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单元格。作者手稿；PMC 2010年6月12日提供。
以最终编辑形式发布为：
单元格。2009年6月12日；137（6）：1062–1075。
数字对象标识：2016年10月10日/j.cell.2009.03.048
预防性维修识别码：PMC2802318型
NIHMSID公司：NIHMS108746号
PMID：19524509

自噬通过消除p62抑制肿瘤发生

罗宾·马修,1,5,8 克里斯蒂娜·卡普,三，5,8 布莱恩·博登,2,三 Nhan Vuong公司,三 陈光华,2 陈心怡,三 凯文·布瑞,三 阿努帕马·雷迪,6 吉安·巴诺特,三，5,7 赛琳·吉利纳斯,1,2 罗伯特·迪保拉（Robert S.DiPaola）,4,5 瓦西里基·卡兰扎·沃德沃思,4,5和艾琳·怀特1,2,三，5
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总结

必需自噬基因的等位基因缺失贝克林1发生在人类癌症中，并使小鼠容易发生肿瘤，这表明自噬是一种肿瘤抑制机制。虽然肿瘤细胞利用自噬来抵抗代谢应激，但自噬也减轻了可能限制肿瘤发生的细胞损伤。在应激反应中，自噬缺陷的肿瘤细胞优先积累p62/SQSTM1（p62）、内质网（ER）伴侣、受损线粒体、活性氧（ROS）和基因组损伤。此外，抑制ROS或p62积累可防止自噬缺陷导致的损伤，这表明未能调节p62会导致氧化应激。重要的是，自噬缺陷导致的p62持续表达足以改变NF-κB调节和基因表达，并促进肿瘤发生。因此，缺陷自噬是人类肿瘤中常见的p62上调机制，可能通过干扰p62控制肿瘤发生关键途径的信号转导适配器功能，直接导致肿瘤发生。

关键词：自噬、beclin1、atg5、基因组不稳定性、p62、NF-κB、DNA损伤、癌症

简介

大自噬（自噬）以细胞蛋白质、蛋白质聚集体和细胞器为目标，在溶酶体中降解(莱文和克罗默，2008年). 自噬是由饥饿或应激诱导的，双膜小泡（自噬体）捕获细胞内物质，然后与溶酶体融合并降解。这种溶酶体介导的细胞自我消化在饥饿期间维持细胞新陈代谢，并消除应激期间积累的受损蛋白质和细胞器。在小鼠中，自噬通过防止能量消耗，使其能够存活到新生儿饥饿状态(Kuma等人，2004年). 脑靶向自噬缺陷(第5天−/−或第7天−/−)导致线粒体受损和含多泛素的蛋白质聚集体积聚，以及神经元变性(Hara等人，2006年;小松等人，2006年). 肝靶向自噬缺陷(第7天−/−)同样导致蛋白质聚集、肝细胞死亡和肝损伤(小松等人，2005年). 这些发现支持了自噬在维持能量平衡和维持蛋白质和细胞器质量控制中的前生存作用，即在应激和衰老过程中消除受损的蛋白质和细胞器官(莱文和克罗默，2008年).

自噬是由缺氧肿瘤区域诱导并定位于其支持细胞生存的区域(Degenhardt等人，2006年;Karantza Wadsworth等人，2007年;Mathew等人，2007b). 自相矛盾的是，等位基因丢失导致自噬缺陷贝克林1或自噬抑制PI-3激酶/mTOR通路的组成性激活在人类肿瘤中很常见(莱文和克罗默，2008年). 自噬存活率的丧失如何促进肿瘤生长正在逐渐得到解决(Jin and White，2007年,2008;Mathew等人，2007年a).

类似于伤口愈合反应，对应激和炎症诱导以及细胞因子产生的慢性细胞死亡可能提供一种非细胞自主机制，自噬缺陷通过该机制促进肿瘤发生(Degenhardt等人，2006年). 自噬缺陷肿瘤细胞在应激时也表现出较高的基因组损伤，这表明自噬减轻损伤是肿瘤抑制的细胞自主机制(Karantza-Wadsworth等人，2007年;Mathew等人，2007年a;Mathew等人，2007b). 自噬限制细胞损伤的可能非互斥机制包括维持能量平衡、减少氧化应激和消除受损蛋白质和细胞器。

自噬在细胞垃圾处理中的重要性显而易见，因为自噬是细胞器和蛋白质聚集体等大细胞结构转换的唯一已知手段(莱文和克罗默，2008年). 细胞器是如何被识别并导向自噬体进行降解的尚不清楚，但可能涉及细胞器特异性过程，如有丝分裂和内质网吞噬(Bernales等人，2006年;Kim等人，2007年). 应激过程中积累的受损蛋白质可以通过蛋白酶体途径折叠、泛素化和降解，也可以通过自噬聚合和降解。为了将受损或未折叠的蛋白质引导至自噬途径，p62通过寡聚作用与多泛素化蛋白质和聚集体结合，并与自噬体膜上的Atg8/LC3结合，将聚集体靶向自噬小体进行降解(图1A) (Pankiv等人，2007年;Wooten等人，2008年). 蛋白质聚集可能是一种通过隔离限制细胞接触有毒蛋白质的保护机制，也是一种收集和引导受损蛋白质进入自噬体的有效包装和传递机制。小鼠肝脏特异性自噬缺陷导致p62聚集物积聚、氧化应激和p62依赖性肝细胞死亡(小松等人，2007年). 因此，不能通过自噬消除p62可能对正常组织有毒，但这是否与自噬抑制肿瘤有关尚不清楚。

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代谢应激下自噬缺陷肿瘤细胞中p62持续升高

（A） p62的结构域组织说明Phox和Bem1p（PB1）寡聚化结构域（p62和非典型蛋白激酶C[aPKC]）、锌指（ZZ）Rip 1结合结构域、TRAF6结合位点（TBS）、微管相关蛋白轻链3（LC3/ATG8结合）结构域和泛素相关（UBA）（多-泛素结合）。

（B） 在正常生长条件下（第0天）、代谢应激7天（第7天），内源性p62的IF显示p62在自噬缺陷细胞中的积累和持续我)，和1（第7+1天R（右）)和2（第7+1天R（右）)恢复天数。

（C） 自噬缺陷细胞表达较高水平的外源性Myc-p62。六个表达Bcl-2的独立细胞系第5天+/+和atg5型−/−通过免疫印迹法和Myc标记抗体评估稳定表达Myc-tagged p62的iBMK细胞的p62表达水平。

我们在此报告，代谢应激导致自噬缺陷肿瘤细胞优先积聚p62、ER伴侣和蛋白二硫键异构酶（PDI），表明蛋白质质量控制失败。此外，自噬缺陷导致受损线粒体的积累、氧化应激升高和DNA损伤反应激活，这直接归因于p62的持续存在。ROS清除剂或p62消除抑制了由缺陷自噬引起的细胞毒性效应，表明p62的持续存在和氧化应激导致细胞损伤。自噬缺陷细胞清除p62的失败足以改变NF-κB的调节和基因表达，并促进肿瘤发生，表明自噬通过限制p62的积累抑制肿瘤发生。p62在人类肿瘤中通常上调(Zatloukal等人，2007年)，这是由于自噬缺陷，在癌症中起着因果作用。

结果

自噬缺陷肿瘤细胞在应激反应中积累p62

为了探讨自噬依赖性蛋白质量控制在肿瘤抑制中的作用，我们评估了代谢应激期间p62的调节和自噬活性恢复(贝克林1+/+和第5天+/+)和-有缺陷(贝克林1+/−和第5天−/−)永生化小鼠幼肾（iBMK）细胞。设计细胞表达Bcl-2，因为在凋亡缺陷的背景下促进了自噬的评估，并且Bcl-2的表达在自噬调节和肿瘤发生的背景下与Bax和Bak的丢失在功能上等价(Degenhardt等人，2006年;Lum等人，2005年;Nelson等人，2004年). 在正常生长条件下，通过间接免疫荧光（IF）检测，内源性p62水平较低贝克林1+/+和第5天+/+细胞并在自噬缺陷的iBMK细胞中轻度升高(图1B). 在代谢应激7天后，p62在贝克林1+/+和第5天 +/+细胞，并在自噬缺陷细胞中进一步升高，呈点状，表明聚集。在贝克林1+/+和第5天+/+细胞p62在恢复后24小时内被清除，而p62在自噬缺陷细胞中持续存在，通常以聚集体形式存在(图1B). 自噬缺陷患者p62水平较高第5天−/−与相比第5天+/+稳定表达myc-tagged p62（myc-p62）的iBMK细胞(图1C). 因此，代谢应激诱导的p62积累需要自噬才能消除，这与p62基因诱导在贝克林1+/−和atg5型−/−肿瘤（见下文）。

自噬缺陷肿瘤细胞积聚受损的线粒体、ER伴侣和PDI

细胞凋亡缺陷第5天+/+iBMK细胞通过进行自噬来应对长期的应激，产生的细胞小于其原始大小的三分之一(Degenhardt等人，2006年)线粒体（M）和ER（E）保存完好(图2A和2C). 相反，Bcl-2表达第5天−/−(图2B)和贝克林1+/−（数据未显示）iBMK细胞含有结构异常的线粒体（M）和类似蛋白质聚集体的异常细胞质结构（A）(图2B和2D)，与p62积累一致(图1B). 因此，在代谢应激期间，自噬起着防止受损细胞器和蛋白质聚集体积聚的作用。

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代谢应激促进自噬缺陷细胞的细胞器损伤、ER伴侣和PDI上调

表达Bcl-2的代表性电子显微照片第5天+/+（A） 或第5天−/−（B） 代谢应激7天后的细胞。表达Bcl-2第5天+/+iBMK细胞（A）显示线粒体（M，蓝色箭头和C，左侧）、ER（E，红色箭头和C）、（B）中的突变细胞显示线粒体（M，蓝色箭头，D，左侧）和蛋白质聚集体（A，黄色和D，右侧）。

（E和F）2-DIGE凝胶显示Bcl-2表达中ER伴侣（GRp170、GRp78）、PDI、PDI-P4Hβ和ACO2的差异调节第5天−/−iBMK细胞对代谢应激的反应（7天）。非应激或代谢应激（7天）表达Bcl-2的总蛋白第5天+/+和第5天−/−细胞系用Cy3（绿色-抑制）或Cy5（红色-抑制）标记并用2-DIGE分析。图片显示，2-DIGE凝胶中的蛋白质在代谢应激下被诱导（红色）、抑制（绿色）或不变（黄色）。选择差异表达的蛋白质点（n=106）并通过质谱鉴定。

由于自噬缺陷的肿瘤细胞显示出蛋白质质量控制失败，我们采用双向差异凝胶电泳（2-DIGE）结合质谱来表征细胞蛋白质组。自噬性，凋亡缺陷(bax（巴克斯）−/−/巴克−/−)D3 iBMK细胞通过激活自噬来管理长期代谢应激(Degenhardt等人，2006年)并诱导ER伴侣（葡萄糖调节蛋白170[GRp170和GRp78]和钙网织蛋白）、PDIs、代谢和线粒体蛋白(表S1). 其中一些蛋白质（TPI-1、PGK-1、PK-3和GPDH）是低氧诱导因子-1α（HIF-1α）的靶点，指示代谢适应(表S1)和HIF-1α在iBMK细胞中由体外代谢应激和体内肿瘤诱导(Nelson等人，2004年). 类似地，表达Bcl-2的自噬活性贝克林1+/+和atg5型+/+iBMK细胞诱导ER伴侣GRp170、GRp78、钙网蛋白和钙连蛋白，表明代谢应激反应独立于凋亡失活手段(图2C和2D,表S1). 为了确定自噬状态是否改变了这种应激反应，Bcl-2表达、凋亡和自噬缺陷(贝克林1+/−和第5天−/−)iBMK细胞也进行了类似的检查。与对照组相比，自噬缺陷细胞优先上调ER伴侣蛋白贝克林1+/+和第5天+/+单元格(图2E和2F,表S1). 等位基因缺失贝克林1与GRp170、GRp78、钙网蛋白和钙连蛋白的显著差异性增加相关，而第5天−/−与具有自噬能力的对照组相比，细胞显示GRp170、GRp78和calnexin的差异性增加(表S1). GRp170水平在自噬活性（D3，贝克林1+/+和第5天+/+)而自噬缺陷的诱导倍数为20倍(贝克林1+/−和第5天−/−)代谢应激下的细胞(图2F,表S1). 在贝克林1+/−和第5天−/−单元格(表S1). 参与内质网折叠蛋白的PDI家族成员（PDI和PDI-P4Hβ）在代谢应激下被诱导，并因自噬缺陷而进一步升高(图2E和2F,表S1). 代谢应激缺乏钙网蛋白和PDI-P4Hβ的诱导atg5型−/−iBMK细胞(表S1)可能是因为他们对代谢应激的敏感性增加(Mathew等人，2007年b). 有趣的是，在所有细胞系中，细胞骨架和蛋白质合成相关蛋白的水平都受到压力的抑制(表S1). 应激下自噬缺陷细胞中蛋白质折叠机制的诱导增强表明，自噬通过溶酶体降解消除未折叠蛋白，在缓解内质网应激中发挥作用。

由于单个蛋白质可以在2-DIGE中用多个斑点来表示，使得通过斑点体积比来估计蛋白质水平变得复杂，因此定量通过Western blotting进行验证。p62和ER伴侣GRp170、GRp78、calnexin和PDI在贝克林1+/−和atg5型−/−与相比贝克林1+/+和第5天+/+压力下的细胞(图3A)与p62 IF和蛋白质组分析一致。与p62一样，这些蛋白的升高或持续水平在第5天−/−和贝克林1+/−单元格(图3A)支持自噬缺陷提高了在恢复期间持续的代谢应激下对蛋白质折叠的需求。

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自噬缺陷促进体内肿瘤内质网应激和DNA损伤反应增强

（A） 蛋白质印迹显示Bcl-2表达的p62、ER伴侣、PDI和泛素水平贝克林1+/+,贝克林1+/−,第5天+/+和第5天−/−iBMK细胞经过5或7天的代谢应激，以及1和2天的恢复。低于条带的值表示与各组第一条通道中的基础蛋白水平相比的相对信号强度（未经处理的Bcl-2表达贝克林1+/+和第5天+/+控制）。

（B–D）等位基因缺失贝克林1选择性地使细胞对内质网应激和蛋白酶体抑制敏感。MTT分析显示Bcl-2表达的敏感性贝克林1+/+（蓝色）和贝克林1+/−（红色）iBMK细胞对（B）衣霉素（3天）、（C）环氧霉素（2天）和（D）浓度增加的代谢应激反应。数据以平均值±标准差表示。

（E） 自噬缺陷导致线粒体损伤。显示Bcl-2表达中线粒体蛋白（ACO2、LON、SOD2和PRDX3）水平的蛋白质印迹贝克林1+/+,贝克林1+/−,atg5型+/+和第5天−/−代谢应激后的iBMK细胞。

（F） 以下方面的不足第5天iBMK细胞促进肿瘤发生。肿瘤移植物的生长第5天+/+（红色），第5天+/−（黄色）和第5天−/−裸鼠（蓝色）iBMK细胞系。

（G） 以下方面的不足第5天与有缺陷的凋亡协同促进肿瘤生长。表达Bcl-2的肿瘤异体移植生长第5天+/+（红色），和第5天−/−裸鼠（蓝色）iBMK细胞系。

（H） Western blot显示Bcl-2表达的p62和ER伴侣及PDI升高第5天+/+和第5天−/−iBMK肿瘤

（一） 肺组织、心脏组织和自发性肺肿瘤中p62和GRp170水平升高贝克林1+/−老鼠。两名1.5岁儿童的肺、心脏和自发性肺肿瘤切片贝克林1+/+和四个1.5岁的孩子贝克林1+/−IHC对小鼠进行p62和GRp170染色。通过学生t检验（肺）或曼氏检验（心脏）对切片进行独立评分和分析，p<0.05具有统计学意义。

（J） 肝组织中p62和GRp170升高，自发性肝肿瘤中p62、Mallory-Denk小体（H&E，箭头）和γ-H2AX（箭头）升高贝克林1+/−小鼠（1.5岁）。通过学生t检验对截面进行独立评分和显著性分析（p<0.05）。

（K） 人肝癌中p62、GRp170和γ-H2AX阳性细胞核升高。来自人类肝脏TMA的代表性图像（46个样本），显示H&E、p62、GRp170和γ-H2AX在HCC中的积聚。显示了来自正常人类肝脏TMA（14个样本）的代表性图像以进行比较。通过学生t检验对截面进行独立评分和显著性分析（p<0.05）。

自噬缺陷导致对内质网应激的敏感性

由于自噬缺陷上调了蛋白质折叠调节因子，我们比较了贝克林1细胞对ER应激的药理学诱导。衣霉素通过抑制蛋白糖基化和等位基因丢失诱导内质网应激贝克林1对这种药物的敏感性增加(图3B). 为了研究自噬缺陷是否也增加了泛素-蛋白酶体系统的负担，评估了蛋白酶体抑制剂环氧霉素的敏感性。自噬缺陷对蛋白酶体抑制敏感，代谢应激增加了这种敏感性(图3C和3D)提示自噬缺陷细胞对蛋白酶体途径的依赖性增加。因此，自噬与泛素-蛋白酶体途径协同维持蛋白质质量控制，与蛋白酶体功能抑制一致，蛋白酶体功能激活自噬，抑制自噬促进细胞死亡(丁等人，2007).

电镜（EM）显示自噬缺陷细胞中形态异常的线粒体优先堆积(图2A–2D)和压力第5天−/−细胞表现出线粒体蛋白如乌头糖（ACO2）的异常调节(图2E和2F)与线粒体退化一致。ACO2易受线粒体氧化应激影响，氧化后会稳定或降解(Fariss等人，2005年). 自噬缺陷细胞增加(贝克林1+/−)或减少(第5天−/−)与具有自噬能力的对照组相比，代谢应激7天后的ACO2水平(图3E). 此外，LON降解ACO2的氧化形式(Fariss等人，2005年)，在代谢应激下增加，其他氧化应激标记物也增加。线粒体加速退化atg5型−/−与相比贝克林1+/−细胞可能是ACO2、超氧化物歧化酶（SOD2）和过氧化物酶原（PRDX3）在应激7天时减少的原因(图3E). 因此，自噬缺陷与应激下受损线粒体的积累有关。

肿瘤中自噬缺陷上调p62和ER伴侣

为了评估p62、ER伴侣和PDI的差异积累是否也是肿瘤自噬缺陷的特征，Bcl-2表达第5天+/+和第5天−/−、和贝克林1+/+和贝克林1+/−iBMK移植瘤和自发性肿瘤贝克林1+/−对小鼠进行了检查。在iBMK细胞中，等位基因缺失贝克林1(Degenhardt等人，2006年;Mathew等人，2007b)，中的不足第5天增加肿瘤发生并与凋亡缺陷协同促进肿瘤生长(图3F和G). 表达Bcl-2第5天−/−与对照组相比，肿瘤显示p62、GRp170、GRp78、calnexin和PDI升高第5天+/+免疫印迹法检测肿瘤(图3H)Bcl-2表达贝克林1+/−和第5天−/−免疫组织化学（IHC）检测肿瘤（数据未显示）。p62在贝克林1+/−和第5天−/−基因表达分析中确定的肿瘤（野生型和自噬缺陷型肿瘤中p62 mRNA的表达在0.9-1.3倍之间）（数据未显示）。泛素化蛋白上调，尽管在自噬缺陷小鼠的组织中很常见(Hara等人，2006年;小松等人，2006年)，没有罢工第5天−/−肿瘤(图3H). 此外，1.5岁儿童的组织（肺、心和肝）以及自发性肺和肝肿瘤贝克林1+/−与来自贝克林1+/+室友(图3I和3J). 因此贝克林1自噬受损导致ER伴侣水平升高，作为一种补偿机制，这种表型表现在组织和自发性肿瘤中。

虽然p62和ER伴侣蛋白上调在人类肿瘤中很常见，并且与预后不良有关，但其原因尚不清楚(Ni和Lee，2007年;Zatloukal等人，2007年). 人肝细胞癌（HCC）与Mallory-Denk小体中p62的蓄积有关贝克林1+/−小鼠肝脏p62蓄积与脂肪性肝炎和自发性肝肿瘤的关系(图3J) (小松等人，2007年;Qu等人，2003年;Yue等人，2003年)表明自噬缺陷可能在肝癌病因中起着重要作用。事实上，肝脏和自发性肝肿瘤贝克林1+/−与年龄匹配的正常肝组织相比，小鼠的p62、GRp170和DNA损伤反应激活（γ-H2AX）水平也较高贝克林1+/+老鼠(图3J). p62、GRp170和γ-H2AX在组织芯片（TMA）中检测人类肝脏和肝癌。与正常肝脏相比，肝癌中p62、GRp170和γ-H2AX的上调频率较高(图3K). 因此，人类肿瘤中p62和GRp170的积累可能是缺陷自噬的生物标志物，表现为与DNA损伤反应激活相关的未折叠蛋白的积累。此外，自噬缺陷导致的蛋白质和细胞器质量控制失败可能导致具有遗传毒性的氧化应激。

自噬减轻氧化应激和向非整倍体发展

DNA损伤反应的激活是活性氧引起的氧化应激的标志。通过PDI在内质网中重新折叠蛋白质可以通过涉及自由基的氧化还原反应提高氧化应激(Tu和Weissman，2004年)线粒体应激和损伤也可能是活性氧的来源(Fariss等人，2005年)在自噬缺陷细胞中。由于自噬缺陷会导致受损线粒体和氧化蛋白折叠机制的积累，并激活DNA损伤反应，因此我们检测了贝克林1+/+和贝克林1+/−细胞。在正常生长条件下，ROS水平在贝克林1+/−iBMK细胞与贝克林1+/+然而，5天的代谢应激导致细胞内ROS显著增加贝克林1+/−单元格(图4A和4B). 在恢复期间，贝克林1+/−iBMK细胞表现出持续24小时的ROS增加贝克林1+/+单元格(图4A和4B). 因此等位基因丢失贝克林1与应激时活性氧生成增加有关。

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代谢应激促进自噬缺陷细胞ROS生成增加和染色体不稳定性

（A） 自噬不足导致活性氧生成增加。覆盖显示Bcl-2表达的ROS水平贝克林1+/+（绿色）和贝克林1+/−正常生长（0Di）和0.5、1、2.5和24小时时的iBMK细胞（蓝色）（x轴，对数刻度）(贝克林1+/+、绿色箭头和贝克林1+/−，红色箭头）。未经处理的细胞中的ROS水平以虚线显示，以供比较。

（B） 来自三个独立实验的代表性直方图，测量Bcl-2表达的平均活性氧水平贝克林1+/+和贝克林1+/−iBMK细胞如（A）所示。

（C） 清除活性氧可部分缓解代谢应激的易感性，并可因代谢应激的等位基因丢失而恢复贝克林1.表达Bcl-2的典型延时图像贝克林1+/+和贝克林1+/−在活性氧清除剂NAC（1mM）存在（NAC）和不存在（UT）的情况下，经过5天的代谢应激恢复期的iBMK细胞（显示了与时间0相比粘附细胞的相对百分比）。

（D） 清除活性氧抑制自噬缺陷患者p62的积累(贝克林1+/−和第5天−/−)单元格。Bcl-2表达中p62水平的蛋白质印迹分析贝克林1+/+,贝克林1+/−,第5天+/+和第5天−/−iBMK细胞系经过0或7天的代谢应激，然后在无NAC和有NAC的情况下恢复1天。

（E） ROS清除限制了与等位基因缺失相关的非整倍体的进展贝克林1.表达Bcl-2的二倍体DNA含量的流式细胞术分析贝克林1+/+和贝克林1+/−iBMK细胞在存在（蓝色）或不存在（红色）ROS清除剂NAC（1mM）的情况下生长。数字代表决定倍性的传代数。

为了确定自噬缺陷细胞中活性氧的升高是否导致细胞损伤，对无活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）和有活性氧清道夫的应激反应进行了检测。经过5天的代谢应激，贝克林1+/−和第5天−/−与对照细胞相比，iBMK细胞对应激的敏感性增加(图4C和第2页) (Degenhardt等人，2006年;Karantza-Wadsworth等人，2007年;Mathew等人，2007b). 代谢应激期间NAC的存在提高了生存率，并且这种保护作用在贝克林1+/−和第5天−/−细胞，表明活性氧升高导致自噬缺陷细胞对应激的敏感性增加(图4C和第2页). NAC提高的存活率与代谢应激期间p62积累减少有关贝克林1+/−和第5天−/−iBMK细胞(图4D和第2页)表明ROS介导的氧化应激导致蛋白质损伤和p62的积累。与自噬缺陷相关的基因组不稳定性的一个特征是加速发展为非整倍体(Mathew等人，2007b). 为了研究活性氧水平增加对基因组不稳定性的作用，我们监测了早期传代二倍体的DNA含量贝克林1+/+和贝克林1+/−iBMK细胞无NAC和有NAC。贝克林1+/+传代40代后细胞保持二倍体，NAC对其无影响。相反，贝克林1+/−第18代和第39代细胞加速向非整倍体发展(图4E)NAC延缓了这种进展(图4E)，表明基础ROS介导的氧化应激在与自噬缺陷相关的非整倍体进展中的致病作用。因此，代谢应激导致部分由活性氧生成增加介导的p62积聚，而在自噬缺陷细胞中抑制活性氧的失败与基因组不稳定有关。

p62积累激活DNA损伤反应

由于自噬缺陷导致p62积累、氧化应激和加速非整倍体进展，我们检查了p62积累是否足以诱导ROS和DNA损伤反应。瞬时表达的p62-EGFP形成聚集体(图S1B)自噬缺陷患者ROS升高(贝克林1+/−和第5天−/−)但不在贝克林1+/+和第5天+/+iBMK细胞，而仅EGFP表达不表达(图5A和第1部分). 自噬缺陷患者的瞬时p62-EGFP表达也与DNA损伤反应激活（γ-H2AX阳性核灶）相关(贝克林1+/−和第5天−/−)单元格与贝克林1+/+和第5天+/+单元格(图S1B和S1C). 监测p62的积聚和清除，凋亡缺陷第5天+/+和第5天−/−稳定表达EGFP或p62-EGFP的iBMK细胞受到代谢应激后恢复。与内源性p62相同(图1B)和myc-p62(图1C)，p62-EGFP表达第5天−/−iBMK细胞显示由代谢应激诱导的p62聚集，并持续恢复atg5型+/+细胞能够消除(图5B和5C). 与瞬态表达式一致(图S1B)γ-H2AX阳性核病灶表明，稳定的p62-EGFP表达激活了应激和恢复过程中的DNA损伤反应。而DNA双链断裂的γ-H2AX染色特征的焦点模式(Balajee和Geard，2004年)在大多数γ-H2AX阳性细胞核中清晰可见，也有细胞核显示均匀的γ-H2AX染色，表明DNA损伤水平的变化。第5天−/−表达EGFP的iBMK细胞显示出与第5天+/+正常情况下的细胞，但更引人注目的是，在压力和恢复后。p62-EGFP的表达增加了中心体异常和多极分裂，这些在应激和恢复时更为显著第5天−/−与相比第5天+/+单元格(图S1E和S1F). 因此，p62的积累足以在代谢应激下诱导活性氧和DNA损伤反应，导致细胞分裂异常和自噬缺陷细胞的基因组不稳定。事实上，代谢应激期间RNAi介导的p62敲低降低了自噬缺陷患者的DNA损伤诱导贝克林1+/−和第5天−/−iBMK细胞，进一步表明p62消除受损是DNA损伤反应激活的原因(图5D–5F).

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不能通过自噬消除p62激活DNA损伤反应

（A） p62表达导致自噬缺陷的ROS生成增加贝克林1+/−细胞。表达Bcl-2贝克林1+/+和贝克林1+/−用myc标记的p62或对照载体转染iBMK细胞，转染后第3天通过流式细胞仪测定ROS水平（DCF-DA）。右边的柱状图代表了三个独立实验，测量转染后第1天和第3天每个细胞系中的平均ROS水平。

（B） 代谢应激下自噬未能消除p62导致DNA损伤反应诱导。表达Bcl-2第5天+/+或第5天−/−稳定表达EGFP或p62-EGFP的iBMK细胞受到3天的代谢应激，使其恢复（1天）并进行γ-H2AX染色。

（C） （B）所示细胞中γ-H2AX阳性病灶细胞百分比的定量。200个细胞的数据表示为平均值±标准偏差。

（D） p62的RNAi敲除的蛋白质印迹。表达Bcl-2的野生型(贝克林1+/+和atg5型+/+)和自噬缺陷(贝克林1+/−和第5天−/−)用Lamin-或p62-siRNA转染iBMK细胞，并承受代谢应激0、24、48或72小时（分别为转染后24、48、72和96小时），然后分析p62水平。

（E） p62在自噬缺陷细胞中的积累负责激活DNA损伤反应。评估（D）中的细胞的γ-H2AX阳性核灶。

（F） 根据（E）中所示的数据定量γ-H2AX阳性细胞核的细胞百分比。200个单元格的数据表示为平均值±SD。

p62促进自噬缺陷细胞的肿瘤发生

由于p62在自噬缺陷小鼠和人类癌症的组织和肿瘤中积累，我们测试了p62是否直接导致肿瘤发生。细胞凋亡缺陷第5天+/+和第5天−/−表达EGFP或p62-EGFP的iBMK细胞系(图6A)对其致瘤潜力进行了评估。p62-EGFP在第5天+/+细胞系并没有显著增加肿瘤生长(图6B). 相反，p62-EGFP在第5天−/−与表达EGFP的细胞相比，肿瘤生长显著增加第5天−/−控件(图6B). 与EGFP-表达相反第5天−/−肿瘤呈弥漫性胞质EGFP定位，细胞核大小均匀，偶尔出现肿瘤巨细胞，p62-EGFP表达第5天−/−H&E染色显示肿瘤中p62聚集显著，大量多形性肿瘤细胞具有异色、巨核，提示多倍体和非整倍体(图6D). p62-EGFP表达中p62的持续积累第5天−/−与EGFP表达相比，肿瘤还与DNA损伤反应诱导（γ-H2AX）升高有关第5天−/−肿瘤(图6D)这表明不能通过自噬清除p62促进了肿瘤生长，增加了DNA损伤和基因组不稳定性。

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p62表达与自噬缺陷协同作用促进肿瘤生长

（A） 表达Bcl-2的EGFP的Western blot第5天+/+和atg5型−/−iBMK细胞稳定表达EGFP或p62-EGFP。

（B） （A）中细胞系的肿瘤生长显示p62-EGFP表达的肿瘤生长增强第5天−/−肿瘤（红色）与对照载体（黄色）相比。

（C） 显示注射p62-EGFP-和表达EGFP的荷瘤小鼠的面板（右面板）atg5型−/−注射后第74天取自（B）的iBMK细胞。

（D） 表达p62-EGFP的肿瘤第5天−/−细胞与p62聚集体、多态性核和γ-H2AX阳性核相关。肿瘤冷冻切片（左）和石蜡包埋切片的代表性显微照片，用H&E（中）或IHC染色，检测γ-H2AX（右）[学生t检验显著性（p<0.05）]第5天−/−单元格如（C）所示。

除了在结合和靶向多泛素化蛋白与自噬体以进行溶酶体降解方面的作用外，p62还通过与TRAF6和RIP1的相互作用，在RANKL、TrkA和aPKC通路中调节NF-κB信号转导的衔接蛋白中发挥作用(Moscat等人，2007年;Wooten等人，2008年). 为了解决在自噬缺陷细胞中解除p62调控改变癌症信号通路的可能性第5天−/−表达EGFP和EGFP-p62的iBMK肿瘤(图6). 在评估的14000个基因中，893个基因（p=0.05）在EGFP中显示出与EGFP-p62表达的肿瘤不同的表达，并进一步接受了Ingenuity Pathway Analysis（IPA）和Gene Set Enrichment Analysis（GSEA）(图7A,补充表S2和S3). 两项分析均表明，与EGFP表达的肿瘤相比，p62-EGFP中宿主防御途径（包括抗原提呈、Toll样受体和自然杀伤（NK）细胞介导的细胞毒性途径）下调(图7A和补充表S2). 相互作用图分析表明，p62功能丧失所抑制的通路中的一个共同点是NF-κB通路，事实上，与EGFP表达的肿瘤相比，p62-EGFP中NFκB靶基因下调(表S3).

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p62在自噬缺陷细胞中的积累改变了参与宿主和抗氧化防御的信号转导途径

（A） 肿瘤中抑制的通路（p=0.05；黄线）第5天−/−通过IPA（蓝色条）和GSEA（紫色条）分析表达p62-EGFP的iBMK细胞与表达EGFP的细胞的比较。

（B） Bcl-2野生型表达的荧光素酶报告物分析(贝克林1+/+)和自噬缺陷(贝克林1+/−)iBMK细胞显示p62对自噬缺陷细胞中IL-6-荧光素酶报告子（NF-κB活性）的抑制。

（C） Bcl-2表达中的萤光素酶报告基因测定贝克林1+/+iBMK（WB3）细胞显示p62的过度表达足以以浓度依赖的方式抑制NF-κB转录活性。

（D） 肝细胞存活、NF-κB活化和细胞因子产生受损贝克林1+/−肝脏和贝克林1+/−肝脏肿瘤。IHC染色显示肝组织和自发性肝肿瘤中凋亡细胞死亡（活性caspase-3）、NF-κB活化（核p50）和细胞因子产生（TNF-α）水平升高贝克林1−/−老鼠。

（E） 有缺陷的自噬和p62的积累抑制NF-κB的活化并促进HCC。冷冻肝脏切片的代表性显微照片贝克林1+/+和贝克林1+/−和自发性肝癌贝克林1+/−小鼠，免疫染色p62（红色）和p65 NF-κB（绿色），并通过共焦显微镜进行分析。请注意贝克林1+/−积聚p62的肝细胞不显示核p65（黄色箭头），而那些没有p62的则显示p65的核定位，表明NF-κB激活。

（F） 通过限制p62积累，自噬作为肿瘤抑制机制的作用模型。

等位基因缺失贝克林1导致脂肪性肝炎、马洛里体形成（p62聚集）和肝癌(图4E)NF-κB激活物IKK-β或NEMO中肝细胞靶向性缺陷的表现(Luedde等人，2007年;Maeda等人，2005年). 为了验证p62功能增强是NF-κB抑制的原因的假设，在自噬活性(贝克林1+/+和第5天+/+)和自噬缺陷(贝克林1+/−和第5天−/−)iBMK细胞对TNF-α的反应。尽管基础水平相似，但自噬缺陷细胞对TNF-α的反应显示NF-κB活化降低，而p62的表达进一步抑制了NF-κ的活化(图7B、7C和第3章)这表明p62的积累损害了NF-κB的激活。在肝脏中，NF-κB经典途径激活不足导致肝细胞存活受损，Kupffer细胞激活和肝细胞分裂原（Il-6，TNF-α，肝细胞生长因子）产生受损，导致非经典NF-κ的B途径激活和健康肝细胞的代偿性增殖，并导致肝癌。为了测试自噬缺陷和p62积累是否导致相同的表型，在年龄匹配的肝组织中评估p50 NF-κB的核定位，以指示活化贝克林1+/+和贝克林1+/−老鼠。核p50和活性caspase-3在许多贝克林1+/−肝和肝肿瘤肝细胞，但不在贝克林1+/+肝脏(图7D). 同样，p65 NF-κB在贝克林1+/−肝肿瘤肝细胞，但在贝克林1+/+肝组织(图7E). 重要的是，肝细胞中p62的积累是异质性的(图3J).贝克林1+/−积累高p62的肝细胞不显示核p65，而p62较少的肝细胞则显示核定位p65(图7E). 这表明，与IKKβ和NEMO缺陷的肝细胞一样，自噬缺陷和p62的调节失调与典型NF-κB通路的抑制、存活率受损以及通过非典型通路的肝细胞有丝分裂原驱动的肿瘤发生有关。的确，贝克林1+/−肝脏和肝脏肿瘤显示TNF-α生成增加(图7D).

讨论

代谢应激下p62的积累是自噬缺陷肿瘤细胞的一个显著表型，这表明蛋白质质量控制缺陷可能有助于肿瘤的发生，自噬是肿瘤细胞更新p62的主要机制。此外，自噬缺陷的肿瘤细胞无法清除p62，这足以导致肿瘤发生。不像脑组织(Hara等人，2006年;小松等人，2006年)在自噬缺陷的肿瘤细胞中没有多泛素化蛋白的积累。自噬介导的蛋白质消除或通过肿瘤细胞增殖稀释多泛素化蛋白质可能存在组织特异性差异，这可能会阻止其在有丝分裂后神经元中的积聚。另外，与神经组织相比，肿瘤细胞中蛋白酶体介导的多泛素化蛋白周转可能会升高。事实上，自噬缺陷使癌细胞对蛋白酶体抑制剂敏感，表明两种蛋白质降解途径具有代偿功能。

自噬缺陷细胞和肿瘤中p62的持续存在和ER伴侣蛋白的积累以及氧化蛋白折叠机制表明蛋白质周转的管理存在缺陷。无法通过自噬降解受损或错误折叠的蛋白质，可能会增加内质网蛋白折叠机制的负担，导致其上调。p62和GRp170在贝克林1+/−组织以及自发性肿瘤中，表明处理未折叠蛋白可能是肿瘤发生前自噬受损的生物标志物。ER伴侣蛋白和PDI上调在人类肿瘤中很常见(Goplen等人，2006年;Ni和Lee，2007年)GRp170表达增加与乳腺癌预后不良相关(Tamatani等人，2001年). 尽管目前尚不清楚肿瘤中ER伴侣蛋白积聚的原因，但伴侣蛋白具有应激反应性，通过抑制未折叠蛋白的积聚提供保护功能，而未折叠蛋白可能是自噬缺陷细胞的重要补偿机制。蛋白质折叠是氧化应激的来源(Tu和Weissman，2004年)尤其是当细胞被受损和未折叠的蛋白质覆盖时，与应激状态下活性氧增加相一致贝克林1+/−细胞。

应激自噬缺陷的肿瘤细胞积累受损的线粒体，作为氧化应激的潜在额外来源。这种未折叠蛋白质和蛋白质聚集体的积累以及受损线粒体的持续存在可能共同导致自噬缺陷细胞中活性氧的产生增加。活性氧清除剂部分抑制应激状态下p62的积累和细胞死亡贝克林1+/−肿瘤细胞中，氧化应激升高可能导致p62的诱导、细胞损伤和死亡。尽管氧化应激和DNA损伤是通过多种基因毒性事件引起的(Halazonetis等人，2008年)自噬缺陷细胞中的应激介导的p62积累足以诱导ROS和DNA损伤反应，而p62的敲除可阻止这一诱导，从而证明氧化应激升高可直接归因于p62的积累。强化p62表达诱导ROS，表明氧化应激诱导p62积累可能存在一个扩增环，进而放大ROS的生成。因此，自噬缺陷的肿瘤细胞无法清除p62导致氧化应激，并可能导致DNA损伤。这些观察结果与对由以下因素引起的氧化应激毒性的抢救非常相似第7天小鼠肝脏p62缺乏(小松等人，2007年). 在正常组织中，自噬缺陷导致的p62积累引起的毒性可能会触发细胞死亡，而在检查点缺陷的肿瘤细胞中，这也可能导致突变增强、基因组不稳定和肿瘤进展。

第5天−/−肿瘤表现出明显的p62和p62聚集，这种p62表达足以激活DNA损伤反应并促进肿瘤生长。p62表达、p62聚集和含有p62的Mallory-Denk小体在脂肪变性、肝癌和其他癌症中常见(Zatloukal等人，2007年). 自噬缺陷可能是p62持续积累和Mallory-Denk小体形成的机制。因此，p62的积累不仅是某些癌症的组织学标记，而且直接导致肿瘤生长。尽管肝癌自噬缺陷的流行率尚不清楚，但诸如pten（聚四氟乙烯）组成性激活PI3-激酶途径的缺失和抑制自噬的mTOR是常见的(Wong和Ng，2008年). 有趣的是，pten（聚四氟乙烯）(Watanabe等人，2005年),贝克林1，或第7天不足(小松等人，2007年;Qu等人，2003年;Yue等人，2003年)在小鼠中产生肝脏脂肪变性，表明抑制自噬和由此产生的脂肪变性可导致肝癌。

持久性p62如何促进氧化应激和肿瘤发生似乎与其作为调节受体信号传导和NF-κB激活的衔接蛋白的作用有关。p62也是有效激活癌基因所必需的在体外p62缺乏通过K抑制自发性肺肿瘤的发生-ras（拉斯维加斯）(Duran等人，2008年). 因此，p62已被鉴定为两种缺失的癌蛋白-(Duran等人，2008年)和失去功能的情况(图6). p62缺陷自噬导致的功能丧失改变了调节宿主防御的NF-κB信号转导途径。p62是否上调，并如本文所示被隔离在抑制信号转导的非功能聚集物中，或被保留在增强信号转导活性状态中，可能是细胞类型或应激特异性的。在肝脏中，NF-κB经典途径激活的缺陷通过刺激炎症和非经典NF-κB途径的激活来促进肿瘤的发生。然而，NF-κB的这一功能可能是组织特异性的，并且由于NFκB信号也调节抗氧化防御，p62对NF-κ子B的抑制可能解释了其他自噬缺陷组织中氧化应激增加的原因。总之，自噬缺陷促进了肿瘤中蛋白质和细胞器质量控制的失败，这导致p62积累，导致基因表达受到干扰，氧化应激增加，基因组损伤和肿瘤发生(图7F). 由于p62上调在高危个体的肝组织和患者的肝细胞癌中很常见，这表明通过促进自噬促进p62的清除可能是癌症化学预防的一种策略。

实验程序

稳定细胞系的产生和培养条件

第5天+/+,第5天+/−,第5天−/−,贝克林1+/+和贝克林1+/−iBMK细胞系如前所述(Degenhardt等人，2006年;Degenhardt等人，2002年;Mathew等人，2008年;Mathew等人，2007b). 表达Bcl-2第5天+/+和第5天−/−构建iBMK细胞，稳定表达Myc-tagged p62（pcDNA3-Myc-p62）、EGFP（pEGFPC1）或p62-EGFP（pEGFC1-p62）(罗德里格斯等人，2006年)，或如前所述通过电穿孔与pcDNA3-Zeo共转染(Nelson等人，2004年). 在zeocin（500μg/mL）中选择独立克隆，并在38.5°C和8.5%CO的正常培养条件下（DMEM、10%FBS、1%Pen-Strep（Invitrogen、Carlsband、CA）扩增为稳定细胞系2) (Mathew等人，2008年). 为了诱导代谢应激，将细胞置于含有10%FBS的无葡萄糖DMEM（Invitrogen）中，并与含有1%氧气、5%CO的规定气体混合物孵育2和94%N2（宾夕法尼亚州阿伦顿市GTS-Welco）(Nelson等人，2004年). NAC（密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）的浓度为1mM。

补充材料

1

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致谢

我们感谢Heintz、Yue和Jin博士提供贝克林1+/+和贝克林1+/−小鼠，水岛博士提供第5天+/+和第5天−/−小鼠，Zimmermann博士检测GRp170抗体，Moscat博士检测myc-p62和p62-EGFP质粒。这项工作得到了NIH（R37 CA53370和RO1 CA130893）向E.W.、（K99CA133181）向V.K.W.和DOD（W81XWH06-1-0514和W81XWH05）向E.W和R.S.D.提供的拨款的支持。

脚注

补充数据

补充数据包括补充实验程序，三个数字和三张表格。

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