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自然遗传学。作者手稿；PMC 2009年10月6日发布。
以最终编辑形式发布为：
自然遗传学。2007年5月；39（5）：596–604。
在线发布2007年4月15日。 数字对象标识：2032年10月10日
预防性维修识别码：项目经理2757939
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院54814
PMID：17435756

全基因组关联研究确定了五个新的克罗恩病易感性位点，并暗示了自噬在疾病发病机制中的作用。

约翰·D·里奥,1,2 兰尼克·J·泽维尔,三 肯特·泰勒,4 马克·西尔弗伯格,5 菲利普·戈耶特,1 艾伦·休特,三 托德·格林,2 彼得里克·库巴拉,三 迈克尔·巴马达（M.Michael Barmada）,6 丽莎·吴·达塔,7 殷瑶舒加特,8 安妮·格里菲斯,9 斯蒂芬·塔根,4 安德鲁·伊波利蒂,4 埃德蒙·让·伯纳德,10 凌美,4 丹·尼古拉,11 米盖尔·雷奎罗,12 L.菲利普·舒姆,13 A.希拉里·斯坦哈特,5 杰罗姆·罗特,4 理查德·杜尔,6,12 朱迪·赵,14,16 马克·戴利,2,15,16和史蒂文·布兰特7,8,16
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充材料

摘要

我们提出了回肠克罗恩病（CD）的全基因组关联研究和两项独立的复制研究，确定了与CD关联的五个新区域。具体而言，除了先前建立的CARD15和IL23R关联外，我们报告了编码PHOX2B、NCF4和ATG16L1基因的基因组区域以及16q24.1（FAM92B）上的预测基因和10q21.1上的基因间区域的变异与独立复制之间的强烈关联。我们进一步证明ATG16L1基因在肠上皮细胞系中表达，该基因的功能性敲除可消除鼠伤寒沙门氏菌的自噬。这些发现共同表明，自噬和宿主细胞对细胞内微生物的反应参与了CD的发病机制。

克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC1CD最常见于回肠和结肠，但可影响肠道的任何区域。UC总是累及直肠，炎症可能以连续的方式延伸到盲肠2强大的家族聚集性、双胞胎研究和已建立的遗传关联证明了遗传学在IBD发病机制中的重要作用三-5也有非常有力的证据表明，肠道菌群在疾病的发生和维持中起着重要作用。因此，与大多数复杂性状疾病一样，IBD是由遗传和非遗传风险因素共同作用的结果，其中每个单独因素对疾病风险的影响相对较小。

虽然全基因组连锁、候选基因和靶向关联图谱研究的组合在CARD15和中型散货箱5单倍型，这些只能解释CD遗传力的一小部分6-8因此，我们开始对CD进行全基因组关联（GWA）研究，以发现其他遗传风险因素。CD和UC的表型在个体之间差异很大，主要与炎症部位、疾病行为、严重程度和肠外表现有关。此外，CD位点和行为可能受遗传控制，这是基于受影响同胞对内的聚类9以及CARD15突变是回肠CD和狭窄行为的更大风险因素的具体观察10因此，我们专门关注涉及小肠回肠区域的CD患者（有或无其他受累部位），以尽量减少临床和遗传异质性。根据本研究大约进行到一半时的中期分析，我们确定、确认并公布了IL23R基因中对CD和UC发病风险有显著影响的遗传变异的发现11具体地说，在这一点上，对567例非犹太回肠CD病例进行了扫描和分析。在这里，我们报告了完成扫描的结果，使用Illumina HumanHap300基因分型芯片对988名回肠CD患者和1007名对照进行了基因分型，在独立的家庭和病例对照队列中复制了显著相关的SNP，以及初步的功能数据，这些数据开始将这些新基因置于生物学环境中，并提示潜在的致病机制。

结果

CD病例与对照的全基因组关联分析

为了确定影响CD发病风险的遗传因素，我们使用北美NIDDK IBD遗传学协会成员收集的988名回肠CD患者和1007名对照的DNA样本，对308332个SNP进行了分型。总的来说，98.6%的基因型在本实验中被调用；然而，在分析之前，对样本和SNP进行了质量过滤，以确保稳健的关联测试（见方法）。在执行这些数据过滤措施后，我们得到了最终的基因型数据集，包括946例患者和977例对照的304413个SNP，平均呼叫率为99.35%。我们的基线分析是Cochran-Mantel-Haenszel（CMH）测试，使用两组人（犹太人和非犹太人）来调节两组人遗传背景中潜在的细微差异。观察到的中位X平方稍有膨胀，因此我们使用1.056的基因组控制（GC）因子校正了所有统计数据。

该GC-校正CMH分析产生了显著过量的阳性关联-例如，9个不同基因组区域的27个SNP与p<10相关−5，考虑到所执行的测试数量，我们非正式地预计在本次扫描中会偶然观察到大约3次（参见图1和表1). 这两个最重要的基因座与CARD15和IL23R基因相对应，这两个基因座具有多个显著相关的SNP，之前已被确认为IBD基因。其余被鉴定为极端p值的区域都是新的，在对照中没有显示出异常的数据缺失或偏离Hardy-Weinberg平衡（HWE）的模式（在下面进一步检查的前23个区域中的最佳SNPs中，对照中所有的HWE-p>.01，18个缺失的基因型小于1%），并且许多都得到了附近相关SNP的支持，这些SNP也显示出相关性。应该注意的是中型散货箱5CD风险单倍型不在回肠CD研究的顶级位点中，因为它只有适度的相关性证据（p<0.01）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms-54814-f0001.jpg
946例回肠CD患者和977例对照样本的全基因组关联结果

使用Cochran-Mantel-Haenszel（CMH）检验对非犹太人和犹太人组合队列的单标记关联结果。每条染色体被描绘成不同的颜色，蓝线和红线分别表示基于Bonferroni多重检测校正的暗示阈值和显著阈值。为了校正病例和对照组之间的分层，需要应用适当的校正系数（λ1.06-1.07），但不会修改当前结果。

表1

对946名回肠CD患者和977名对照组进行的GWA研究总结，以及对530名回肠CD3人（复制#1）和350名回肠光盘患者和207名对照（复制#2）进行的复制研究总结

等级
#单核苷酸多态性
瑞士法郎
RS系列#
GWA公司
复制
#1
复制
#2
组合
复制
基因
镁合金
iCD（iCD）
镁合金
CTL公司
P值
T型
U型
镁合金
iCD（iCD）
镁合金
CTL公司
或
P值
18162076756卢比0.3580.2442014年1月7日P.T.公司。P.T.公司。P.T.公司。P.T.公司。P.T.公司。P.T.公司。卡15
21317517847卢比0.2950.4033.06E-12号机组P.T.公司。P.T.公司。P.T.公司。P.T.公司。第页。P.T.公司。IL23R（IL23R）
三三22241880卢比0.3640.4536.38电子-082203060.3530.4780.684.1 E-08ATG16L1型
41416853571卢比0.0380.0777.68电子-0739750.0570.0470.690.0084电话2B
5112886898卢比0.1560.1021.93E-06号机组121136未注明。未注明。未注明。未注明。-
6212343331卢比0.2790.2122.49E-06型失败失败未注明。未注明。未注明。未注明。-
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#SNPs=给定基因座GWA分析中显著SNPs的数量（Pvalue<3e-05）；MAF iCD=GWA研究和复制#2中回肠CD患者的次要等位基因频率；MAF CTL=GWA研究和复制#2中对照组的次要等位基因频率；T=复制#1中次要等位基因的传递次数；U=复制#1中次要等位基因未传递的数量；NT=未经测试（例如未能设计）；失败=基因分型失败；P.T.=之前在这些样品中测试过，并确认复制。注意：GWA结果的P值是双尾的，而联合复制研究的P值则是单尾的。所有23个位点均包含在复制#1中。复制#1中复制的所有六个位点的P值<0.05（如图所示大胆的)–包含在复制#2中。仅报告合并复制数据的Mantel-Haenszel OR和p值。有关两项复制研究结果的更多详细信息，请参阅补充表1在线。

两项独立的复制研究证实了新的IBD基因座

虽然确实令人鼓舞，但即使是一个整体高质量的数据集和稳健的分析也无法完全过滤出假阳性的所有人为来源。因此，我们在23个独立相关区域中测试了最显著相关的SNP，其中5个区域p<5×10−5在一组650名回肠CD患者及其父母的独立样本中（复制队列#1），尝试在一个强大的基于家庭的环境中，使用替代基因分型技术（iPlex；Sequenom）复制这些发现。尽管我们没有成功对其中三个SNP进行分型（CARD15和IL23R的复制已经建立，这里不考虑），但其余18个SNP的基因型数据质量较高，超过了我们的质量阈值。去除基因型呼叫率低的DNA和孟德尔错误过多的家族后，最终分析包括530个三组。对来自复制队列#1的最终数据集的关联测试表明，18个SNP中有6个具有显著的复制证据(表1; 看见补充表1在线）：rs2241880（p=0.00089）；rs16853571（p=0.00037）；rs224136（p=0.00021）；rs4821544（p=0.019）；rs8050910（p=0.024）；rs11617463（0.037）。为了进一步证明这些复制SNP的相关性，我们在另一个独立的基因分型平台（Taqman；Applied Biosystems）上对353名回肠CD患者和207名对照组（复制队列#2）的另一个单独队列中的这六个SNP进行了分型。其中一个未能键入，但其他五个已成功键入，并提供了复制的其他证据(表1; 看见补充表1在线）。综合考虑这两项复制研究（使用Mantel-Haenszel统计），其中两个SNP被明确确认为新的CD危险因素（rs2241880，p<5×10−8; rs224136，p<5×10−7). 结合全基因组扫描数据，这两个SNP明显超过了最保守的全基因组阈值（rs2241880，p＜10−13; rs224136，p<10−10). 另外三个位点（rs16853571、rs4821544和rs8050910）显示了非常有力的复制证据（p<0.01）。即使撇开两个最显著相关的新SNP（rs2241880和rs224136），观察到3/16个SNP的复制（p<0.01）也极不可能偶然发生（p=0.0005）。由于偶然观察到两个这样的结果的可能性只有1%，因此这三个SNP很可能代表真正的CD易感性变体，但需要进一步确认才能达到与本研究中确定的IL23R、rs2241880和rs224136 SNP相同的确定性水平。

关联映射暗示新的IBD基因

鉴于这五个新基因座有明显的复制证据，我们使用GWA筛查的基因型数据检查了围绕复制SNP的连锁不平衡结构，并检查了GWA的关联映射数据，复制研究以及一些额外的高密度分型，以便将这些关联信号映射到特定的基因组区域和基因。如所示补充图1在线上，在其中四种情况下，关联映射牵涉到特定基因，而在第五种情况下则牵涉到基因间区域。

具体而言，最相关SNP（GWA，p=6.4E-08；复制，p=4.1E-08）rs2241880周围的LD结构和关联映射暗示了染色体6 2q37.1上的一个区域包含一个称为ATG16自噬相关16-like 1（酿酒酵母）或ATG16L1基因的单基因。事实上，这个SNP编码一个非同义的氨基酸变化——外显子8中的丙氨酸到苏氨酸的取代——Ala197Thr。以基于家族的样本中的Ala197Thr为条件的Logistic回归分析表明，这种编码变体可以完全解释与该基因座的关联信号——因此我们认为这是因果风险变体。在本研究测试的所有数据集中，苏氨酸等位基因是次要等位基因，具有保护作用；在GWA数据集中，估计的比值比为0.692（95%CI为0.608-0.788）。有趣的是，苏氨酸是祖先的等位基因，是国际HapMap项目中YRI、JPT和HCB样本中的主要等位基因（参见补充图2在线）。ATG16L1是参与自噬的基因家族的一部分，自噬是蛋白质降解、抗原处理、，细胞信号和许多其他对炎症反应的启动和调节至关重要的途径的调节&因此，这种联系表明，这种生物过程可能在疾病的发病机制中发挥重要作用。

下一个与回肠CD无争议相关的SNP是rs224136（GWA，p=7.9E-06；复制，p=2.9E-07）。然而，这种情况下的关联映射暗示了染色体10q21.1上约70 kb的基因组区域，该区域不包含任何已知的蛋白质编码基因。这个相关的基因间区域位于着丝粒侧，两侧是锌指基因ZNF365，端粒侧是预测蛋白（c10或f22）和已知的早期生长反应基因EGR2，也是锌指蛋白。尽管对ZNF365和c10orf22基因知之甚少，但已知EGR2突变会导致先天性低髓鞘性神经病（MIM#605253）或Charcot-Marie-Tooth疾病（MIM#607678）的发展。然而，更相关的可能是EGR2似乎是小鼠T细胞活化的负调节因子12虽然是推测性的，但该基因间区域内的遗传变异可能在控制EGR2表达和影响生物功能方面发挥作用。

复制的SNP rs16853571（GWA，p=7.7E-07；复制，p=8.4E−03）位于染色体4p13上成对类同源框2B（PHOX2B）基因的启动子区域（参见补充图1在线）-第一个已知外显子上游2143 bp和假定的替代第一外显子下游10 bp。PHOX2B是一种同源域转录因子，主要在分化神经元中表达。人类PHOX2B基因突变与神经嵴发育障碍、先天性中枢性通气不足综合征和先天性巨结肠症有关13,14小鼠PHOX2B失活会破坏整个神经系统的去甲肾上腺素能分化。自主神经节发育不正常，这些小鼠肠道神经元有明显缺陷14-16。

由rs4821544（GWA，p=2.9E-05；复制，p=9.0E-03）鉴定的基因组区域还包含一个名为NCF4的单一基因（rs482154本身位于内含子1中）。NCF4编码7 p40phox蛋白，此前已证明该蛋白在NADPH氧化酶活性和吞噬时活性氧（ROS）生成中起重要作用17,18; 这两项对于建立有效的抗菌反应都很重要。

最后，rs8050910（GWA，p=3.3E-05；Replication，p=8.5E-03）位于4第个预测基因FAM92B的内含子位于染色体16q24.1上。这种基因预测得到了多个mRNA和拼接EST的支持，以及多个物种之间的显著保守性（数据未显示）。该基因编码的蛋白质没有已知的功能或可识别的基序。

应该注意的是，当使用分层分析方法时，这三个基因座似乎都没有与CARD15、IBD5或IL23R基因有任何统计学上显著的上位性相互作用（数据未显示）。虽然rs224136与UC有一定关联，但在其他新发现的SNP中几乎没有证据（参见补充表1在线）。

RNA和蛋白质表达分析为新基因提供了初步的生物学背景

由于我们有兴趣进一步了解ATG16L1的功能和生物学背景，我们通过定量实时RT-PCR检测了ATG16L2和其他已知自噬成分在多种上皮细胞和免疫细胞系中的表达分布（参见图2A、B和C). ATG5、7和16广泛表达，与GAPDH对照组相比，SW480细胞的总mRNA丰度最低。除了THP-1细胞中ATG7水平显著升高外，这三种成分的表达在所测试的细胞中均遵循相似的模式，这可能由稳态自噬过程中这些成分之间的化学计量关系所表明。我们还研究了ATG16L1在原代人类免疫细胞中的表达，以更好地了解其在与CD相关中的作用（参见图2D). 在测试的样本中，我们发现ATG16L1在T细胞室中表达最高，CD4+和CD8+细胞均显示高水平（分别约为胎盘对照RNA的13倍和10倍）。CD19+细胞（B细胞）的ATG16L1表达量几乎是单核细胞和胎盘对照RNA的5倍。因此，ATG16L1及其变体可能在CD的上皮和免疫驱动方面发挥作用。

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自噬成分在人细胞系和原代免疫细胞中的表达

采用实时定量PCR检测ATG5、7和16L1在多种人类免疫和上皮细胞系中的表达模式。A组-人类细胞系中ATG5的表达模式。ATG5似乎在所研究的细胞系中广泛表达，各细胞系的表达水平差异在1.5到4倍之间。B组-人类细胞系中ATG7的表达模式。ATG7的表达水平与ATG5的表达水平大致相当，但THP1细胞除外，其表达水平是SW480细胞的35倍。C组-人类细胞系中ATG16L1的表达模式。ATG16L1的表达也与ATG5和7的表达大致相似（但THP1细胞中的ATG7表达除外），在所测试的细胞系中表达水平存在中度差异（1.5到3.5倍）。D组-人类原代免疫细胞中ATG16L1的表达模式。在静息的人类免疫细胞RNA组（Clontech，CA）中，ATG16L1在T细胞区室中显示出明显的表达峰值，CD4+和CD8+细胞都表达高水平的转录物（比对照样品多15-20倍）。在CD19+细胞中检测到中等水平，在CD14+单核细胞和未分化单核细胞中检测出低水平。在所有情况下，实时定量RTPCR反应重复进行，并绘制平均值，误差条代表1个标准偏差。进行不含模板RNA的反应以控制反应污染（水对照）。通过与GAPDH对照组和绘制SW480或胎盘RNA等于1的任意相对表达单位（分别用于细胞系或原代细胞）进行比较，将表达水平归一化。所有RNA都是在没有刺激或激活的情况下从休眠细胞中分离出来的。

已知PHOX2B在自主神经系统和肠神经元中表达16使用实时RT-PCR测定表达的尝试失败，很可能是因为表达仅限于特定的细胞类型，因此研究组织中的总转录水平较低。为了克服这一局限性，我们获得了一种特异性抗体，并对小鼠和人类肠道样品（分别为回肠和结肠）进行了染色。这些清楚地表明PHOX2B蛋白在上皮细胞的特定亚群中表达，可能是神经内分泌细胞（参见补充图3在线）。

NCF4编码p40phox，这是NADPH氧化酶复合物的一种成分，是免疫细胞中产生最佳活性氧所必需的。表达仅限于造血细胞，包括中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞（参见补充图4和参考19). p40phox蛋白用于增强p47和p67phox向膜的传递，从而促进高活性氧的生成。然而，它在不产生高水平ROS、缺乏p47和p67phox表达的细胞中的作用尚不清楚。

针对ATG16L1的RNA干扰可防止自噬

尽管人类ATG16L1的酵母同源物是自噬所必需的20目前尚不清楚哺乳动物的亚型是否同样重要。我们通过利用针对ATG16L1亚型1和2的寡基siRNA来解决这一问题。通过联合转染标记的ATG16L1表达质粒和siRNA寡核苷酸，我们在HEK293细胞中建立了ATG16L的特异性敲除（参见图3A). 为了研究ATG16L1在一种特征明确的宿主-猪源相互作用过程中的自噬作用，我们在HeLa细胞中进行了ATG16L_1的敲除，然后S公司.伤寒杆菌感染。我们通过实时RT-PCR（参见图3B). 由于siRNA 2是最有效的，这被用于随后的实验，与表达GFP-LC3（自噬室的标记）的质粒共同转染21众所周知，内化沙门氏菌的一个亚群在该系统中以自噬为靶点22.感染S公司伤寒杆菌在对照细胞和siRNA 2处理的细胞之间显示出显著差异：对照细胞在1小时内将平均17.5%（+/−1.3 s.e.m）的细胞内细菌靶向自噬LC3+空泡，而siRNA 2转染将这一比例降至仅2%（+/-0.5 s.e.m图3C). 对照处理细胞和ATG16L1敲除细胞中的自噬靶向率与ATG5中的自吞噬靶向率相当+/+和ATG5−/−小鼠胚胎成纤维细胞（分别为20%和3%）22，证实与ATG5一样，ATG16L1也是自噬所必需的。感染细胞的共焦成像显示，尽管在对照细胞中存在丰富的细胞质LC3-GFP和目标细菌的完全包被，但ATG16L1-敲除细胞中的细胞内细菌几乎完全没有LC3定位（参见图3D). 此外，我们利用经典的自噬刺激来证明ATG16L1敲除的抑制作用（参见补充图5在线）；血清饥饿和雷帕霉素治疗24小时只在对照siRNA转染细胞中诱导LC3-GFP小泡，而不是在那些ATG16L1敲除的细胞中。氯化铵对溶酶体融合的抑制也可诱导对照细胞中LC3+小泡的快速积累，但在ATG16L1-siRNA处理的细胞中未发现这些结构（参见补充图5在线）。

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自噬需要ATG16L1沙门氏菌伤寒杆菌

面板A。用寡聚双链体转染HEK293细胞后48小时内，可实现对过度表达的标记ATG16L1的特异性siRNA敲除。用特异性siRNA构建物处理后，Western blotting检测不到Flag-ATG16L1的蛋白水平，但用对照双链体维持表达。

面板B。转染后48小时内，HeLa细胞内的内源性ATG16L1 mRNA被siRNA 2有效地敲除。用siRNA双工体转染HeLa细胞并使其生长48小时，然后分离RNA并进行实时定量RT-PCR。数据归一化为GAPDH对照，siRNA控制mRNA水平设置为1.0。与对照双链相比，siRNA 2的mRNA转录减少了89%。RT-PCR反应一式三份，用代表1个标准偏差的误差条绘制平均值，结果代表两个独立实验。

面板C。敲除ATG16L1可防止S公司HeLa细胞中的伤寒杆菌。用对照siRNA或双链2和LC3-GFP质粒联合转染HeLa细胞48小时后，用沙门氏菌伤寒杆菌SL1344，经固定和显微镜检查。显示了每个细胞被LC3+膜（自噬体）包裹的细菌的平均百分比和标准误差。细菌计数来自两个单独的实验，每个实验至少统计100个感染细胞。采用双尾学生T检验评估显著性，假设方差不相等。

面板D。细胞内典型图像S公司在对照siRNA处理的细胞中，鼠伤寒杆菌通过LC3+膜表现出正常的自噬包囊，但当ATG16L1敲除受到影响时，自噬靶向性丧失。用LC3-GFP质粒和siRNA转染HeLa细胞，然后按上述方法感染。分离通道以显示LC3-GFP融合蛋白（自噬体标记）和S公司.Typhiumurium SL1344 dsRed2（SL1344），最后一列中有一个合并图像。第2行和第4行分别显示了第1行和第3行中标记的区域的放大视图。图像是使用共焦显微镜获得的，是在感染细胞的整个平面上拍摄的Z堆栈的平面投影。比例尺表示5μm。

讨论

GWA研究在复杂疾病中发现适度遗传风险因素的潜力，多年来一直备受争议。资源的同时出现，例如国际HapMap项目的数据和基因分型技术的巨大飞跃（两者都明显受到这一潜力的推动），现在使这一假设得到了实际检验。就CD而言，大量国际研究人员多年的研究工作只发现了两种一致复制的、真正相关的遗传风险因素（CARD15和IBD5）。令人鼓舞的是，仅在第一次中等规模的GWA研究和适度的复制尝试之后，就提供了令人信服的证据，证明这个列表现在已经大幅增长，因为这项研究已经出现了IL23R、ATG16L1和10q基因间区域变异的明确有力的复制证据。此外，本研究中额外的低p值过多，尤其是三个额外的顶级SNP（在PHOX2B、NCF4和FAM92B中）在p<0.01处复制，再加上其他大规模GWA尝试正在进行，使得复制位点列表在短时间内进一步增长。事实上，自提交当前研究以来，已经发表了一份报告，描述了735名德国CD患者和547名比利时CD患者的全基因组关联研究23,24在德国的研究中，对7159个非同义SNP进行关联分析后，发现ATG16L1中的Ala197Thr与CD相关，证实该基因与CD易感性有关。然而，与我们的发现相反，该组报告了与CARD15的上位性相互作用。然而，值得注意的是，该研究中的相互作用信号主要是由于对照基因型与预期的偏差，而不是病例中异常的联合频率估计值（正如在上位性促进罕见疾病的情况下所预期的那样）。虽然这对一些遗传模型来说是可能的，但需要仔细调查。此外，由于不同的IBD基因表现出不同程度的表型特异性，如果分析中没有考虑这种特异性，那么促进相同特定亚表型的基因可能被视为相互作用。在比利时的研究中，作者使用Illumina HumanHap300基因分型芯片，确定了一个相关的SNP（rs1373692），该SNP与前列腺素受体EP4（PTGER4）基因在CD发病机制中有关。在当前的研究中，我们还发现了rs1373692 SNP与回肠CD（p=5.37E-04）以及40kb以外的SNP（rs4613763；p=1.21E-04）相关的证据，首次复制了这一发现。这些研究和其他正在进行的研究结果的全面发布和整合，似乎可能会进一步增加这一新兴的已确认关联列表。

然而，毫无疑问，GWA方法和其他任何遗传方法一样都有局限性，因此，基因发现的补充策略仍将是必要的25一个局限性是与我们的能力有关的，即我们能够键入足够大的队列，以便有足够的统计能力来检测遗传效应非常轻微的基因座25我们当前研究的一个例子是IBD5单倍型缺乏基因组范围内的显著相关性，尽管这是一个已证实的CD风险单倍型26尽管在一项针对性复制研究中，我们发现了大量复制证据27然而，应注意的是，当前GWA研究中IBD5相关性的强度与该基因座带来的中度风险相一致28在认识到GWA研究设计固有的局限性的同时，这些当前和未来的关联发现也有可能显著改变我们对疾病发病机制至关重要的生物过程的理解，鉴于我们目前对致病机制的理解并没有对全基因组搜索产生偏见。这方面的一个主要例子是我们的发现，ATG16L1基因与IBD相关，因为在当前一代基因组扫描之前，该基因或其所属的自噬生物途径在IBD发病机制中没有牵连。

自噬是细胞内环境稳定和细胞器更新所必需的组成过程。然而，最近的数据揭示了自噬在对病原体的先天性和适应性免疫反应中的作用29这使自噬成为先天免疫配体和细胞内抗原提呈的守门人。到目前为止，对自噬在先天免疫识别中的作用研究很少，但已经确定了几个在宿主防御中具有潜在作用的系统30-32.我们利用入侵细菌开发了一个模型系统S公司.培养的人类上皮细胞中的伤寒杆菌22为了证明除了经典的自噬刺激，如血清饥饿和雷帕霉素外，ATG16L1还需要对暴露于细胞质的细胞内沙门氏菌亚群进行自噬靶向。虽然我们不认为这代表了CD所涉及的生理刺激，但我们相信它提供了初步证据，表明自噬效率/功效改变的ATG16L1变体可能会改变细菌复制和免疫控制，或抗原向适应性免疫途径的递送。例如，先天免疫、炎症小体和自噬之间的相互作用已被提出用于嗜肺军团菌33所提出的机制依赖于NOD-LRR家族成员（Naip5）检测入侵的嗜肺杆菌并随后激活自噬，或者如果Naip5信号持续，则通过caspase 1促进炎症细胞死亡。鞭毛蛋白与微生物制品的反应和慢性肠道炎症之间的关系已经被发现，结肠绞痛小鼠和CD患者的抗鞭毛蛋白血清IgG升高34由于现在已知TLR7介导的病毒复制检测依赖于自噬35很容易推测，不同的自噬效应可能会增强细胞内病原体基于NOD-LRR家族的信号缺陷。

适应性反应也受到自噬过程的影响，因为溶酶体中存在HLA II类分子负载，自噬将细胞质成分传递到该腔室。在专业抗原提呈细胞和上皮细胞中观察到通过该途径装载抗原36在低内吞水平的细胞中，如上皮细胞，这可能是抗原提呈和免疫监视的重要途径37自噬器内变异引起的不同速率或底物特异性可能会导致不同的抗原提呈，正如在饥饿应激中观察到的B细胞37在CD和其他炎症性疾病的许多模型中，T细胞是主要的效应器，自噬是T细胞维持和体内平衡的重要过程，如ATG5中细胞死亡增加所示−/−T细胞及其在刺激后无法增殖38肠道微环境中的细菌产物也可以直接刺激T细胞，I2超级抗原的发现证明了这一点39鉴于自噬在控制T细胞死亡和增殖中的作用，ATG16L1介导的T细胞增殖和存活能力的改变为CD中观察到的一些T细胞驱动的病理学提供了可能的解释。T细胞存活和调节与此处讨论的ATG16L1变异体之间的关系将是进一步研究的重要领域。

虽然我们对NCF4基因与回肠CD潜在关联的观察尚未明确证实，但该基因的已知功能值得进一步研究。特别是，先前对NCF4基因编码的p40phox蛋白的研究表明，它在NADPH氧化酶活性和吞噬时活性氧（ROS）生成中起着重要作用17,18; 这两项对于建立有效的抗菌反应都很重要。基因表达的改变可能会对吞噬功能产生潜在影响，对吞噬微生物的杀灭效果较差，并可能导致免疫激活时间延长、病原体清除不完全或可能由于ROS生成不当而影响TLR激活和抗原提呈40,41。持续暴露于细菌挑战和肠道内高抗原负荷可能会对即使轻微改变的先天免疫反应造成特殊困难，从而导致肠道限制性表型。此前，在一些慢性肉芽肿性疾病（CGD）患者中观察到这种肠道限制，这些患者的初始症状导致了CD的诊断。因此，我们认为NCF4的突变可能会干扰与p67和其他p47phox相互作用伙伴相互作用的化学计量学，从而导致相对温和的吞噬体功能障碍表型，足以触发IBD的发病。

虽然需要进行额外的功能研究，以将所有这些新基因座置于生物学背景下，从而能够更深入地了解它们在正常体内平衡和疾病发病机制中的作用，但毫无疑问机会成功应用强大的GWA研究为我们对CD的理解和最终治疗提供了帮助。

方法

受试者确定和诊断分类

这个筛选队列本次GWA研究使用的是来自北美NIDDK IBD遗传学联合会（IBDGC）的988名回肠CD患者和1007名对照。通过Cedars-Sinai医学中心、约翰·霍普金斯大学、芝加哥大学、蒙特利尔大学、匹兹堡大学和多伦多大学遗传学研究中心（GRCs）确定病例和地理匹配的对照，纽约健康项目提供了额外的年龄和种族匹配控制。在所有情况下，所有参与机构均使用当地机构审查委员会批准的协议获得知情同意。IBD的诊断需要a）一个或多个腹泻、直肠出血、腹痛、发热或复杂肛周疾病的症状，b）两次或两次以上出现症状，间隔至少8周或持续至少6周的症状，以及c）放射学、内窥镜、，组织学评价。根据内窥镜检查报告、钡X射线、手术报告和/或病理切除标本报告，回肠CD受累被定义为粘膜溃疡、鹅卵石样结石、狭窄或肠壁增厚。这是一个包容性的定义，即“仅回肠”或“回肠结肠”患者属于“回肠CD”类别。我们之前在567名CD患者和571名对照组的全基因组研究中报告了IL23R基因与IBD的相关性11这些样本包括在当前研究中，另外还有421名回肠CD和436名对照个体，均以相同的方式确定。

复制队列#1由883个核心家庭组成，这些家庭独立于筛查队列。这些研究对象由如上所述的IBDGC遗传学研究中心收集，如前所述11包括650名回肠CD患者及其父母。在GWA筛查中，对19/23个具有显著相关性（p<5E-05）的SNP进行了复制队列#1的分型（CARD15和IL23R之前已经分型，另外两个SNP在分析设计阶段失败）。

复制队列#2由978名IBD患者（其中353名患有上述定义的回肠CD）和207名对照个体组成，这是加利福尼亚州洛杉矶Cedars-Sinai医疗中心炎症肠道中心正在进行的基因研究的一部分。西达斯-西奈医疗中心机构审查委员会已批准招募受试者。在复制队列#1（rs2241880、rs16853571、rs224136、rs4821544、rs8050910和rs11617463）中有显著复制证据（p<0.05）的六个SNP被分为复制队列#2。

基因分型方法

对于全基因组关联研究，大约750ng的基因组DNA用于在范斯坦医学研究所的Illumina HumanHap300基因分型芯片（Illuminia，圣地亚哥）上对每个样本进行基因分型。样品根据Illumina Infinium 2分析手册进行处理。简单地说，每个样品都是全基因组扩增、碎片化、沉淀并重新悬浮在适当的杂交缓冲液中。将变性样品在制备的HumanHap300珠芯片上在48°C下杂交至少16小时。杂交后，对珠芯片进行单碱基延伸反应处理，在Illumina珠阵列读取器上进行染色和成像。将每个样品获得的标准化珠子强度数据加载到Illumina Beadstudio 2.0软件中，该软件将荧光强度转换为SNP基因型。所有假定基因座的复制研究(表1)和其他基因分型ATG16L1型该区域使用引物延伸化学和质谱分析（iPlex分析，Sequenom，圣地亚哥），使用SequenomGenetics Services（Sequenom-San Diego）。TaqMan MGB技术用于在复制研究#1中使用Applied Biosystems提供的设计并遵循制造商在Cedars-Sinai炎症性肠病中心队列中的建议（公告#4317594）对六个具有标称复制的变体进行基因分型。通过重复性检查SNP数据的质量，重复5%的样品。

GWA数据分析

总的来说，98.6%的基因型在本实验中被调用；然而，在分析之前，对样本和SNP进行了质量过滤，以确保稳健的关联测试。基于对经验分布、数据质量和可能引入的假阳性关联的评估，我们要求样本通过93%的基因分型呼叫率阈值，SNP通过95%的呼叫率阈值才能纳入分析（参见补充图6在线）。全基因组关联研究的数据用于检测病例对照队列中可能的相关性。HWE测试是在对照组的基因型数据上进行的，我们调查了HWE与基因型产量（呼叫率）之间的关系。呼叫率分布表明，在遗传关联分析中，样本和SNP的基因型完成阈值分别为95%和93%。在样本呼叫率为90%及以下时，观察到的杂合性有所提高，表明缺失数据存在偏差或存在假杂合呼叫。为了避免这种情况，我们在与成功样本尾部一致的点上选择了一个大于90的阈值。SNP成功率低于95%时，HWE的标记物过多（对照组的P值<0.001），病例和对照组之间的缺失数据存在显著偏差。我们查看了该截止点上下15个数据段，发现具有90-95%呼叫率的SNP比95-97%呼叫率范围内的SNP有更大的通货膨胀（基因组控制校正1.34 vs.1.16）这表明由于缺失数据的数据质量/偏差较低，误报率显著超标，因此我们选择不进一步降低这个阈值。作为最后一步，使用该数据集中的按状态识别（IBS）计数，我们确定了8个重复样本和10对额外样本，这些样本按血统共享其基因组的10%或更多（从第一代表亲到全同胞），我们在这18对样本中每一对中删除了一个成员。使用Cochran-Mantel-Haenszel chi-squared检验联合分析犹太和非犹太病例对照队列的数据；我们使用了R中实现的测试(http://www.r-project.org/)带有给出精确p值的选项。

复制研究数据分析

在复制研究中，前23个独立相关区域的最显著相关SNP（p值=5×10−5在组合筛选分析中）。其中，2个试验设计失败，1个未能定型，2个位于先前报告的相关位点内，在复制分析中留下18个SNP。除此之外，还选择了19个额外的SNP来测试ATG16L1区域的变异性。这组SNP在一个由650个母亲-父亲影响的后代组成的家庭回肠-CD队列中进行了复制评估。来自家庭队列的基因型数据用于确定孟德尔不一致性和偏离HWE。剔除不合格的SNP（单态，呼叫率低于75%，并导致大量孟德尔错误）、孟德尔不一致过多的家庭和无信息的家庭（父母或唯一受影响的后代的基因分型呼叫率低于90%）后，仍有530个受影响的三人组（来自431个独立的核心家庭）父母双方和至少一个受影响的后代进行基因分型。在去除导致过度孟德尔错误的额外SNP后，18个复制标记以及19个ATG16L1标记SNP中每个标记的最终基因分型调用率为90-100%，所有标记的孟德尔不一致性低于4，每个家族不到4。使用PLINK对家族数据进行单标记关联测试(http://pngu.mgh.harvard.edu/~ purcell/plink/). 然后，我们在来自NIDDK IBDGC的530个独立IBD三联体（QC后）和350名回肠CD患者和207名对照的独立Cedars-Sinai队列中测试了复制的SNPs，并报告了一次失败的p值。以Ala197Thr为条件的ATG16L1 SNPs的分析是使用WHAP软件在基于家族的样本中通过逻辑回归进行的(http://pngu.mgh.harvard.edu/~purcell/whap).

ATG16L1的mRNA分析

使用RNeasy miniprep试剂盒（Qiagen）从细胞系中纯化RNA模板。就人类初级免疫细胞亚群而言，RNA是从商业供应商处购买的（人类血液成分MTC小组，Clontech）。在所有情况下，cDNA都是使用标准逆转录酶协议（iScript，BioRad）从RNA模板中生成的，每个反应含有500 ng RNA。将所得模板cDNA在无核酸水中以1:10的比例稀释，并在每次40 ul qPCR反应中使用10 ul该模板。使用实时SYBR Green方法，使用iQ SYBR Green-Supermix（BioRad）和特异性引物，在BioRad-iQ5热循环器上进行定量RT-PCR。使用MGH Primerbank选择引物序列(http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/); 所有引物序列如所示补充表2PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行可视化，以确认正确的条带大小。每个反应都进行了两次，最后的计算结果来自于重复的井。使用每个模板的GAPDH控制引物对cDNA数量进行归一化，并使用delta-delta-Ct方法调整最终丰度数字，以产生控制模板的任意值1（SW480用于细胞系或胎盘控制RNA用于原代细胞）。

PHOX2B在小鼠和人肠道组织中定位的免疫组织化学研究

将小鼠回肠和人类结肠生物切片中的石蜡包埋组织脱蜡、复水、封闭在血清中，并使用兔抗PHOX2B抗体（Sigma）染色，以1:500的稀释度培养过夜。随后用生物素化抗兔二级抗体、载体ABC试剂培养组织，最后用DAB底物（载体实验室）进行培养，如前所述42在相位对比下安装切片并观察，以可视化组织结构。

细胞系和菌株

从ATCC中获得HeLa细胞，并在补充有10%铁补充小牛血清（CSFe）（Hyclone）和20μg ml的DMEM中培养−1硫酸庆大霉素（Sigma）。肠道沙门菌sbsp。肠伤寒血清型(S公司Typhimurium），菌株SL1344用DsRed2表达质粒（Clontech，CA）转化紫胶启动子，在缺乏紫胶)以便于细菌可视化。质粒保持在100μg ml−1LB肉汤培养过程中氨苄西林的选择。

针对ATG16L1的siRNA

我们从商业来源（Invitrogen）获得了针对ATG16L1（siRNA 1和2）的修饰siRNA双工体（隐形siRNA）以及非靶向的加扰序列（siRNA控制）。根据制造商的说明，在不含抗生素的情况下，用siRNAs和使用脂质体（Invitrogen）的质粒共同转染细胞。我们在HEK293细胞中使用标记过表达的ATG16L1构建物优化了17个siRNA条件，使我们能够通过Western blotting轻松评估敲除。将500 ng Flag-ATG16L1表达质粒和20 pmol siRNA双链转染12孔板中生长的HEK293细胞。为了敲低内源性ATG16L1，将HeLa细胞以1×10的密度接种在12孔板中的18mm玻璃盖玻片上5好−1并在转染前允许生长24小时。每个孔接受500ng GFP-LC3质粒和20pmol siRNA双链。四小时后，再次更换培养基，让细胞再生长48小时。使用ATG16L1特异性引物的实时定量RT-PCR对每个实验进行敲除，并将其归一化为GAPDH对照，从样本孔中分离出RNA。

自噬诱导与细菌感染

用血清饥饿或雷帕霉素诱导HeLa细胞自噬。如上所述转染细胞，48小时后，将培养基换成1%血清或10%血清加200 nM雷帕霉素再转染24小时。在1%血清培养基中以50 mM的最终浓度进行氯化铵处理2小时。S公司.如前所述，进行了伤寒杆菌感染，但有轻微修改43简单地说，S公司携带DsRed2表达质粒的伤寒杆菌SL1344在含有100μg ml的LB肉汤中培养过夜−1氨苄西林在37°C下曝气并在LB中以1:33的稀释度继代培养3小时。该培养物在不含抗生素的10%DMEM CSFe中进一步稀释，得到100的m.o.i。感染持续20分钟，细胞在含有100μg ml的完整培养基中清洗一次−1硫酸庆大霉素，然后在新鲜的高庆大霉素培养基中培养1小时。

显微镜

将感染的、自噬诱导的和对照HeLa细胞固定在4%福尔马林中的PBS中15分钟，在PBS中清洗并安装在水性贴装剂中（Polysciences，PA）。然后，在广域荧光照明（蔡司Axioplan）下观看幻灯片进行计数，或使用激光扫描共焦显微镜（BioRad Radiance 2000）获得高分辨率z堆栈，然后使用LSM图像软件（德国卡尔蔡司股份有限公司）将其投影到单个图像上。在随机选择的区域中评估每个细胞的细菌总数和LC3-GFP阳性细菌的数量，每个条件下至少计数100个细胞。然后计算LC3-GFP阳性细菌的数量占细菌总数的百分比。使用双尾不等距Student’s T检验评估显著性。

补充材料

1

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鸣谢

我们感谢患者及其家人参与这些研究。我们感谢所有临床医生、研究护士和研究协调员为这项工作做出的重要贡献。作者要感谢D.Caplan、G.Charron、C.Labbé、C.Lefebvre和D.Miclaus在编写手稿时的帮助，感谢J.Adams在免疫组化、A。兰德里表情研究，并向D·阿尔舒勒致敬，感谢他对手稿的批判性阅读。国家糖尿病、消化道疾病和肾脏疾病研究所IBD遗传学联合会由以下赠款资助：DK62431（S.R.B.）、DK62420（R.H.D.）、DK6432（J.D.R.）、DK61423（M.S.S.）、丹麦62413（K.D.T.）、以及DK62422和DK62429（J.H.C.）。A.H.S.是Shire Pharmaceuticals、Schering（加拿大）和宝洁制药公司的科学咨询委员会成员。关于Cedars-Sinai队列的工作得到DK 46763（J.I.R.）项目1的支持。R.J.X.得到以下拨款AI062773和DK43351的支持。

参考文献

1Loftus EV.，Jr.炎症性肠病的临床流行病学：发病率、流行率和环境影响。胃肠病学。2004;126:1504–17.[公共医学][谷歌学者]
2波多尔斯基DK。炎症性肠病。英国医学杂志。2002年；347:417–29.[公共医学][谷歌学者]
三。Halfvarson J，Bodin L，Tysk C，Lindberg E，Jarnerot G.瑞典双胞胎队列中的炎症性肠病：一致性和临床特征的长期随访。胃肠病学。2003;124:1767–73.[公共医学][谷歌学者]
4Thompson NP、Driscoll R、Pounder RE、Wakefield AJ。炎症性肠病的遗传与环境：一项英国双胞胎研究的结果。Bmj公司。1996;312:95–6. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
5Tysk C、Lindberg E、Jarnerot G、Floderus-Myrhed B.未经选择的单卵和双卵双胞胎人群中的溃疡性结肠炎和克罗恩病。吸烟对遗传力和影响的研究。内脏。1988;29：990–6。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
6Hugot JP等。NOD2富含亮氨酸重复序列变异与克罗恩病易感性的相关性。自然。2001;411:599–603.[公共医学][谷歌学者]
7Ogura Y等。NOD2的移码突变与克罗恩病易感性相关。自然。2001;411:603–6.[公共医学][谷歌学者]
8Rioux JD等。5q31细胞因子基因簇的遗传变异导致克罗恩病的易感性。自然遗传学。2001;29:223–8.[公共医学][谷歌学者]
9Bayless TM等人。克罗恩病：受影响家庭成员的部位和临床类型的一致性——潜在的遗传影响。胃肠病学。1996;111:573–9.[公共医学][谷歌学者]
10Economou M、Trikalinos TA、Loizou KT、Tsianos EV、Ioanidis JP。NOD2变体对不同人群克罗恩病风险和表型的差异影响：荟萃分析。美国胃肠病杂志。2004;99:2393–404.[公共医学][谷歌学者]
11Duerr RH等。一项全基因组关联研究确定IL23R为炎症性肠病基因。科学。2006年；314:1461–3. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
12Safford M等人。Egr-2和Egr-3是T细胞活化的负调节因子。自然免疫学。2005;6:472–80.[公共医学][谷歌学者]
13Cargnin F等。PHOX2B通过转录自动调节机制调节其自身表达。生物化学杂志。2005;280:37439–48.[公共医学][谷歌学者]
14Pasqualetti M，Rijli FM。同源盒基因突变和脑-体发育障碍：从基因敲除小鼠学习。神经醇电流。2001;14:177–84.[公共医学][谷歌学者]
15Brunet JF，Pattyn A.Phox2基因——从模式到连接性。当前操作基因开发。2002年；12:435–40.[公共医学][谷歌学者]
16Pattyn A、Morin X、Cremer H、Goridis C、Brunet JF。同源异型盒基因Phox2b对于自主神经嵴衍生物的开发至关重要。自然。1999;399:366–70.[公共医学][谷歌学者]
17Ellson CD等。p40phox−/−小鼠的中性粒细胞在NADPH氧化酶调节和氧化依赖性细菌杀伤方面表现出严重缺陷。《实验医学杂志》。2006年；203：1927年至37年。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
18Suh CI等。在FcgammaIIA受体诱导的吞噬作用期间，磷脂结合蛋白p40phox激活NADPH氧化酶。《实验医学杂志》。2006年；203:1915–25. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
19詹S，等。人类p40-phox的基因组结构、染色体定位、转录起始和组织表达，p40-pox是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶复合物的一种新成分。鲜血。1996;88:2714–21.[公共医学][谷歌学者]
20Kuma A、Mizushima N、Ishihara N、Ohsumi Y。约350-kDa Apg12-Apg5.Apg16多聚体复合物的形成，由Apg16寡聚化介导，对酵母的自噬至关重要。生物化学杂志。2002年；277:18619–25.[公共医学][谷歌学者]
21Kabeya Y等。LC3是酵母Apg8p的哺乳动物同源物，加工后定位于自噬体膜。Embo J。2000;19:5720–8. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
22伯明翰CL、Smith AC、Bakowski MA、Yoshimori T、Brumell JH。自噬控制沙门氏菌感染，以应对含有沙门氏杆菌的液泡受损。生物化学杂志。2006年；281：11374–83。[公共医学][谷歌学者]
23Hampe J等。非同义SNPs的全基因组关联扫描确定了ATG16L1中克罗恩病的易感性变体。自然遗传学。2007;39:207–11.[公共医学][谷歌学者]
24Libioulle C等。通过全基因组关联确定的克罗恩病新易感性位点映射到染色体5p13.1上的一个基因沙漠，并调节前列腺素受体EP4的表达水平。公共科学图书馆-遗传学。2007[PMC免费文章][公共医学]
25Wang WY、Barratt BJ、Clayton DG、Todd JA。全基因组关联研究：理论和实践关注点。Nat Rev基因。2005;6:109–18.[公共医学][谷歌学者]
26Daly MJ，Rioux JD。IBD基因搜索的新方法。炎症性肠病。2004;10:312–7.[公共医学][谷歌学者]
27Silverberg MS等。针对IBD5与克罗恩病的相关性观察到的精细基因组定位和种族差异。《欧洲人类遗传学杂志》。2007;15:328–35.[公共医学][谷歌学者]
28阿拉斯加州阿巴斯Rioux JD。了解自身免疫性疾病遗传基础的途径。自然。2005;435:584–9.[公共医学][谷歌学者]
29皮肤病V.先天性和适应性免疫中的自噬。趋势免疫。2005;26:523–8.[公共医学][谷歌学者]
30Amer AO，Byrne BG，Swanson MS。巨噬细胞快速将病原体从脂筏空泡转移到自噬体。自噬。2005;1:53–8. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
31Nakagawa I等人。自噬保护细胞抵抗入侵的A组链球菌。科学。2004;306:1037–40.[公共医学][谷歌学者]
32Singh SB、Davis AS、Taylor GA、Deretic V.人类IRGM诱导自噬以消除细胞内分枝杆菌。科学。2006年；313:1438–41.[公共医学][谷歌学者]
33Swanson医学博士。自噬：为了健康而吃。免疫学杂志。2006年；177:4945–51.[公共医学][谷歌学者]
34Lodes MJ等。细菌鞭毛蛋白是克罗恩病的主要抗原。临床投资杂志。2004;113：1296–306。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
35Lee HK、Lund JM、Ramanathan B、Mizushima N、Iwasaki A。浆细胞样树突状细胞对自噬依赖性病毒的识别。科学。2007;315:1398–401.[公共医学][谷歌学者]
36Schmid D，Pypart M，Munz C.主要组织相容性复合体II类分子的抗原装载区持续接受自噬体的输入。免疫。2007;26:79–92. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
37Denggel J等人。自噬促进细胞内源蛋白多肽的MHC II类表达。美国国家科学院院刊。2005;102:7922–7. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
38Pua HH、Dzhagalov I、Chuck M、Mizushima N、He YW。自噬基因Atg5在T细胞生存和增殖中的关键作用。《实验医学杂志》。2007;204:25–31. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
39Dalwadi H，Wei B，Kronenberg M，Sutton CL，Braun J。克罗恩病相关细菌蛋白I2是一种新型肠道t细胞超抗原。免疫。2001;15:149–58.[公共医学][谷歌学者]
40Matsue H等。抗原呈递过程中树突细胞中活性氧的产生和功能。免疫学杂志。2003;171：3010–8。[公共医学][谷歌学者]
41Nakahira K等。一氧化碳通过调节ROS诱导的TLR向脂筏的转运来差异性抑制TLR信号通路。《实验医学杂志》。2006年；203:2377–89. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
42Maison SF，Adams JC，Liberman MC。小鼠橄榄叶神经支配：免疫细胞化学图，交叉与非交叉贡献，以及递质共定位。《计算机神经学杂志》。2003;455:406–16. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
43Beuzon CR等。沙门氏菌通过SifA的作用保持其细胞内液泡的完整性。Embo J。2000;19:3235–49. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]