem治疗的亲代或载体细胞相比（右）。

细胞凋亡被认为是化疗诱导细胞死亡的主要机制[28]. 我们进一步确定了FRNK过表达对Gem诱导的Panc-1细胞凋亡的影响。通过细胞核的Hoechst染色、外化磷脂酰丝氨酸的Annexin-V分析和裂解caspase-3蛋白的western blot分析来分析细胞凋亡（图。5A-D型). 与对照组相比，过表达FRNK的池细胞对Gem诱导的凋亡更敏感，表现为浓缩细胞核比例增加，Annexin-V阳性率显著升高（P<0.05），caspase-3蛋白表达更为裂解。然而，在缺乏Gem的情况下，FRNK过度表达并没有显著影响Panc-1细胞的凋亡。凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、BAD和survivin均被证明参与胰腺癌细胞的化疗耐药性，并受FAK或Akt的调节[29-33]. 因此，我们研究了FRNK过度表达对FAK活性的抑制是否可以调节这些蛋白，从而调节Panc-1细胞的凋亡。与亲代细胞和载体细胞相比，转染pcDNA3.1-FRNK的克隆2和池1细胞在Ser136处的survivin表达和Bad磷酸化降低，但不影响Bax、Bcl-2或Bad表达或Ser112处的Bad磷酸化度（图。​（图5E）。第五版). 在稳定转染FAK RNAi2质粒的Panc-1细胞中也获得了类似的结果（数据未显示）。

在单独的窗口中打开

图5

FRNK过表达对Gem诱导Panc-1细胞凋亡的影响用或不用10μM Gem处理亲代Panc-1细胞、空载体转染（vector）细胞和pcDNA3.1-FRNK质粒转染（Pool 1）细胞72 h，并通过Hoechst染色进行细胞凋亡分析（箭头表示凋亡细胞）（A）、Annexin-V标记的流式细胞术分析（B）以及裂解caspase-3蛋白表达的western blot分析（C）。条形代表三个独立实验的平均值±SE.*，P（P）<0.05，与未经Gem治疗的亲代细胞相比；^#与双亲细胞或载体细胞进行Gem治疗相比，P<0.05。D、 Western blot分析检测亲本细胞、载体和池1细胞中Bad、p-Bad（pS136）、p-Bat（pS112）、Bcl-2、Bax和survivin的表达。用抗β-肌动蛋白抗体对膜进行探测，以确保每条通道中的蛋白质负载均匀。

这些结果清楚地表明，抑制构成性FAK磷酸化足以使Panc-1细胞对Gem更敏感。这表明组成型pFAK至少部分负责胰腺癌细胞系中的Gem化学耐药性，并表明其机制可能与生存素的表达和pBad（pS136）水平有关。

LN诱导AsPC-1细胞FAK及其下游激酶Akt磷酸化

将FAK磷酸化水平较低的AsPC-1细胞在SITA培养基中在LN上培养不同时间。然后检测细胞中FAK、Akt和ERK磷酸化水平（图。6A-B型). 在AsPC-1细胞中发现低水平的组成性激活的FAK和Akt，LN可快速强烈地刺激FAK和Ekt磷酸化。磷酸化FAK和Akt水平在粘附LN后15 min开始升高，1 h达到峰值，24 h后下降。相比之下，AsPC-1细胞中磷酸化ERK的基础水平显著，LN未引起显著变化。LN对AsPC-1细胞总FAK、Akt、ERK蛋白和pERK水平均无显著影响。

在单独的窗口中打开

图6

LN对AsPC-1细胞FAK磷酸化及其下游信号激酶（Akt和ERK1/2）活性的影响A，AsPC-1细胞按结果所述处理指定时间，然后进行western blot分析以检测pFAK（pY397）、p-Akt（pS473）、p-ERK1/2及其总蛋白的表达。用抗β-肌动蛋白抗体对膜进行探测，以确保每条通道中的蛋白质负载均匀。B、 对于半定量，使用密度计计算每个细胞系的谱带强度。条形图是三个独立实验的相对pFAK/FAK、pAkt/Akt或pERK/ERK比值的平均值±SE（归一化为0 min，其值为1）。

为了确定LN在AsPC-1细胞中诱导的Akt活化是否依赖FAK，获得转染FAK RNAi2、pcDNA3.1-FRNK或其各自的载体对照的池细胞。通过FAK RNAi或FRNK过度表达抑制FAK磷酸化几乎完全阻断了LN对Akt激活的影响（图。7A-B型).

在单独的窗口中打开

图7

FAK-RNAi和FRNK过表达对LN介导的FAK和Akt活化的影响在塑料或LN上移植1 h后，收集亲本AsPC-1细胞和FAK RNAi2转染的池细胞（i-pool）（A）、pcDNA3.1-FRNK转染的池细胞（pool）和它们各自的载体转染克隆（i-vector，vector），并用western blot分析检测pFAK（pY397）、p-Akt（pS473）的表达以及它们的总蛋白。用抗β-肌动蛋白抗体对膜进行探测，以确保每条通道中的蛋白质负载均匀。

这些结果表明，在AsPC-1细胞中，LN以时间依赖的方式诱导FAK和Akt磷酸化，而LN诱导的Akt磷酸化是通过FAK激活介导的。

LN抑制Gem诱导的AsPC-1细胞的细胞毒性和凋亡

我们的结果表明，LN以时间依赖性的方式保护AsPC-1细胞免受Gem诱导的细胞毒性作用的影响，并且在Gem治疗后72小时的保护作用最为明显（图。​（图8A）。8安). 集落形成试验证实了LN对Gem诱导的细胞毒性的保护作用（图。​（图8B8B类).

在单独的窗口中打开

图8

LN对Gem诱导AsPC-1细胞毒性的影响AsPC-1细胞按结果处理。A、 MTT法测定不同组AsPC-1细胞的细胞活力。结果表示为活细胞与未经Gem处理的塑料上细胞的百分比（左）。在Gem治疗后72小时，对细胞活力进行统计比较（右）。B、 通过克隆形成试验评估胰腺癌细胞的长期克隆形成潜能。将塑料或LN上的AsPC-1细胞在SITA培养基中加入或不加入Gem（0.1μM）处理24 h。然后将细胞胰酶化并等量接种到24孔板中。14至18天后，计算菌落的平均数，并通过比较各组与未经Gem处理的塑料上细胞的菌落数来确定抑制率。

此外，Gem处理后，与塑料上的细胞相比，LN上的AsPC-1细胞凋亡减少（P<0.05）（图。9A-C型). 数据还显示，未经Gem处理的LN对细胞凋亡没有显著保护作用。

在单独的窗口中打开

图9

LN对Gem诱导AsPC-1细胞凋亡的影响AsPC-1细胞按结果处理。Gem治疗72 h后，通过Hoechst染色（箭头表示凋亡细胞）（A）、Annexin-V标记的流式细胞术分析（B）和裂解caspase-3蛋白表达的western blot分析（C）检测细胞凋亡。条形代表三个独立实验的平均值±SE.*，P<0.05，与未经Gem处理的塑料细胞相比；#，与Gem处理的塑料上的细胞相比，P<0.05。

LN还导致survivin的表达和Bad在Ser136的磷酸化增加，但不影响AsPC-1细胞中Bax、Bcl-2或Bad的表达或Ser112的Bad磷酸化（图。10天).

在单独的窗口中打开

图10

FRNK过表达对LN介导的Gem耐药的影响用Gem（0.1μM）处理亲代AsPC-1细胞、载体转染（vector）和pcDNA3.1-FRNK转染（Pool）克隆72 h。通过Hoechst染色（箭头表示凋亡细胞）（A）、Annexin-V标记的流式细胞术分析（B）检测细胞凋亡以及裂解的胱天蛋白酶-3蛋白表达的蛋白质印迹分析（C）。条形代表三个独立实验的平均值±SE.*，P<0.05，与塑料上的亲代细胞相比；#，与LN上的亲代细胞或载体细胞相比，P<0.05。D、 在LN上放置24 h后，采用western blot分析检测Bad、p-Bad（pS136）、p-Ba德（pS112）、Bcl-2、Bax和survivin在亲代AsPC-1细胞以及LN上的载体和池克隆中的表达。以塑料上的亲代细胞作为对照。用抗β-肌动蛋白抗体探测膜，以确保每个通道中的蛋白质负载均匀。

总之，这些发现表明LN可能介导AsPC-1细胞对Gem的固有化疗耐药性。

FAK RNAi和FRNK过表达对LN介导的AsPC-1细胞Gem耐药的影响

当在LN上培养时，表达FRNK的池细胞与亲代细胞和载体细胞相比，显示出Gem诱导的凋亡显著增加（P<0.05）（图。10安-C). 然而，FRNK过度表达并没有显著影响Gem诱导的塑料上AsPC-1细胞的凋亡（图。10亿). 此外，FRNK过度表达对FAK磷酸化的抑制拮抗了LN对AsPC-1细胞中survivin表达和Ser136 Bad磷酸化的影响（图。10天). FAK RNAi在AsPC-1细胞中也观察到类似结果（数据未显示）。这些结果表明，在AsPC-1细胞中，LN诱导的FAK磷酸化介导了对Gem的内在耐药，这种效应可能与调节survivin和pBad（pS136）水平有关