GPCR结构建模和对接理解的社区评估

摘要

介绍

分子模型在合理的药物发现和设计中具有重要作用^1,2可靠的三维模型可以为分子识别的基本原理提供有价值的见解，并有助于采用基于结构的药物设计方法来引导发现和优化^三G蛋白偶联受体（GPCR）是参与信号转导途径的膜蛋白，是许多疾病的重要治疗靶点^4,5因此，使用以下方法进行的重大结构预测工作从头开始的基于同源性的方法已经应用于GPCR家族的成员^6,7直到最近，大部分GPCR同源性建模工作都是基于牛视紫红质和细菌视紫红质的模板，通过分子动力学模拟、配体对接和引入额外的生物化学和生物物理数据来完善模型^8–12精细化步骤对于建立准确的模型是必要的，尤其是在配体结合位点周围，这是因为由于序列一致性普遍较低和家族内配体多样性较大导致家族成员之间的预期结构差异^7,13–15以及与不同配体功效相关的各种构象状态^16–18.

最近解决的GPCR结构是人腺苷A的2.6μl晶体结构_2安培与拮抗剂结合的受体¹⁹腺苷受体属于A类视紫红质样GPCR家族，被认为是多种疾病的潜在治疗靶点，包括脑缺血和心脏缺血疾病、睡眠障碍、免疫和炎症障碍以及癌症²⁰.A_2安培结构显示出与视紫红质和肾上腺素能受体结构完全相似的七个跨膜螺旋结构，螺旋的位置和方向发生了变化，细胞外环的结构也有显著不同¹⁹.

为了评估GPCR结构预测和对接的当前进展，我们进行了一项社区盲预测实验（GPCR Dock 2008），与人类腺苷a的释放相协调_2安培2008年10月受体结构¹⁹GPCR Dock 2008的组织方式与CASP和CAPRI实验的组织方式类似^21,22，旨在评估GPCR结构建模和对接的当前状态，并突出方法开发中未来努力的领域。在本文中，我们报告了评估结果，以及我们对GPCR结构现状和配体对接预测的分析。

2008年GPCR码头

2008年8月，在人类腺苷A发表之前_2安培2008年10月结构¹⁹，参和预测者被要求盲目预测并提交多达10个人类A的排名模型_2安培受体与配体ZM241385形成复合物，从受体的氨基酸序列开始，形成配体的二维结构。最初共有63名不同的个人注册，最终数据集中有29名不同的人提交了206个模型。请注意，206个提交的模型中有37个要么缺少配体，要么配体的键连接性不正确。我们评估了其余169个模型对配体结合模式的预测准确性，所有206个模型仅对受体的预测准确性进行了评估。

评估标准

评估标准取决于生成模型的目的。鉴于GPCR结构模型在扩展我们在基本分子识别方面的知识方面的主要价值及其在新小分子设计和开发中的潜在用途，模型的质量主要通过配体结合模式的准确性进行评估。特别注意到晶体结构是一种具有位置误差的静态结构，建模的价值最终是指导药物发现和生物洞察。我们对配体结合模式准确性的数字测量基于两个指标，即配体RMSD和正确的受体-接触数量。这两个指标都不足以准确预测配体结合位点；因此，这两种方法都被用于z-score评分方案中，以对模型进行排序。

将模型的蛋白质Cα原子与晶体结构叠加后，模型与晶体结构之间的配体RMSD计算为ZM241385的25个非氢原子的坐标均方根偏差（RMSD）。此外，还计算了配体RMSD，不包括具有高B因子值的ZM241385的苯氧基。正确接触的数量被计算为在蛋白质原子和配体之间观察到的正确预测的天然接触的数量。天然接触被定义为晶体结构中配体4°范围内的任何原子间距离。有75个这样的接受器和触点，另外还有15个用水形成的触点。

通过给每个模型分配一个混合的z评分对模型进行排序。合并的z评分计算为配体RMSD的z评分和正确接触次数的平均值：Z轴_合并=(−Z轴_{利甘德RMSD}+Z轴_{N _正确的联系人})/2. 配体RMSD的z分数和正确接触的数量分两次计算，如下所示：i）使用所有模型的平均值和标准偏差值为每个模型分配一个z分数，ii）重新计算平均值和不包括z分数高于两个标准偏差的模型的标准偏差（对于配体RMSP）并且低于平均值（对于正确接触的数量），iii）使用在步骤ii中获得的修订后的平均值和标准偏差值，重新为每个模型设计一个z评分。分析各组中最佳模型，即综合z评分最高的模型。

总体结果

提交的模型显示配体结合模式的预测精度分布广泛，配体RMSD的平均值为9.5°（s.d.3.8°），正确接触数的平均值是4°（s.d.7(图1A).. 这些统计数据表明，大多数提交的模型并不能非常准确地预测配体位置和结合相互作用。此外，配体RMSD和结合位点RMSD之间缺乏强相关性(图1B)例如，具有<4.0μl结合位点RMSD的模型具有2.8到17.2μl配体RMSD的范围，这表明一些配体对接方法的性能较差，可以改进。

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图1

提交模型的RMSD。（A） 所有模型的配体RMSD（金条）和蛋白质CαRMSD（蓝条）的分布。（B） 配体RMSD散点图(年轴）与结合位点RMSD(x轴）。计算结合位点残基（F168）的重原子的结合位点RMSD值^5.29，E169^5.30，M177^5.38，带246^6.48，L249^6.51，H250^6.52，N253型^6.55，H264^6.66，M270^7.35)在使用蛋白质Cα原子将模型叠加到晶体结构之后。

很少有模型在配体RMSD和正确接触数方面都得分良好（在169个受体-配体模型中，只有13个模型的综合z得分大于1，而仅在配体RM SD中得分良好的模型有40个，Z轴_{配体和RMSD}<−1.0). 对于配体RMSD值相对较低但正确接触次数较少的模型，结合相互作用的不准确性可能归因于配体结合残基的侧链位置错误。尽管近三分之一的模型捕捉到了N253之间的氢键相互作用^6.55配体的侧链和外环N15原子（169种模型中有44种具有<4 A N253 OD1–ZM241385 N15相互作用距离），其他关键的受体-配体相互作用，例如F168之间的芳香堆积相互作用^5.29在大多数模型中，配体的侧链和双环没有被很好地捕获(图2).

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图2

统计所有模型中的两个关键受体和相互作用。（A） 与N253的氢键相互作用^6.55以及与F168的芳香族堆积相互作用^5.29用虚线表示与晶体结构的距离测量值。（B） N253中侧链羰基氧OD1原子相互作用距离的分布^6.55和配体的外环N15原子，以及F168中重原子之间芳香堆积相互作用的平均原子间距^5.29ZM241385的侧链和双环（原子C11、N12、N13、C14、N15、N16、N17、C18、N19、C20）。（C） 氢键相互作用距离散点图(年轴）与芳香族堆积相互作用(x轴）。

虽然总体结果清楚地表明，准确预测配体结合模式仍然存在挑战，但仅对受体的预测质量似乎要高得多：受体CαRMSD为4.2±0.9º，跨膜螺旋CαRMSD2.8±0.5º；在大多数模型中，除了ICL1（细胞内环路1）外，环路区域没有被准确建模(图3A、B和图4). 值得注意的是，一些准确预测受体TM区域的组不能很好地预测配体结合模式（TM CαRMSD:2.0º用于Pogozheva/Lomize，2.1º用于Horst/Roy），表明受体建模和配体对接的方法通常可以被视为受体-配体复合物模型生成的不同步骤。

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图3

所有206个提交模型与人类腺苷A晶体结构的叠加_2安培受体（PDB ID:3EML，不含T4-溶菌酶）。使用PyMOL（版本1.0r2，网址：www.pymol.org). 受体显示为Cα迹线（A，B）的两个正交视图，管道厚度与每个Cα位置的RMSD成正比，清楚地显示了TM区域建模的效果以及回路区域的不确定性。（C） 根据169个模型中配体（ZM241385）的棒状图叠加，使用CPK模型来描绘晶体结构中的观察位置。从所有模型中去除C末端（残基数>306）。

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图4

TM螺旋I至VII（螺旋I：6–34；螺旋II：40–67；螺旋III：73–107；螺旋IV：117–142；螺旋V：173–205；螺旋VI：222–258；螺旋VII：266–291）和环区（ICL1:35–39；ICL2:108–116；ECL1:68–72；ECL2:143–172，不包括晶体结构中缺失的149–155；ECL3:259-265）。

模型示例

尽管准确预测受体-受体相互作用存在明显困难，但一些模型具有与晶体结构一致的特征，尽管模型排名仍然是最具挑战性的发展领域之一。在这里，我们将重点放在根据综合z评分排名的前十组预测上，并更详细地评估模型质量(图5). 请注意，如果只对一个目标进行预测，则无法判断组排名的统计显著性，这在CASP实验中通常是通过对顶级组之间的共同目标进行面对面的比较来完成的²³为了进一步支持我们对最佳预测的选择，我们使用另一种度量方法对所有模型进行了排名，即结合位点接触RMSD，它以相等的权重处理所有配体结合残基，是所有配体连接残基上受体与接触距离的RMSD。我们发现，z-score排名和contactRMSD排名都同意选择最佳模型，以及大多数其他顶级预测。

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图5

正确接触次数的散点图(年轴）与配体RMSD(x轴）以获得所有组的最佳预测。来自前六组的最佳预测标记为金十字。

在所有提交的模型中，最佳模型（Costanzi）的配体RMSD为2.8ºRMSD，75个正确触点中有34个(图6A和表一). 配体以天然的结合姿势建模，具有延伸的构象和几乎垂直于膜平面的方向。该模型准确预测了一些关键的受体-受体相互作用：它捕获了N253之间的氢键相互作用^6.55配体的侧链和外环氨基（N15原子），以及F168之间的芳香堆积相互作用^5.29侧链和配体的双环三唑三嗪核心。与晶体结构相比，模型中的配体位于结合囊中更深的位置，使呋喃环更接近TM螺旋III和V。配体位置的不准确很可能是由于两个关键配体结合残基（F168）的侧链位置错误造成的^5.29和E169^5.30)ECL2（细胞外环2）和M177的侧链取向^5.38在TM螺旋V的胞外末端：F168的芳香环^5.29与自行车环相互作用的位置太深；相邻E169^5.30与酚类取代基中的羟基而不是双环附近的外环N15原子形成氢键相互作用；M177侧链^5.38不朝向结合腔定向。此外，该家族保守的二硫键C77^3.25–C166^5.27预测准确，但ECL3 C259中的二硫键^6.61–C262^6.64不是，可能是导致H264侧链方向不准确的原因^6.66，它没有指向绑定站点。

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图6

最佳模型与配体结合部位周围晶体结构的比较。（A） 配体和配体结合残基F168^5.29，E169^5.30，M177^5.38，L249^6.51，N253型^6.55，H264^6.66显示了最佳模型（Costanzi）和晶体结构。配体显示为模型的棒状物（洋红色碳原子）和晶体结构的半透明球体（绿色碳原子）；模型中的配体结合残基显示为黄色，晶体结构显示为蓝色。结合囊中配体的胞外（B）和侧视图（C），用于前六组的最佳预测（模型用洋红棒，晶体结构用绿色球体）。受体晶体结构呈灰色带状。二硫键如橙色条（D）所示。配体结合残基F168^5.29和N253^6.55显示为前六组最佳预测的标杆（黄色代表模型，蓝色代表晶体结构）。在（B）、（C）和（D）中，模型标记为a–Constanzi；b-Katritch；c-Lam；d-戴维斯；e-Maigret；f–尤尔科夫斯基。

前六组（Costanzi、Katritch/Abagyan、Lam/Abagyan、Davis/Barth/Baker、Maigret、Jurkowski/Elofsson）的最佳预测突出了准确预测配体结合位姿和受体-配体相互作用的成功与困难(图6B、C、D和表一). 扩展配体构象在所有六个模型中都得到了准确预测，并且在六个模型的四个模型中捕捉到了几乎垂直的方向。N253之间的氢键相互作用^6.55配体的侧链和外环N15原子被正确地建模为四个模型；然而，在四种配体中的一种中，配体与ECL2中的残基没有相互作用。F168之间的芳香族堆积相互作用^5.29配体的侧链和双环被正确地建模为四个模型；然而，在所有四种模型中，配体在结合囊中的位置太深，M177^5.38侧链不朝向结合腔。有一个模型没有准确捕捉到与N253的氢键相互作用^6.55或与F168的芳香堆积相互作用^5.29，而六个模型中有五个准确预测了家族保守的二硫键C77^3.25–C166^5.27六个模型都没有捕捉到E169之间的氢键相互作用^5.30ECL2和配体的外环N15原子。

排名靠前的其他模型（卡诺、戈达德、博洛加、奥尔森）的准确度稍低，但在准确预测配体结合模式的能力方面显示出与前六个模型相似的趋势(表一). 在四个模型中的三个模型中，配体被模拟成天然的延伸构象。N253之间的氢键相互作用^6.55配体的侧链和外环N15原子在四个模型中的三个模型中得到了精确的建模；然而，F168之间的芳香堆积相互作用^5.29配体的侧链和双环仅在四个模型中的一个模型中得到了精确的建模。家族保守二硫键C77^3.25–C166^5.27在两个模型中捕获。值得注意的是，其中一个型号（戈达德）准确地放置了E169^5.30侧链靠近配体的外环N15原子，几乎捕获氢键相互作用，即使ECL2的整体构象不准确。

在晶体结构发布之前提交模型时，预测者通常不会将最佳预测列为最佳模型(表一). 六个最佳模型中只有两个排名第一，六个组中有三个显示出模型排名与模型质量之间的弱相关性，通过结合z评分评估配体结合位点周围的准确性。此外，六个小组提交的其他模型的质量通常低于最佳预测(表一). 在六个最佳模型中，只有一个模型的z分数在组平均z分数的一个标准偏差内。

GPCR结构建模与对接现状

对所提交模型的评估表明，最佳参与方法能够预测紧密的天然类配体结合，但在捕获所有关键受体-配体相互作用和通过排名正确估计模型质量方面存在局限性。大多数提交的模型还远未达到天然的配体结合姿势。本评估中强调的GPCR结构预测最具挑战性的方面似乎是准确建模配体与细胞外环区残基的相互作用。鉴于已知GPCR结构中的环缺乏结构同源性，这一结果并不令人惊讶²⁴以及建模循环的一般困难任务^25,26.

最成功的预测方法依赖于基于β肾上腺素能受体模板结构的同源建模方法，在某些情况下，还依赖于视紫红质的额外模板结构（PDB ID:2RH1（β₂AR），2VT4（β₁AR）、1U19（牛Rhod）、2Z73（鱿鱼Rhod²⁷，信息与控制模块²⁸，金色²⁹和AutoDock³⁰（请参见补充信息预测方法的描述）。人类A的排列_2安培考虑到TM螺旋中的家族保守基序和残基，模板结构的序列似乎很简单³¹ECL2模型由从头开始的许多顶级预测（Katritch/Abagyan、Lam/Abagyan、Davis/Barth/Baker、Jurkowski/Elofsson、Goddard）中的方法，但在最佳预测（Costanzi）中仅部分模拟了位于TM螺旋V N末端的八个残基的短片段，包括形成C166的二硫键^5.27一些用于选择和排序最终受体与复合物模型的标准是：对接分数、复合物的构象能量、与突变和构效关系数据的一致性，以及通过虚拟配体筛选或模拟腺苷受体的其他亚型研究的结合选择性。

同源建模方法的可靠性取决于合适模板的可用性³²当前评估结果表明，β-肾上腺素能受体的结构单独或与视紫红质一起是预测腺苷A一般结构的合适跨膜模板_2安培受体。然而，考虑到A类GPCR中预期的结构多样性，目前尚不清楚目前的一套技术是否适用于A类GPCR的结构预测_2安培–ZM241385复合物将使其他GPCR的预测具有类似的准确性，特别是对于那些属于在系统发育上远离胺和视蛋白受体簇的亚家族的GPCR³³我们认为GPCR结构的数据库需要进一步扩展，以便为那些其他受体的精确建模提供合适的模板。

同源模型中的不精确性可能由侧链封装错误、对齐区域中的主链移位、未对齐循环区域中的错误、不对齐和模板错误引起³⁴这些错误与模板结构的“增值”问题有关，这在最近的CASP实验中得到了解决³⁵，似乎也适用于GPCR建模。事实上，在所有六个最佳预测中（E169之间的氢键相互作用^5.30在ECL2中，配体的外环N15原子未被捕获，H264的侧链^6.66在ECL3和M177中^5.38在A独有的扩展凸起结构中_2安培在TM螺旋V的细胞外端，V不朝向结合位点。F168之间的芳香族堆积相互作用是一个例外^5.29ECL2和配体的双环，这在一些预测中是正确的。168财年^5.29位于环中，但在结构上与F193同源^5.32与β中配体咔唑醇的咔唑杂环相互作用₂AR结构，因此这种相互作用的建模可能受到同源性的指导。有趣的是，F168^5.29建模比E169更准确^5.30尽管突变数据显示E169突变^5.30丙氨酸降低了拮抗剂和激动剂的亲和力³⁶，F168无可用数据^5.29配体结合位姿的取向不准确，例如酚取代基与TM螺旋II和III的平行取向，部分原因可能是TM螺旋I、II和III中螺旋位移的建模不准确。螺旋移动改变装订袋的位置，并重新定义袋的大小和形状¹⁹; 因此，预计准确建模螺旋位移将有助于更好地预测配体结合位姿。通过有效使用视紫红质和β肾上腺素能受体（Pogozheva/Lomize）的多模板结构，可以最准确地模拟螺旋位移，或ROSETTA程序使用物理真实模型实现的全原子精炼方法，该模型再现了膜环境中的蛋白质原子间和蛋白质-固体相互作用³⁷（戴维斯/巴思/贝克）。

其他错误来源包括没有对结构上重要或直接参与配体结合相互作用的水分子建模^三A中的配体结合腔_2安培–ZM241385结构有四个有序水分子¹⁹然而，提交的预测中没有一个包含水分子。我们尝试使用ICM将配体重新锁定到晶体结构²⁸并发现，在没有任何水分子的情况下，可以恢复天然的类结合位（对于双环和配体的呋喃基取代基，在1º重原子RMSD内，以及<3.0º整体配体RMSD），这表明水可能不是准确预测配体相互作用的关键。然而，将水分子和配体建模通常有助于更好地预测配体结合姿势或亲和力。使用参与方法使用的对接协议进行的额外再锁定研究将有助于评估水分子的影响，以及对接方法与受体建模方法的准确性。

最后，有趣的是，最好的模型来自Costanzi小组，他们之前从事腺苷受体建模和对接工作。他们关于腺苷受体的结构域知识可能有助于解释突变和配体相互作用数据，而且这种结构域知识几乎可以肯定是至关重要的。

结论

尽管在过去一年中实验解决的GPCR结构数量有所增加，但准确预测GPCR结构和配体相互作用显然仍然是一个挑战。对这些预测的评估突出了CASP对基于模板的建模目标的预测所解决的类似问题，即回路建模的困难、对最佳可用模板的改进和改进以及模型排名。对结构上不同的区域进行准确建模，例如细胞外环、影响螺旋残基注册的二硫键形成以及TM区域的螺旋移动，对于准确预测GPCR中的关键配体相互作用似乎特别关键，而这个地区可能是最需要技术发展的地区。GPCR建模和对接的进展将需要对当前预测方法进行进一步改进，以“增加”最佳可用模板的价值，并生成更适用于基于结构药物设计应用的模型。

补充材料

致谢

GPCR评估参与者

亚瑟·奥尔森（斯克里普斯研究所分子生物学系）

Wiktor Jurkowski和Arne Elofsson（斯德哥尔摩大学生物化学与生物物理系生物膜研究中心）

Slawomir Filipek（国际分子和细胞生物学研究所生物模型实验室）

Irina Pogozheva和Andrei Lomize（密歇根大学肽合成和分子识别实验室）

Bernard Maigret（南希大学LORIA Orpailleur团队）

投手霍斯特¹，安布里什·罗伊²布雷迪·伯纳德¹，Shyamala Iyer¹、杨章²和Ram Samudrala¹(¹华盛顿大学计算生物学小组；²堪萨斯大学生物信息中心分子生物科学系

奥斯曼·乌古尔·塞泽曼（萨巴尼奇大学）

格雷戈里·尼基福罗维奇¹和克里斯蒂娜·泰勒²(¹MolLife Design LLC；²华盛顿大学生物化学和分子生物物理学系）

Stefano Costanzi（美国国立卫生研究院糖尿病、消化和肾脏疾病研究所生物建模实验室）

Y.沃罗布耶夫²，N.Bakulina²和V.Solovyev¹,²(¹伦敦大学皇家霍洛韦分校计算机科学系；²Softberry公司）

加努和彦¹，高谷大辅¹,²，Genki Terashi¹、武田真彦（Mayuko Takeda-Shitaka）¹,²和仙山秀美¹,²(¹北大药学院；²RIKEN系统和结构生物学中心）

William A.Goddard III、Youyong Li、Soo-Kyung Kim、Bartosz Trzaskowski、Ravinder Abrol和Adam Griffith（加州理工学院材料与过程模拟中心）

Vsevolod Katritch、Manuel Rueda和Ruben Abagyan（Molsoft LLC）

Ian Davis、Patrick Barth、David Baker（华盛顿大学生物化学系）

Michael Feig（密歇根州立大学生物化学与分子生物学系）

Michal Brylinski、Hongyi Zhou、Seung Yup Lee和Jeffrey Skolnick（佐治亚理工学院系统生物学研究中心）

Liliana Ostopovic-Halip和Cristian Bologa（新墨西哥大学生物计算系）

Polo Lam和Ruben Abagyan（斯克里普斯研究所分子生物学系）

Eric S.Dawson、Kristian Kaufmann、Nils Woetzel和Jens Meiler（范德比尔特大学结构生物学中心）

Feng Ding、Adrian Serohijos、Shuangye Yin和Nikolay V.Dokholyan（北卡罗来纳大学教堂山分校生物化学和生物物理系）

大卫·罗德里格斯（David Rodriguez）和雨果·古铁雷斯（Hugo Gutiérrez de-Terán）

Henri Xhaard（赫尔辛基大学药学院药物研究中心）

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