致癌。2009年12月；30(12): 2059–2063.
头颈癌中MicroRNA表达与饮酒和生存率的关系
,1 ,2 ,1,三和1,*
米歇尔·艾维萨尔
1美国RI 02912普罗维登斯G-E5信箱布朗大学病理学和实验医学系
迈克尔·D·麦克林
2波士顿大学公共卫生学院环境卫生系，波士顿，MA 02118，美国
卡尔·T·凯尔西
1美国RI 02912普罗维登斯G-E5信箱布朗大学病理学和实验医学系
三美国RI 02912普罗维登斯布朗大学环境健康与技术中心社区健康系
卡门·J·马西特
1美国RI 02912普罗维登斯G-E5信箱布朗大学病理学和实验医学系
1美国RI 02912普罗维登斯G-E5信箱布朗大学病理学和实验医学系
2美国马萨诸塞州波士顿市波士顿大学公共卫生学院环境卫生系，邮编02118
三美国RI 02912普罗维登斯布朗大学环境健康与技术中心社区健康系
收到日期：2009年7月27日；2009年10月29日修订；2009年10月30日接受。
版权©作者2009。牛津大学出版社出版。保留所有权利。有关权限，请发送电子邮件至：journals.permissions@oxfordjournals/org - 补充资料
【补充资料】
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摘要
microRNAs（miRNAs）在包括头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）在内的许多肿瘤的致癌中的作用是明确的，但其改变的病因和临床意义仍然是重要的问题。我们之前的工作已确定四种miRNAs与非病变上皮细胞相比是差异表达的HNSCC，并表明在检测其表达方面具有潜在的诊断价值。在这里，我们使用定量实时聚合酶链反应来确定这些miRNAs在较大的独立HNSCC肿瘤病例系列中的相对表达(n个 = 169），检查miRNA表达与HNSCC相关暴露和临床特征的相关性。在多元分析中miR-375型饮酒量增加(P（P） = 0.002），并且与口腔肿瘤相比在咽部和喉部来源的肿瘤中表现出更高的表达(P（P） < 0.05和P（P） < 分别为0.01）。此外，高miR-21基因在一个受患者年龄、性别和肿瘤分期控制的模型中，表达与患者5年生存率显著降低相关（危险比1.68；95%CI:1.04–2.77）。总之，这些数据表明，miRNA表达的改变与导致头颈癌的暴露有关，可能是患者预后的有用生物标记物。
引言
头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是全球第六常见的癌症，发生于上消化道的不同部位(1,2). 原发肿瘤部位的复杂解剖结构导致了复杂的侵袭模式和局部扩散，这些已被证明是难以治疗的(1). 这些特征，再加上晚期诊断和第二原发性肿瘤形成的频繁发生，导致了相对较差的5年生存率，在过去三十年中仅略有改善(1,三). HNSCC的主要危险因素包括烟草和酒精，它们可以独立和协同作用，以及人类乳头瘤病毒（HPV）感染，这是一个独立的危险因素(4). 对于这些暴露是如何改变细胞功能以及其风险的分子基础的完整理解仍然是难以捉摸的。了解HNSCC癌变的分子本质对于提高早期诊断、预测预后和建立有效的治疗方法至关重要。虽然已经在定义HNSCC的遗传生物标记物方面进行了一些尝试(5–7)表观遗传生物标记物可能对治疗和理解这种疾病有相当大的临床和生物学用途，因为表观遗传在其发展和进展中起着关键作用。
表观遗传调控领域正在进行深入研究，近年来，我们小组和其他人揭示了表观遗传改变在HNSCC癌变中的重要作用(8–10). 微RNA（MicroRNAs，miRNAs）是一类非蛋白编码RNA，现在被认为是表观基因组的关键产物，负责从器官发生到免疫的各种事件，并且已知它们在包括癌症在内的许多疾病的发展中至关重要(11,12). 通过与信使RNA靶标3′-非翻译区的部分互补位点结合，miRNAs干扰信使RNA翻译或导致信使RNA降解，从而抑制转录后基因表达(13).
癌症中miRNAs的失调已被证明与多种肿瘤类型的各种肿瘤特征和预后相关(14–17). 尽管最近有几篇报道明确了原发性HNSCC肿瘤中miRNA表达的异常(18–21)但对于这些差异与临床特征和疾病风险因素之间的关系知之甚少。体外研究和动物模型表明，miRNAs的表达随着各种毒物的暴露而改变(22–24). 在人群中确定这种联系对于更好地理解暴露和环境导致头颈癌发生的分子机制至关重要。我们研究了四种miRNAs的表达，之前发现它们在HNSCC肿瘤中的表达与正常组织不同(18)，并检查了与肿瘤临床病理特征的相关性，以确定这些miRNA改变是否有助于作为预后生物标记物。同样，我们研究了这些miRNA的表达与患者致癌物暴露的关系，以便更好地了解这些暴露是否通过miRNA的改变而起作用。
材料和方法
研究人群
本分析中检查的病例来自之前描述过的基于人群的HNSCC事件病例对照研究(25,26). 简而言之，1999年至2003年，在马萨诸塞州波士顿市的九家医疗机构中发现了经组织学证实的HNSCC病例。所有参与者在参与医院的机构审查委员会批准后提供书面知情同意书。通过问卷调查收集吸烟、饮酒、饮食、家族史、用药史和人口统计学数据。这些分析中使用的169个HNSCC肿瘤样本代表了本研究收集的新鲜冷冻肿瘤组织。一位研究病理学家证实，这些分析中使用的每个HNSCC样本中肿瘤含量>75%。之前已确定HPV-16 DNA状态(27).
RNA分离
根据制造商的方案，使用mirVANA RNA分离试剂盒（Ambion，Austin，TX）从肿瘤中分离出总RNA。使用Nanodrop ND-1000分光光度计（Nanodrot，Wilmington，DE）对RNA进行定量，在用于实验室分析之前，将其在−80°C下短暂保存。
定量逆转录-聚合酶链反应
TaqMan miRNA分析（加州福斯特市应用生物系统公司）用于定量miR-21基因,miR-18a,miR-375型和miR-218型互补DNA是通过启动一组基因特异性的环状引物合成的，这些引物包括感兴趣的miRNAs和RNU48的引物，RNU48是一种普遍表达的内源性对照物（应用生物系统）。根据制造商的规范，将10μl总RNA等分试样稀释至最终浓度为5纳克/μl，与其他逆转录成分一起用于每个逆转录反应。40微升反应在Applied Biosystems GeneAmp PCR系统9700中培养30分钟（16°C）、30分钟（42°C）和5分钟（85°C），并保持在4°C。所有反应，不包括无模板对照和非逆转录对照，均在ABI 7500快速实时PCR检测系统上进行三次。所有实时聚合酶链反应数据均通过使用ΔΔCT方法计算折叠变化进行量化，将病例的miRNA表达归一化为来自一组非疾病头颈上皮样本的表达数据。
统计分析
所有分析均使用SAS 9.1（SAS Institute，Cary，NC）进行。对所有miRNAs的折叠变换表达值进行对数转换，以创建参数分析的正态分布。吸烟和饮酒的类别是以从不吸烟/饮酒的人为参照物，低类别和高类别按每个变量的中值进行二分。对于单变量分析，学生的吨-分别对两个或两个以上类别的离散变量进行检验或单向方差分析，但肿瘤部位除外，其中吨-这些测试是为了比较咽部与口腔、喉部与口腔肿瘤。连续变量采用Spearman秩相关。线性回归分析用于多变量检测与暴露和临床病理特征的相关性。使用Kaplan–Meier方法和logrank检验确定显著性，使用miRNA表达前25个百分位上分层的log-transformed miRNA表达值，跨miRNA表达层比较总体5年生存率。采用多元Cox比例风险回归分析确定病死率的预测因素。P（P）-<0.05的值被认为是显著的。为了在多变量模型中达到最佳的简约性，所有变量最初都包含在模型中，但如果删除这些变量不会导致其他变量的影响估计值发生>15%的变化（即，这些变量不被视为混淆变量），则删除非显著变量。模型只包括模型中所有变量都有完整数据的受试者。
结果
miRNA表达的量化
本研究使用了169例新鲜冷冻肿瘤患者的子集，这些患者的协变量数据得到了很好的注释(). 患者平均年龄为61.5±11.9岁，其中68%为男性。超过一半的参与者吸烟≥36.75包年，每周饮酒≥18杯（分别为51.1%和51.8%）。大多数患者患有口腔肿瘤、晚期疾病，HPV-16阴性（分别为64、72和90%）。
表一。
| n个(%) |
| 性别 | |
| 女性 | 54 (32.0) |
| 男性 | 115 (68.0) |
| 平均年龄（SD） | 61.5（11.9） |
| 终身烟包年一 | |
| 无（0） | 22 (15.5) |
| >0–36.75 | 59 (41.5) |
| ≥36.75 | 61 (43.0) |
| 每周饮酒量b条 | |
| 无（0） | 16（11.5） |
| >0–18 | 61 (43.9) |
| ≥18 | 62 (44.6) |
| 肿瘤部位c（c） | |
| 口腔 | 94 (64.0) |
| 咽 | 31 (21.1) |
| 喉咙的 | 22 (15.0) |
| 阶段天 | |
| 低（I，II） | 46 (28.0) |
| 高（III、IV） | 118 (72.0) |
| HPV-16肿瘤DNA状态e（电子） | |
| 阴性 | 90 (82.6) |
| 积极的 | 19 (17.4) |
根据我们之前的研究结果，我们选择了四种miRNA进行分析，确定这些miRNA在HNSCC肿瘤和正常头颈上皮之间的差异表达。对169例HNSCC肿瘤进行实时定量聚合酶链反应，通过将其表达归一化到非疾病样本池中来确定每个miRNA的表达值。所评估的四种miRNA中每一种的平均对数转换表达值列于补充表一（可在致癌作用在线）。
miR-375表达与肿瘤部位、分期和饮酒量相关
在单变量比较中，miR-375型在喉肿瘤中的表达水平明显高于口腔肿瘤(P（P） = 0.004;). 吸烟[以吸烟年数、持续时间（吸烟年数）或强度（每天吸烟包数）衡量]和HPV状态与miR-375型或任何其他miRNA的表达。然而，单变量分析表明miR-375型饮酒量显著增加(P（P） = 0.014;). 为了控制潜在的混杂因素，我们采用了多元线性回归分析，该分析表明每周饮酒量>0-18和≥18的两类饮酒者与较高的miR-375型与不饮酒者相比的表达(P（P） = 0.039和P（P） = 分别为0.002；). 趋势测试miR-375型随着饮酒量的增加，表达量显著增加(P（P） = 0.002,).
表二：。
| n个(%) | 记录miR-21
| 对数miR-375
| 对数miR-18a
| 对数miR-221
|
| 平均经验（SD） | P（P） | 平均经验（SD） | P（P） | 平均经验（SD） | P（P） | 平均经验（SD） | P（P） |
| 性别 | | | | | | | | | |
| 女性 | 54 (32.0) | 1.76 (1.37) | | −2.49 (2.04) | | −0.2（1.14） | | 1.5 (1.49) | |
| 男性 | 115 (68.0) | 1.64 (1.47) | 0.61 | −2.20 (2.14) | 0.41 | −0.33 (0.94) | 0.41 | 1.31 (1.40) | 0.42 |
| 平均年龄（SD） | 61.5（11.9） | 1.68 (1.44) | 0.21 | −2.3 (2.10) | 0.63 | −0.29 (1.01) | 0.29 | 1.37 (1.42) | 0.12 |
| 终身烟包年 | | | | | | | | | |
| 无（0） | 22 (15.5) | 1.54 (1.69) | | −2.47 (2.1) | | −0.20（1.3） | | 1.66 (1.80) | |
| >0–36.75 | 59 (41.5) | 1.63 (1.40) | | −2.67 (2.07) | | −0.20 (0.87) | | 1.35（1.29） | |
| ≥36.75 | 61 (43.0) | 1.64 (1.28) | 0.96 | −1.98 (2.27) | 0.21 | −0.44 (1.00) | 0.37 | 1.28 (1.39) | 0.55 |
| 每周饮酒量 | | | | | | | | | |
| 无（0） | 16 (11.5) | 1.62 (1.27) | | −3.45 (1.56) | | −0.21 (1.00) | | 1.51 (1.16) | |
| >0–18 | 61 (43.9) | 1.59 (1.47) | | −2.53 (2.38) | | −0.26（1.09） | | 1.21 (1.62) | |
| ≥18 | 62 (44.6) | 1.68 (1.39) | 0.94 | −1.81 (1.93) | 0.014 | −0.32 (0.95) | 0.9 | 1.51 (1.31) | 0.49 |
| 肿瘤部位b条 | | | | | | | | | |
| 口腔 | 94 (64.0) | 1.62 (1.49) | | −2.58（2.06） | | −0.32 (1.11) | | 1.37 (1.54) | |
| 咽的 | 31 (21.1) | 1.46 (1.36) | 0.11 | −1.78 (2.52) | 0.12 | −0.36（0.82） | 0.81 | 1.14 (1.25) | 0.41 |
| 喉咙的 | 22 (15.0) | 2.18 (1.39) | 0.56 | −1.23 (1.71) | 0.004 | −0.0006 (0.91) | 0.17 | 1.71 (1.38) | 0.31 |
| 阶段 | | | | | | | | | |
| 低（I，II） | 46 (28.0) | 1.74 (1.36) | | −2.46 (1.98) | | −0.42 (1.23) | | 1.02 (1.3) | |
| 高（III、IV） | 118 (72.0) | 1.60 (1.47) | 0.58 | −2.36 (2.11) | 0.77 | −0.38（0.98） | 0.78 | 1.15 (1.24) | 0.31 |
| HPV状态 | | | | | | | | | |
| 阴性 | 90 (82.6) | 1.73 (1.33) | | −2.27 (2.16) | | −0.26 (1.02) | | 1.53 (1.29) | |
| 积极的 | 19 (17.4) | 1.45 (1.62) | 0.43 | −2.42（2.11） | 0.79 | −0.32 (1.00) | 0.9 | 1.28 (1.48) | 0.61 |
表三。
的相关性miR-375型在多元线性回归模型中与病因和肿瘤部位的表达（TotalN个 = 133）
| n个(%) | 注册系数。 | P（P） |
| 性别 | | | |
| 女性 | 42 (31.6) | 参考 | |
| 男性 | 91 (68.4) | −0.41 | 0.33 |
| 平均年龄（SD） | 61.5 (11.3) | −0.004 | 0.806 |
| 烟熏包装年 | | | |
| 无（0） | 22 (16.5) | 参考 | |
| <36.75 | 43 (32.3) | −0.87 | 0.129 |
| ≥36.75 | 68 (51.1) | −0.5 | 0.375 |
| 每周饮酒量一 | | | |
| 无（0） | 13 (9.8) | 参考 | |
| <18 | 50 (37.6) | 1.3 | 0.039 |
| ≥18 | 70 (52.6) | 2.26 | 0.002 |
| 肿瘤部位 | | | |
| 口腔 | 83 (62.4) | 参考 | |
| 咽的 | 31（23.3） | 0.89 | 0.049 |
| 喉咙的 | 19 (14.3) | 1.7 | 0.005 |
单变量分析也显示miR-375型喉源性肿瘤的表达明显高于口腔肿瘤。在一个控制年龄、性别和吸烟的模型中，miR-375型与口腔肿瘤相比，咽喉肿瘤的表达显著增加(P（P） = 0.049和P（P） = 分别为0.005；).
miR-21表达与患者生存率降低相关
一项未经调整的Kaplan–Meier生存分析表明miR-21基因最高四分位数的表达显示出比低四分位数患者生存率更差的趋势miR-21基因表达式(). 在控制年龄、性别和肿瘤分期的多变量Cox比例风险模型中miR-21基因与患者5年生存率显著降低相关（危险比=1.68；95%置信区间：1.04–2.77；P（P） = 0.034;).
表四。
| n个(%) | 危险比 | 95%置信区间
| P（P） |
| 下部 | 上部 |
| 性别 | | | | | |
| 女性 | 49 (32.7) | 1.0（参考） | | | |
| 男性 | 101（67.3） | 1.24 | 0.76 | 2.01 | 0.388 |
| 平均年龄（SD） | | 1.03 | 1.02 | 1.05 | <0.001 |
| Log miR-21表达 | | | | | |
| <2.58 (n个 = 117) | 117 | 1.0（参考） | | | |
| ≥2.58 (n个 = 33) | 33 | 1.68 | 1.04 | 2.77 | 0.034 |
| 肿瘤分期 | | | | | |
| 一、 二(n个 = 43) | 43 | 1.0（参考） | | | |
| 三、 四、(n个 = 107) | 107 | 1.56 | 0.94 | 2.6 | 0.096 |
Kaplan–Meier曲线显示了miR公司-与所有其他患者（实线）相比，21表达在最高的第25百分位（虚线）。垂直阴影标记表示经过审查的数据。
讨论
评估miRNA表达作为癌症诊断、预测和治疗学中有用的生物标记物的潜在用途越来越明显。许多研究报告了miRNA图谱与肿瘤的重要临床特征以及患者生存率之间的重要关联(14,17,28–30). 在这里，我们分析了HNSCC肿瘤中miRNA的表达，发现饮酒与HNSCC的主要危险因素，以及与肿瘤特征和患者总体生存率的相关性。
此前，有四种miRNAs在原发性HNSCC肿瘤和类似正常组织中被证实存在显著差异表达(18). 我们假设这些miRNAs可能在HNSCC致癌过程中发挥作用，对大量肿瘤的分析将揭示这些miRNAs的表达与肿瘤中各种临床病理和暴露变量之间的关系。本研究中研究的miRNAs以前都与各种癌症有关，但其功能基本未知。虽然miR-18a和miR-221型在本研究中未发现与任何协变量相关，有充分理由相信它们在HNSCC致癌过程中发挥作用。miR-18a是miR-17-92簇的成员，在胃癌、结直肠癌和卵巢癌中过度表达，并被认为抑制肝细胞癌中雌激素受体-α的表达(31–34).miR-221型在许多癌症中的表达也增加，其抑制作用以及miR-21基因已被证明能诱导细胞周期阻滞和凋亡，并使细胞对化疗药物敏感(35,36).
miR-21基因是研究得最好的miRNAs之一，在致癌过程中具有明确的作用，并有几个已证实的靶点(37,38). 尽管miR-375型主要在糖尿病背景下进行研究，因为它影响β细胞质量和胰岛素水平(39,40)，其在胰腺癌、食管鳞状细胞癌和腺癌等多种恶性肿瘤中的表达已被证明降低(41,42). 此外，最近确定的目标miR-375型，磷脂酰肌醇依赖性蛋白激酶-1，表明其对miR-375型作为一种肿瘤抑制剂，因为磷脂酰肌醇依赖性蛋白激酶-1对激活抗凋亡细胞至关重要AKT公司(43).
酒精摄入与肝细胞肿瘤中miRNA表达的改变有关，而酒精暴露会影响大鼠神经元和小鼠胎脑中miRNA的水平(44–46). 我们发现了miR-375型随着饮酒量的增加，表达量发生了变化，与吸烟无关，显示出明显的高表达趋势miR-375型随着饮酒量的增加。虽然已知酒精是HNSCC的独立危险因素，但这种关联的机制尚不清楚。虽然酒精本身不是直接致癌物，但它可以作为刺激物，炎症是致癌的众所周知因素(47). 唾液中的乙醇被粘膜和微生物的乙醇脱氢酶氧化，产生乙醛，乙醛是一种已知的动物致癌物，也可能是人类致癌物(48,49). 此外，已经证实酒精会干扰叶酸的吸收，叶酸是维持正常DNA甲基化模式的关键甲基供体(50). 虽然表达了miR-375型与正常组织相比，肿瘤中的miRNA表达总体水平较低，因此可以在肿瘤微环境的水平上对miRNA表达进行微调，并且可以根据肿瘤的暴露和位置而变化。在这种情况下，饮酒可能导致miR-375型位于HNSCC肿瘤内。miRNAs的调控是复杂的，对负责整体表观遗传稳定性的正常内稳态机制的扰动可能在潜在致癌基因表达中发挥关键作用。
更高的表达miR-375型与口腔肿瘤相比，在咽喉肿瘤中也发现。该观察结果与表明miRNA谱具有肿瘤和细胞类型特异性的结果一致，甚至可以精确区分肿瘤亚型(51,52). 此外miR-375型在组织中可能反映了病因。观察到饮酒与miR-375型在咽喉肿瘤中的表达及其高表达趋势可能表明，miRNA通过暴露而发生的失调优先发生在某些组织中。
虽然生存率的单变量logrank检验没有显著性，因为它没有考虑分期等解释因素，并且受样本量的限制，但未经调整的Kaplan–Meier曲线显示，高生存率患者的生存率明显下降miR-21基因表达式。一个控制混杂因素的多变量模型发现miR-21基因肿瘤中的表达与患者生存率低下，这与乳腺癌、结肠癌以及非小细胞肺癌中的关系相同(15,16,53). 以下几个目标miR-21基因已经过实验验证，其中许多是肿瘤抑制基因(54–56). 已知其中一个靶点，程序性细胞死亡4在HNSCC中下调，在最近两项关于HNSCC miRNA谱的研究中，其表达与miR-21基因在肿瘤中(20,21). HNSCC表达减少的另一个重要靶点是PTEN公司，其产物通过拮抗AKT/PI3K途径抑制生长和细胞存活的基因(57). 因此，很可能miR-21基因通过多个靶点发挥作用，导致HNSCC恶性，从而降低疾病相关风险。
我们的结果表明，miRNAs，例如miR-375型，可能调节与接触该疾病风险因素相关的致癌反应。此外，这种调节可能在肿瘤中受到不同的调节，这取决于组织，因为miR-375型显示肿瘤部位不同。更深入的研究miR-375型对于我们了解风险敞口如何改变HNSCC的风险或进展而言，这可能是非常宝贵的。此外，高miR-21基因HNSCC患者的表达与预后不良相关。作为miR-21基因它似乎是这种癌症和其他癌症预后的重要指标，应该被视为这些疾病的潜在治疗靶点。我们的结果表明，在检测这些特异性miRNA表达特征时，可能有显著的预后效用。
基金
国家癌症研究所(电话：078609;,R01CA100679号至K.T.K.）；美国国家环境健康科学研究院(T32ES007272硕士）；空乘人员医学研究所（致C.J.M.和M.D.M.）；间皮瘤应用研究基金会（致C.J.M.）。
致谢
我们感谢参与头颈癌研究的个人以及负责招募、研究数据和样本确定的研究助理。我们也感谢匿名审稿人对这份手稿的宝贵贡献。
利益冲突声明：未声明。
词汇表
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| HNSCC公司 | 头颈部鳞状细胞癌 |
| 人乳头瘤病毒 | 人乳头瘤病毒 |
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