肌抑素通过Akt抑制IGF-I诱导的肌管肥大

摘要

肌肉抑制素也称为生长分化因子-8（GDF-8），是肿瘤生长因子-β（TGF-β）超家族的成员，对骨骼肌生长具有负调节作用。MSTN基因缺失导致小鼠肌肉质量增加(19,32)，头牛(5,10,20)，绵羊(三)，只狗(23)、和人类(30)强调了其跨物种的非常保守的生物活性。据报道，MSTN抑制骨骼肌增生（主要发生在发育过程中）的潜在机制(9,12,34). 然而，关于MSTN如何调节骨骼肌肥大的研究还很少，骨骼肌肥厚在肌肉生长中起着重要作用，可以通过遗传或药物抑制出生后的MSTN(6,15,37,39,41). MSTN已被证明通过激活素Ⅱa型和Ⅱb型受体调节体内骨骼肌生长(14,15); 然而，MSTN调节骨骼肌肥大能力的下游信号机制尚不清楚。

C2C12细胞是一种来源于小鼠卫星细胞的成肌细胞系，已被广泛用作研究肌肉分化和肥大的体外模型。从C2C12成肌细胞中提取血清使其退出细胞周期并融合到肌管中。分化的肌管对生长因子如胰岛素样生长因子-I（IGF-I）表现出肥大而非增生的反应，其特征是肌管直径和蛋白质合成增加(13,26,27). 虽然这些不同的过程可能是相互关联的，但肥大或细胞大小的增长可能与出生后骨骼肌的调节更相关。

C2C12肌管已被用作研究IGF-I介导的骨骼肌肥大信号通路的体外模型。磷脂酰肌醇3（PI3）激酶/Akt/雷帕霉素（mTOR）激活IGF-I下游的哺乳动物靶点已被证明在体外诱导C2C12细胞肥大(26)以及体内骨骼肌(2). 该细胞系也被用于体外模拟骨骼肌萎缩。地塞米松介导的肌管直径和蛋白质合成的减少可被IGF-I阻断(31). Akt在IGF-I下游被激活，通过叉头转录因子FOXO1抑制萎缩素-1/肌肉萎缩F盒（MAFbx）和肌肉环指蛋白1（MuRF1）泛素连接酶的诱导，从而预防肌肉萎缩(31). 此外，添加重组MSTN蛋白后，肌管中的Akt磷酸化水平降低(18). 因此，C2C12细胞提供了一个有用的、特征明确的体外模型系统，用于检测MSTN对抑制骨骼肌肥大和/或诱导骨骼肌萎缩的作用。

以前，我们已经证明MSTN通过抑制Akt抑制体外原代心肌细胞中苯肾上腺素（PE）介导的肥大(22). 在体内，我们发现与对照组相比，MSTN基因敲除小鼠心脏对PE刺激的反应中Akt激活和肥大增加。为了验证Akt也可能在骨骼肌肥大中发挥作用的假设，我们检查了这些小鼠中的Akt是否发生改变，并使用C2C12肌管来确定MSTN介导的Akt-信号调节是否对肥大具有功能重要性。在这里，我们显示了Akt在调节MSTN介导的骨骼肌肥大抑制中的作用。

方法

结果

骨骼肌中的Akt蛋白和活性增加。

我们以前曾报道过MSTN通过以刺激特异性的方式抑制p38和Akt激活而抑制心肌细胞肥大，但不改变Akt总蛋白(22). 为了确定MSTN是否调节骨骼肌中的Akt，我们检测了MSTN-null小鼠（敲除，KO）骨骼肌中Akt(图1一个).与心肌相比，KO小鼠股四头肌中Akt的总表达增加了2.8倍(图1B类) (n个= 16,对<0.001 vs.野生型，WT）。此外，我们发现Akt的基线磷酸化大约增加了四倍(图1B类,n个= 4,对<0.05）与KO小鼠股四头肌中Akt激酶活性的总体增加相关(图1C类,n个= 4,对< 0.05). 有趣的是，Akt活性的增加主要是由于Akt蛋白水平的增加，而不是磷酸化/总Akt百分比的变化。为了进一步研究Akt蛋白增加的机制，我们检测了Akt mRNA，发现KO中Akt的mRNA比WT股四头肌增加了两倍(对<0.02），表明MSTN缺失在转录水平调节Akt表达。我们发现p38的总量或磷酸化没有增加（数据未显示）。

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图1。

肌抑制素敲除（KO）肌肉中的Akt蛋白、活性和mRNA增加。一个：对myostatin野生型（WT）、杂合型（HET）和纯合型（KO）myostatin-KO小鼠心脏、股四头肌和腓肠肌Akt进行代表性Western blot分析。GAPDH显示为加载控件。B类：用抗磷酸化Akt（s437）、Akt和GAPDH抗体对WT和KO小鼠股四头肌进行代表性Western blot分析。条形图显示了从总Akt和磷酸化Akt归一化到GAPDH的印迹的定量。C类：来自WT和KO股四头肌的代表性Akt激酶分析。该图显示了Akt激酶检测结果的量化。Western blot图像上的分隔线描绘了同一个blot的条带并列的位置。D类：使用WT和KO股四头肌RNA样本的定量实时RT-PCR显示KO骨骼肌中Akt基因表达增加。基因表达标准化为GAPDH。总计Akt，n个=16重量：16 KO；p-Akt，n个=4重量：4 KO；Akt激酶，n个=4重量：4 KO；基因表达，n个=3重量：4 KO*对<0.0001 vs.重量#对<0.05与WT。

MSTN调节肌管中的Akt磷酸化。

为了确定MSTN是否抑制肌管中的Akt，将C2C12成肌细胞在生长培养基（DMEM+15%FBS）中生长至汇合，然后在D0时切换到分化培养基（DMEM+2%HS）。用仅表达GFP、MSTN或dnMSTN、NH的腺病毒构建物感染全分化肌管（D2）₂-先前已证明抑制MSTN的MSTN末端肽(7). 用IGF-I刺激感染GFP的肌管30分钟后，D4诱导Akt磷酸化增加6.7倍(n个= 8,对<0.001）被MSTN表达阻断(图2,n个= 8,对< 0.001). dnMSTN过度表达足以使Akt磷酸化比GFP增加3.6倍(图2,n个= 8,对< 0.05). 与IGF-I刺激相比，膜靶向Akt（Akt）的过度表达导致类似的Akt磷酸化（8.6倍）(图2,n个= 5,对<0.001与GFP，对=NS vs.GFP+IGF-I）。MSTN和Akt与(n个=4）或不带IGF-I(n个=3）与GFP+IGF-I或单独Akt相比，Akt磷酸化水平没有显著变化。肌管中MSTN或dnMSTN感染均未观察到总Akt蛋白的变化。

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图2。

肌生长抑制素（MSTN）调节肌管中的Akt磷酸化。肌管裂解物中磷酸化Akt（s473）、总Akt和GAPDH的代表性Western blot分析。4到9个独立实验的Western blot定量结果显示为最大胰岛素样生长因子-I（IGF-I）刺激百分比。Western blot图像上的分隔线描绘了同一个blot的条带并列的位置。dnMSTN、显性阴性MSTN*对<0.001 vs.GFP，对<0.001 vs.GFP+IGF-I#对与GFP相比<0.05。

MSTN调节肌管中的Akt活性。

为了证实MSTN和dnMSTN介导的Akt磷酸化的变化反映了实际的Akt-活性，我们进行了激酶活性的直接测量。与感染GFP的对照组相比，IGF-I使Akt激酶活性增加了6.3倍(n个= 3,对<0.001），MSTN感染完全阻断激活(图3,n个= 3,对<0.001），而dnMSTN的活性比GFP感染的肌管增加了3.6倍(图3,n个= 3,对< 0.05).

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图3。

MSTN调节肌管中的Akt活性。Akt激酶检测的代表性印迹和3个独立实验的定量显示。Western blot图像上的分隔线描绘了同一个blot的条带并列的位置*对与GFP相比<0.001，†对与GFP+IGF-I相比<0.01#对与GFP相比<0.05。

MSTN通过Akt抑制IGF-I介导的肌管肥大。

为了确定MSTN介导的Akt抑制对肌管肥大是否具有重要功能，我们检测了MSTN抑制IGF-I介导的分化C2C12肌管肥厚的能力。如上所述培养和感染肌管（D2），在D3上用IGF-I刺激，并在24小时后拍照测量。用IGF-I刺激感染GFP的肌管，肌管直径增加4.6倍(图4,对< 0.001). MSTN感染足以阻止IGF-I刺激的肥大(图4,对< 0.001). 增加Akt活动(图2)组成活性Akt的过度表达足以诱导肌管肥大(图4,对<0.001 vs.GFP），不受MSTN过度表达的抑制。此外，Akt活性的恢复挽救了被MSTN阻断的IGF-I诱导的肌管肥大(图4,对<0.001 vs.GFP）表明MSTN通过抑制Akt抑制肌管肥大。

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图4。

MSTN通过Akt抑制IGF-I介导的肌管肥大。一个：腺病毒感染、表达GFP的肌管的代表性照片。B类：以GFP对照百分比表示的平均肌管直径±SE的量化。在3到9个独立实验中，每个条件下至少测量5个肌管。（GFP、，n个=104），（G+I，n个=53），（MSTN，n个=113），（M+I，n个=47）、（Akt，n个=76），（MSTN+Akt+I，n个=58），（MSTN+Akt=IGF-I，n个= 33) *对<0.001与GFP#对<0.05 vs.GFP，对<0.001 vs.GFP+IGF-I；比例尺，50μm（放大倍数：×200）。

抑制MSTN导致Akt依赖性肌管肥大。

腺病毒过度表达dnMSTN足以导致肌管直径增加3.2倍(图5,对<0.001 vs.GFP）。这种肥大被dnAkt感染阻断(图5,对<0.01 vs.dnMSTN）。dnAkt同样抑制IGF-I刺激的肥大。dnAkt使表达GFP的对照细胞的Akt活性降低至基线水平(图5,B类和C类). 因此，MSTN的抑制导致Akt激活，这对于观察到的体外肌管肥大似乎是必要的。

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图5。

抑制MSTN导致Akt依赖性肌管肥大。一个：显示腺病毒感染、表达GFP的肌管的代表性照片。B类：以GFP变化百分比（GFP，n个=104，dnMSTN，n个=129，dnMSTN+dnAktn个=100，dnAkt，n个=42，dnAkt+IGF-I，n个= 49).C类：Akt激酶分析的定量Western blots（数据来自n个=除dnAkt外的所有实验均为3个独立实验，n个= 4). *对< 0.001, ‡对与GFP相比<0.01†对与dnMSTN相比<0.01；比例尺，50μm（放大倍数：200）。

骨骼肌质量的下游介质增加。

为了确定Akt可能的下游效应器，该效应器可能介导体内骨骼肌质量的观察增加，我们检测了p70S6激酶、GSK3、S6和E3连接酶MAFbx和MuRF1 mRNA磷酸化的变化，这些酶介导萎缩(31). 有趣的是，我们发现与WT相比，KO骨骼肌中只有S6激酶磷酸化增加（2.7倍）(图6,n个= 4,对< 0.05). p70S6激酶总量无差异(图6一个)p70S6激酶的基线磷酸化在两组中均未检测到（数据未显示）。KO骨骼肌中GSK3的磷酸化没有增加(图6一个,n个=4），表明它不参与调节Akt下游骨骼肌质量的增加。我们没有发现MuRF1转录发生变化；然而，我们发现MAFbx转录惊人地增加了2.8倍(图6B类,n个= 3,对<0.01），预计会增加萎缩。因此，萎缩的调节不太可能导致骨骼肌肥大并伴有MSTN缺失，观察到的MAFbx mRNA的增加可能代表一种反调节的抗生长反应。总之，这些数据表明，MSTN通过Akt调节肌管肥大，MSTN-KO骨骼肌中Akt激活的增加可能至少部分调节观察到的骨骼肌肥大，而不减少萎缩。

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图6。

体内S6磷酸化和肌动蛋白-1/肌肉萎缩F盒（MAFbx）mRNA增加.A型：用抗磷酸-S6、S6、磷酸-GSK3、p70S6K和GAPDH抗体探测WT和KO小鼠股四头肌的代表性Western blot。条形图显示归一化为S6或GAPDH的斑点数量。Western blot图像上的分隔线描绘了同一个blot的条带并列的位置。使用WT和KO股四头肌RNA样本的定量实时RT-PCR显示KO骨骼肌中MAFbx基因表达增加。基因表达标准化为GAPDH。（免疫印迹；n个=3重量:4千克）。MURF-1，肌肉环纤维蛋白-1。基因表达，n个=3重量：3KO†对与WT相比<0.01#对与WT相比<0.05。

讨论

在本研究中，我们证明体内MSTN的遗传缺失增加了骨骼肌中Akt的表达和整体活性。此外，我们表明，体外过表达MSTN可以阻止IGF-I介导的肌管肥大，而抑制MSTN则以Akt依赖的方式导致肥大。总之，这些发现表明MSTN调节骨骼肌生长的一种以前未被认可的机制：Akt信号的调节。

目前的研究扩展了我们之前在心肌方面的观察结果，但存在一些重要差异。以前，我们报道过MSTN抑制心肌细胞肥大是对PE（α-肾上腺素能激动剂）的反应，而不是IGF-I(22). 相反，在C2C12肌管中，IGF-I介导的肥大被MSTN阻断，表明MSTN可能以刺激和细胞类型特异性的方式抑制肥大。我们之前证明，PE-刺激的肌抑制素阴性心脏肥大与PE-刺激Akt活性增加相关，而基线心脏大小、总Akt或Akt活动没有改变(22). 相反，MSTN阴性骨骼肌肥大，基线时Akt表达和活性增加。

利用骨骼肌肥大的体外模型，我们进一步证明了Akt活性的调节对MSTN的抗肥大作用具有机械重要性。尽管与许多其他体外模型一样，在C2C12肌管中使用腺病毒过度表达有助于通过简化实验操作来理解信号机制，但在直接推断体内环境时需要谨慎。值得注意的是，在这种情况下，体内MSTN的丢失导致Akt总量和活性的上调，而C2C12肌管中dnMSTN或MSTN急性过度表达改变了Akt活性，但总体蛋白水平没有改变。有趣的是，我们之前观察到Akt在体内的心肌特异性过表达增加了MSTN的表达(4,22); 然而，Akt在体外心肌细胞中的腺病毒过度表达并没有。这些情况可能代表肌肉对特定生长信号通路的慢性丢失或增强的二次适应。KO骨骼肌中p70S6激酶和GSK3磷酸化缺乏增加，尽管在C2C12肌管中急性IGF-I/Akt刺激会增加(26)也可能受到生长信号通路慢性激活（负反馈）的稳态调节，以响应体内慢性Akt激活。在体内观察到的S6磷酸化的增加与Akt活化和生长的增加一致；然而，尚不清楚Akt是否对这一增长负有直接责任。最近的报告进一步证明了S6调节在控制MSTN下游肌肉生长中的重要性。一份报告表明，通过DNA电穿孔在骨骼肌中急性过度表达MSTN足以减少骨骼肌质量，并与S6磷酸化的显著降低相关(1). 有趣的是，尽管下游靶点受到调节，但他们没有观察到mTOR磷酸化增加。通过注射抑制性MSTN抗体（JA16）在体内对MSTN的急性抑制(38)或转染显性阴性MSTN受体（激活素IIB型）(29)选择性进入成年小鼠骨骼肌也增加了肌肉质量，与S6磷酸化增加相关。这些结果与我们的研究结果一致，即MSTN可以调节mTOR通路中Akt的下游远端效应器，从而影响骨骼肌肥大(1). 令人惊讶的是，我们发现MAFbx mRNA增加。因为Akt能够通过阻断FoxO介导的E3连接酶（包括MAFbx）的转录增加来抑制萎缩(13,28,31)据报道，MSTN可增加C2C12肌管中MAFbx的转录(18)如果涉及到MSTN-KO骨骼肌中Akt活性增加导致的萎缩抑制，我们原本预计转录会降低。观察到的MAFbx转录的增加可能代表了对肌肉质量增加的另一种稳态反调节反应，或者可能是MSTN丢失的直接影响，因为最近有研究表明MSTN降低了人类骨骼肌肌管中MAFbx转录(35). 总的来说，我们的数据与支持MSTN主要调节蛋白质合成而非蛋白质降解这一观点的已发表数据一致(33,36,38).

我们的结果也与C2C12成肌细胞的最新研究相一致，而不是这里使用的肌管，这表明MSTN通过抑制PI3激酶Akt和细胞周期蛋白D1调节成肌细胞增殖（增生）(40). 目前的研究表明，MSTN还通过调节Akt信号调节肌管生长或肥大（与增殖相反）。尽管PI3激酶Akt信号在成肌细胞和肌管中的作用不同(27)这些研究共同将PI3激酶-Akt信号传导置于MSTN在分化的两个阶段以及对肌肉增殖和生长的影响的交叉点。后一种效应可能会为KO小鼠出生后的肌肉生长提供线索。

有趣的是，另一份关于骨骼肌成纤维细胞的报告显示，与外源性MSTN暴露相关的Akt磷酸化增加(16). 虽然这正好相反，可能是一种细胞类型特异性效应，但它支持MSTN和Akt信号之间的联系。

在人肌管中，MSTN给药与肌管直径和Akt磷酸化的减少有关；然而，MSTN不能抑制IGF-1刺激的Akt磷酸化(35). 有趣的是，药物抑制MSTN受体（ALK）足以增加肌管直径，这与我们使用dnMSTN直接抑制内源性基线MSTN信号的结果一致。这些研究之间的差异可以通过使用不同的细胞系来解释，因为人类肌管对IGF-I的反应似乎不如C2C12肌管，或者可能是通过MSTN的给药途径，由于MSTN被认为是通过体内的一种自体因子发挥作用，因此外源性添加的MSTN与细胞以自分泌方式释放的MSTNs具有不同的细胞效应(25).

MSTN-KO小鼠脂肪组织也减少(21). 有趣的是，骨骼肌中Akt的转基因过表达也被报道可以减少小鼠的肥胖(8,11)，这表明此处报道的骨骼肌Akt活性的增加可能有助于MSTN-KO小鼠肥胖程度的降低。同样，MSTN缺失后对糖尿病的抵抗力(21)可能不仅与肌肉质量增加有关，还与Akt信号增强有关，这将被预测为增加葡萄糖摄取，尽管我们尚未在这里直接对此进行研究。

总之，我们证明MSTN在体内外调节Akt信号。体外研究表明，这种调节对于MSTN对IGF-I引起的肌管肥大的影响是必要的，并且是充分的。此外，我们假设MSTN调节Akt信号可能在体内MSTN基因操纵的其他表型中发挥重要作用。了解MSTN对骨骼肌生长、脂肪组织和胰岛素抵抗的影响的下游机制有助于指导针对多种情况下该途径的治疗策略。

赠款

这项研究得到了莱杜克基金会卓越研究网络（S.a.Cook和a.Rosenzweig）的支持，并得到了国家卫生研究院：国家心脏、肺和血液研究所、国家老龄研究所（a.Rosenz weig和M.R.Morissette）的资助。A.Rosenzweig是哈佛干细胞研究所的主要教员。

致谢

参考文献