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病毒学。作者手稿；PMC 2010年8月15日发布。
以最终编辑形式发布为：
病毒学。2009年8月15日；391(1): 57–63.
2009年6月23日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.virol.2009.05.036
预防性维修识别码：PMC2728214型
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院126681
PMID：19552933

HPV16 E7癌基因在正常人上皮细胞中的表达导致分子变化，表明上皮细胞向间充质细胞转化

卡琳·海勒,1 杰西卡·马尔,2 弗兰克·方,1 约翰·奎肯布什,2,三和卡尔·穆格尔1,*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

癌相关上皮间质转化（EMT）对肿瘤的侵袭和转移至关重要。EMT的分子标志包括上皮粘附蛋白E-钙粘蛋白的下调、N-钙粘蛋白和间充质中间丝蛋白波形蛋白和纤维连接蛋白的去新生表达。正常人上皮细胞中HPV16 E7的表达导致波形蛋白和纤维连接蛋白水平升高，而上皮粘附蛋白E-cadherin的表达水平降低。在表达HPV16 E6和E7的细胞或整个HPV16早期转录单位中也检测到类似的波形蛋白、纤维连接蛋白和E-cadherin表达模式。HPV16 E6和E7均能诱导N-钙粘蛋白表达。有趣的是，EMT相关蛋白表达水平的这些变化在mRNA表达水平上没有类似的反映，这表明HPV16癌蛋白也可能通过非转录机制调节EMT。因此，HPV16癌蛋白可能通过EMT诱导导致恶性进展。

介绍

人乳头瘤病毒（HPV）是一种小型DNA病毒，可感染基底上皮细胞并引起过度增殖性病变。在所描述的约140种HPV基因型中，约有40种与粘膜上皮感染有关，并根据其引起的病变的相对恶性潜能进一步分为高风险组和低风险组。尽管低风险HPV，如HPV6和11，会导致良性生殖器疣，但高风险HPV（如HPV16和HPV18）会导致癌前鳞状上皮内瘤变，并可能发展为宫颈癌（综述于祖尔·豪森，2002年). 将高危HPV基因组整合到宿主细胞染色体中是恶性进展的一个常见标志，并导致E6和E7癌蛋白的持续、放松调控表达，这对于诱导和维持转化表型是必要的和足够的（在Munger等人，2004年). 高危型HPV E6和E7癌蛋白既没有酶活性也没有特异性DNA结合活性，其功能是干扰宿主细胞调节网络。高风险HPV E7蛋白结合并诱导视网膜母细胞瘤抑癌蛋白（pRB）的低磷酸化、生长抑制形式的降解(Boyer等人，1996年;Dyson等人，1992年;Dyson等人，1989年;Jones等人，1997年)导致E2F转录因子持续激活。这会导致异常的S相进入。此外，HPV E7癌蛋白可以失调细胞凋亡，消除细胞周期阻滞，以应对DNA损伤、分化或细胞静止性细胞因子，并通过诱导中心体复制错误和其他机制导致基因组不稳定（综述于McLaughlin-Drubin等人，2009年). 高危HPV E6蛋白与E6相关蛋白（E6AP）复合物靶向p53肿瘤抑制蛋白降解(Scheffner等人，1990年). 此外，E6的p53依赖性活性如端粒酶激活(Klingelhutz等人，1996年)，与PDZ蛋白相关(Kiyono等人，1997年;Lee等人，1997年)和其他细胞靶蛋白（综述于Howie等人，2009年)也有助于高危HPV E6蛋白的致癌活性。

上皮细胞是HPV感染的靶点，通过特殊的膜结构连接，如粘附分子连接、紧密连接和桥粒，其特征是粘附分子的局部分布，包括钙粘蛋白、连环蛋白和整合素。因此，上皮细胞通过与邻近细胞保持密切接触而形成横向分层带。相反，间充质细胞是纺锤形的、不依赖尾蚴的活动细胞，既不形成紧密连接也不形成极化结构。上皮细胞可以通过一个称为上皮-间充质转化（EMT）的多步骤过程转化为间充质细胞。接受EMT的细胞失去了典型的上皮特性，获得了间充质特性。这个过程是可逆的，MET表示间充质细胞重新获得上皮特性的过程。EMT对几个生理和病理过程都有重要作用，包括胚胎发生、炎症和癌症进展。由于EMT是基底膜降解不可或缺的一部分，因此这一过程还涉及细胞注入血管或淋巴管以形成微转移。因此，有人假设EMT对于肿瘤去分化是必要的，这一步骤通常与高侵袭潜能和化疗耐药性有关（在Thiery等人，2006年).

EMT的发病以及随后发生的变化谱是由信号通路之间的广泛串扰触发的，有两个共同的终点：（1）E-cadherin的下调(Hirohashi等人，2003年)（2）EMT相关基因的表达。E-钙粘蛋白是一种钙依赖性的完整膜糖蛋白，通过内涂层蛋白如连环蛋白连接到肌动蛋白丝。E-cadherin可以通过介导侵袭抑制特性和维持上皮表型发挥抑癌作用。虽然在高分化癌中检测到E-钙粘蛋白的表达，但在许多未分化肿瘤中表达减少(Hirohashi等人，2003年). EMT的一个特征是从E-钙粘蛋白表达到N-钙粘蛋白的“钙粘蛋白转换”。N-钙粘素是一种前迁移蛋白，仅表达于神经组织以及成纤维细胞、成骨细胞、内皮细胞、视网膜细胞和间皮细胞。它通常不在上皮细胞中表达，但在某些癌中检测到(Derycke等人，2004年)它被认为可以促进血管生成和粘附（在Jeanes等人，2008年). EMT的另一个特征是中间丝蛋白如波形蛋白和纤维连接蛋白的表达增加。波形蛋白参与细胞质中细胞器的锚定，通常在生长因子刺激的上皮细胞中表达。在癌症中，波形蛋白的表达与去分化、恶性表型、运动能力增强、侵袭能力和不良临床预后有关（综述于Kokkinos等人，2007年). 纤维结合蛋白是细胞外基质的关键成分，是细胞表面受体的结合平台；癌细胞与纤维连接蛋白的粘附增强其致瘤性和抗凋亡性(Han等人，2006年).

先前的研究表明，高危HPV癌蛋白可能与EMT有关。例如，HPV16 E6/E7永生化人牙龈角朊细胞在乙醇治疗后显示成纤维细胞样表型(Chamulitrat等人，2003年). 在SV40永生化人角质形成细胞中，HPV18 E6表达与成纤维细胞形态相关(Watson等人，2003年). 此外，基因芯片分析表明，HPV16 E6对参与角质形成细胞分化和EMT的大量基因进行了调节(Duffy等人，2003年). 在此，我们报告了HPV16 E6和E7癌蛋白各自可以独立地促进EMT相关分子变化的诱导。由于大多数这些观察到的变化在mRNA水平上没有观察到，非转录机制可能也会导致HPV16 E6和/或E7诱导的EMT。

材料和方法

质粒

使用以下人类β-肌动蛋白表达质粒：p1435（HPV16 E7）、p1436（HPV16 E6）、p1321（HPV16 E6/E7）、p1319（HPV16早期区）和亲本载体p1318(Munger等人，1989年).

细胞系和培养

从匿名新生儿包皮环切中分离出原代人包皮角质形成细胞（HFK）。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗每个培养物中的两到五个人的包皮，然后切成小块。在4°C下，在25mg dispase/ml PBS中孵育过夜后，表皮与真皮分离，切碎并胰酶化为单细胞悬浮液。HKF保存在补充有人重组表皮生长因子1-53、牛垂体提取物、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10μg/ml庆大霉素和0.5μg/ml两性霉素B的无血清角质形成细胞培养基（KSF-M；Invitrogen）中，HFKs稳定表达HPV16 E6、E7、E6和E7或早期区域（ER）根据制造商的说明，通过使用Amaxa人类角质形成细胞核因子试剂盒（Amaxa Biosystems），以5:1的比例转染具有适当表达质粒和pCDNA3.1（Invitrogen）的HFK原代群体，从而创建。用G418筛选后，将细胞培养在KSF-M中。正常口腔角质形成细胞（NOK）通过人类端粒酶（hTERT）和NOK hTERT/E7永生化(Piboonniyom等人，2003年)保持在KSF-M中。

初级人类包皮成纤维细胞（HFFs）由匿名新生儿包皮环切术产生。将角质形成细胞制备过程中从表皮分离的真皮切碎，并在37°C下，在无血清DMEM和胰蛋白酶（4:1）中的2mg/ml胶原酶溶液中孵育4小时。HFF保存在补充有10%小牛血清、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素的DMEM中。

从ATCC中获得HPV16阳性的CaSki人宫颈癌，并在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，Invitrogen）、10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素中培养。

免疫印迹法

在RIPA缓冲液（150 mM NaCl，1%Nonide P-40，0.5%脱氧胆酸盐，0.1%十二烷基硫酸钠（SDS），50mM Tris-HCl pH 8.0）中提取细胞，每25 ml裂解缓冲液中补充一片完整的无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（Roche）。将细胞刮在冰上，并通过在4°C下以16000×g离心15分钟来清除裂解物。使用Bradford方法（Bio-Rad）测量蛋白质浓度。含有50至200μg蛋白质的样品在含有SDS的样品缓冲液中煮沸，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜（Millipore）上。将膜在5%脱脂奶粉和1%BSA的TNET缓冲液（50 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，5 mM EDTA，0.1%吐温-20）或TBST缓冲液（10 mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.1%Tween-20）中封闭1小时，并用适当的抗体进行探测。主要抗体按以下稀释液使用：8C9（1:150；Zymed/Invitrogen）和ED17（1:200；Santa Cruz）的混合物，用于检测HPV16 E7、纤维连接蛋白（sc-59826，1:50；Santa Cruz）、波形蛋白（V9，1:1000；Chemicon）、N-钙粘蛋白（610920，1:2500；BD）、E-cadherin（610181，1:250；BD，β-肌动蛋白（CP01，1:1000；钙生物化学）和α-微管蛋白（T6199，1:1000，Sigma）。使用适当的次级抗鼠辣根过氧化物酶结合抗体（1:10000；Amersham）。蛋白质通过增强化学发光（Western Lightning Chemillumination Reactor Plus，Perkin-Elmer Life Science，Inc.）进行可视化，并暴露在BioMax XAR胶片（柯达）上或通过4000R图像工作站（科达）进行电子采集。使用柯达成像软件4.0版进行波段定量分析。

免疫荧光

细胞被镀在玻璃盖玻片上，用3%多聚甲醛在磷酸盐缓冲液（PBS）中固定，用PBS洗涤，并用1%Triton X-100在PBS中在室温下渗透10分钟。渗透后，用含有0.02%皂苷、0.05%叠氮化钠和1%牛血清白蛋白（BSA）的洗涤缓冲液（PBS）清洗细胞，在室温下用10%正常山羊血清（Jackson Immunoresearch）封闭1小时，并在37°C下用N-钙粘蛋白抗体（610920，BD）孵育45分钟。封闭溶液和抗体在洗涤缓冲液中稀释。二级抗体是Alexa Fluor 488结合的山羊抗鼠抗体（1:1000；Invitrogen）。Nuclei用Hoechst 33258（Sigma）和TO-PRO-3（Invitrogen）染料以1:2000的稀释度复染。使用1:100稀释的罗丹明结合的卵磷脂（分子探针/Invitrogen）进行卵磷脂染色，然后使用Hoechst和TO-PRO-3进行复染。

siRNA实验

HFF在盖玻片上生长24小时，直到它们大约40%融合，然后用N-钙粘蛋白特异性siRNA寡核苷酸（“SMARTpool”，Millipore）或使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）的干扰对照siRNA（Millipoer）进行转染。培养48小时后，按上述方法固定并染色细胞。

微阵列分析

根据制造商的方案，使用安捷伦RNA分离试剂盒从四个独立的、传代的和供体匹配的、稳定表达HPV16 E6或E7的HFK人群中分离信使RNA，并用对照载体转染原代HFK。根据制造商的说明，使用安捷伦生物分析仪2100评估RNA质量，并使用Affymetrix U133Plus2.0 GeneChip™分析基因表达谱。使用RMA对数据进行标准化，并使用NUSE和RLE得分评估阵列质量(Irizarry等人，2003年); 进行了各种统计和数据挖掘分析，以确定与各种表型相关的基因和基因表达模式。计算HPV16 E6与载体控制细胞中基因表达的对数2比率，以及HPV16 E7表达与空载体控制细胞的对数2比值，并以平均值为中心，使用欧氏距离度量进行平均连锁层次聚类(Eisen等人，1998年;Michaels等人，1998年;Wen等人，1998年)在gplots包中使用heatmap2函数(http://cran.r-project.org/web/packages/gplots/index.html)在开源统计计算语言R中实现(http://www.r-project.org/). 根据MIAME标准收集所有基因表达数据(Brazma等人，2001年)并以登录号（YYY）存放在ArrayExpress数据库中。

实时PCR

按照制造商的说明，使用QuantiTect SYBRGreen PCR试剂盒（Qiagen）进行实时定量PCR。样品在7300快速RT-PCR系统（Applied BioSystems）和匹配的阴性对照品上进行分析，一式三份。引物为：SNAI1正向ATG AGG AAT CTG GCT GT和反向CAG GAG AAA ATG CCT TTG GA；TWIST1正向TGC ATG CAT TCT CAA GAG GT和反向CTA TGG TTT TGC AGG CCA GT；FN1正向GGA GTT GAT TAT ACC ATC ACT G和反向TTT CTG TTT GAT GAC CT；CDH2正向TGG GAA TCC GAC GAA TGG和反向TGC AGA TCG GAC CGG ATA CT；CDH1正向TGA AGG TGA CAG AGC CTC TGG AT和反向TGG GTG AAT TCG GGC TTG TTG；GAP-DH正向GAT TCC ACC CAT GGC AAA TCC和反向TGG GAT TTC CAT TGA TGA CAA G。

结果

HPV16 E6和E7调节人包皮角质形成细胞EMT和分化相关过程相关基因的表达

而HPV16 E6在上皮细胞中的表达此前已被证明上调了间充质细胞系中正常表达的几个基因(Duffy等人，2003年)HPV16 E7在调节EMT相关基因表达中的作用尚未得到广泛研究。为了更详细地解决这个问题，我们分析了从稳定表达HPV16 E6或E7的HFK人群中获得的mRNA微阵列表达数据，并与供体和传代匹配的载体控制细胞进行了比较。我们选择了26个代表上皮和间充质蛋白的基因，以及参与EMT相关过程或分化的调节因子。与对照HFK相比，HPV16 E6和HPV16 E7表达HFK的基因表现出相似的表达变化模式，并使用层次聚类算法进行识别和分组。该分析表明E6或E7表达细胞中这些基因的表达水平只有细微变化(图1A). 这令人惊讶，我们通过定量逆转录PCR验证了这些基因的小亚群的表达(图1B). 总的来说，这些分析表明，虽然HPV16 E6和E7的表达均诱导EMT相关基因的基因表达水平发生细微变化，但E6或E7的表示并不会导致经典间充质蛋白（如波形蛋白、纤维连接蛋白、成纤维细胞表面蛋白-1（FSP-1、S100A4））的mRNA水平发生显著变化和平滑肌肌动蛋白。在某些mRNA水平发生变化的情况下，HPV16 E6和E7的表达似乎具有相反的作用；TGF-β受体II mRNA的表达受HPV16 E7上调，受HPV16E6下调，而TGF-α受体III mRNA受HPV16-E7下调，受HPV6E6上调。基于这些发现，我们想确定一些EMT相关基因的表达在蛋白表达水平上是如何调节的，以及HPV16 E6和E7何时共同表达。

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EMT相关基因在HPV16 E6和HPV16 E7表达细胞中的差异表达。答：。利用从两个不同传代和供体匹配群体中分离的mRNA进行基因芯片阵列分析。在HPV16 E6表达与对照（E6）和HPV16 E7与对照（E7）人群中表达的26个EMT和角质形成细胞分化特异性基因的平均标准log2表达比率的热图表示。基于欧氏距离的聚集层次聚类用于识别HPV16 E6和E7表达细胞中具有相似表达模式的基因。基因由官方基因符号指定：CTNNA2，α-连环蛋白；CTNNBL1，β-catenin；CDH2，N-钙粘蛋白；FN1，纤维连接蛋白；VIM，波形蛋白；ACTA2，平滑肌肌动蛋白；S100A4、S100钙结合蛋白/成纤维细胞表面蛋白-1；AGC1，聚集蛋白1；成纤维细胞生长因子受体2；SNAI1，蜗牛同源物1；TWSG1，扭曲原肠胚形成同源物1；ITGAV，卵黄凝集素；DSP，结蛋白；OCLN，闭塞；CLDN14，第14条；CDH1、E-钙粘蛋白；EPPK1，epilakin；KRT，角蛋白；TGFBR，转化生长因子β受体。B。EMT标记蛋白子集的定量逆转录PCR分析。条形图中的列表示波形蛋白（VIM）、E-cad（CDH1）、N-cad（CDH2）、纤维连接蛋白（FN）、扭曲（TWSG1）和蜗牛（SNAI1）相对于对照载体转染细胞的基因表达的折叠变化。

HPV16 E7是正常人上皮细胞中EMT相关蛋白的调节剂

EMT通常表现为上皮细胞获得纤维母细胞表型的形态学改变。为了能够直接将这些变化与我们的mRNA分析进行比较，我们通过Western blot分析，分析了一组传代和供体匹配的HFK人群中E-cadherin水平，这些HFK人群稳定表达HPV16 E6和/或E7。对照载体转染的HFK作为对照。与我们观察到的NOK相似，E-cadherin在HFK中表达，HPV16 E6或HPV16 E7的表达均导致E-cadherin表达减少，而在HPV16 E 6/E7表达的HFK中，E-cadtherin的表达更显著地减少(图2A). 鉴于表达HFK的HPV16 E7的mRNA水平发生了更为微妙的变化，这些影响的程度令人惊讶。

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表达人角质形成细胞的HPV癌基因中EMT相关蛋白的表达。答：。Western blot分析HPV16 E6和/或E7表达的原代人角质形成细胞（HFK）与匹配的对照HFK中E-cadherin（E-Cad）的表达。以原代人包皮成纤维细胞（HFF）为对照。微管蛋白印迹显示为负载控制。下面显示了归一化为微管蛋白表达的E-cadherin水平的量化B。与匹配的对照HFK相比，对HPV16 E6和/或E7和表达原代人角质形成细胞（HFK）的早期区域（ER）中纤维连接蛋白（FN）、波形蛋白（Vim）和N-钙粘蛋白（N-Cad）的表达进行Western blot分析。以原代人包皮成纤维细胞（HFF）、HPV16阳性CaSki宫颈癌细胞和表达HPV16 E7的U2OS人骨肉瘤细胞（U2OS/E7）为对照。E7印迹记录HPV16 E7在适当细胞群中的表达；p53的表达（被E6破坏而被E7稳定）是HPV16癌基因表达的替代标记。β-肌动蛋白印迹显示为负载对照。C、。Western blot分析hTert永生化正常人口腔上皮细胞（NOK）和HPV16 E7表达的匹配人群（NOK-E7）中纤维连接蛋白（FN）和E-cadherin（E-Cad）的表达。以原代人包皮成纤维细胞（HFF）为对照。E7印迹记录了NOK-E7中HPV16 E7的表达，β-actin的表达显示为负载控制。

基于这些结果，我们还比较了表达HFK的HPV16癌蛋白中间充质标志蛋白纤维连接蛋白和波形蛋白以及N-钙粘蛋白的表达。正如预期的那样，这些蛋白在转染对照载体的HFK中的表达非常低，但在HFF中却得到了稳定表达。HPV16 E6表达细胞仅显示纤维连接蛋白和波形蛋白表达轻微增加，但这些蛋白的表达在HPV16 E7表达细胞中显著增加。尽管表达HPV16 E6/E7的HFK或转染HPV16整个早期区域的HFK的水平稍低，但仍高于仅表达HPV16E6的对照HFK或HFK。在任何HFK人群中，N-cadherin的表达水平均不稳定，且易于检测(图2B). 值得注意的是，EMT蛋白表达的这些变化并没有伴随相应mRNA丰度的类似变化(图1). 此外，这些细胞中HPV16 E7的表达远低于HPV16阳性CaSki宫颈癌细胞系，因此观察到的效果不是HPV癌蛋白高表达的结果。值得注意的是，CaSki细胞表达可检测到的纤维连接蛋白、波形蛋白和N-钙粘蛋白，这表明它们显示了一些EMT的证据。

为了验证HPV16 E7表达对EMT相关蛋白水平改变的影响，我们分析了一组hTERT永生正常口腔角朊细胞（NOK）和稳定表达HPV16 E7（NOKE7）的NOK中纤维连接蛋白和E-钙粘蛋白的表达(Piboonniyom等人，2003年). 以原代人包皮成纤维细胞（HFFs）为对照。正如预期的那样，NOKs含有高水平的E-钙粘蛋白和几乎不可检测的纤连蛋白，而HFFs不表达可检测的E-钙粘蛋白，但具有高水平的纤连蛋白。NOK-E7细胞中E-cadherin水平显著降低，纤维连接蛋白水平升高(图2C).

HPV16癌基因E6和E7诱导原代上皮细胞中N-cadherin的去新生表达

由于N-cadherin在HFK细胞群中的表达水平低于Western blotting清晰检测极限（数据未显示），我们对这些细胞群进行了免疫荧光实验。正如预期的那样，N-钙粘蛋白在HFK中检测到的水平极低，但在HFF中表达的水平很高。表达HPV16 E6和HPV16 E7的角质形成细胞也显示出N-cadherin水平增加的证据，这也在表达HPV16E6和E7的HFK或整个早期区域中观察到(图3; 上部面板）。为了确定我们在这些免疫荧光实验中观察到的信号反映了N-钙粘蛋白的表达，我们转染了HFF，HFF表达高水平的N-钙粘素，并以N-钙粘质特异性siRNA寡核苷酸池或加扰对照siRNA作为对照。N-钙粘蛋白缺失导致免疫荧光信号显著减少，这与我们用这种抗体检测N-钙粘素表达的概念一致。我们还用指骨肽对这些细胞进行染色，并检测到丝状肌动蛋白的增加，这与HPV16癌蛋白表达细胞中N-cadherin表达的增加平行(图3; 下部面板）

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人原代角质形成细胞（HFKs）中HPV16 E6和/或E7和早期区域（ER）的N-钙粘蛋白和丝状肌动蛋白表达。通过免疫荧光显微镜评估传代组和供体匹配的人包皮角质形成细胞（HFK）群体中N-Cad的表达（上面板），这些人群表达HPV16 E6和/或E7癌蛋白或HPV16整个早期转录单位（ER），或转染空载体（C）。通过用N-钙粘蛋白siRNA（N-Cad-si）或干扰对照siRNA（Ctrl-si）转染原代人包皮成纤维细胞（HFFs），然后在siRNA转染后48小时进行免疫荧光分析，评估抗体的特异性。用罗丹明结合的卵磷脂染色的细胞荧光显微镜观察到丝状肌动蛋白（下面板）。

讨论

EMT是在胚胎发生过程中建立细胞谱系一致性的转分化的基本过程。EMT相关过程也在致癌进展过程中触发。然而，与癌症相关的EMT通常不涉及完整的谱系转换，但赋予新兴肿瘤细胞迁移和侵袭特性（参见Thiery等人，2006年)也可能导致癌细胞表型(Mani等人，2008年). 因此，肿瘤相关EMT是获得侵袭性和转移性表型的关键，因此也是恶性进展的关键。然而，重要的是，肿瘤相关的EMT是可逆的，通过一个称为间充质-上皮转化（MET）的过程（在Thiery等人，2006年). 这可能解释了一些临床材料研究中的不一致，这些临床材料侧重于确定某些EMT标记物的肿瘤分级特异性表达。

子宫颈癌中检测到EMT(Hagemann等人，2007年)与EGF受体过度表达、转录因子蜗牛的表达和核定位增加有关(Lee等人，2008年). HPV癌蛋白可能直接参与EMT诱导(Duffy等人，2003年)SV40永生化角质形成细胞中HPV18 E6癌蛋白的表达导致形态转化为纤维母细胞形态(Watson等人，2003年). 在本研究中，我们没有检测到HPV16 E6和/或E7表达的原代人包皮角质形成细胞的显著形态学改变，并且不同细胞群中EMT和分化相关基因的mRNA水平只有细微差异（不到2倍）。许多EMT基因的mRNA水平，包括两种转录因子和EMT主调控因子twist和snail，几乎没有改变。这与之前的研究相反(Duffy等人，2003年)，这可能反映了两项研究中使用的不同培养条件。因此，我们惊讶地发现，蛋白质表达水平发生了更大的变化。HPV16 E7癌蛋白对这些变化的诱导起重要作用；HPV16 E7表达细胞E-cadherin水平显著降低，纤维连接蛋白和波形蛋白水平增加(图2).

以前，波形蛋白的表达与HPV33转化的角质形成细胞侵袭性的获得有关(Gilles等人，1994年;Gilles等人，1994年b). 在对临床标本的研究中，波形蛋白在浸润性宫颈癌中表达，但在高级别宫颈上皮内瘤变（CIN III）中未检测到(Gilles等人，1996年). 另一项研究显示，在分析的120份宫颈癌标本中，约60%的标本中有波形蛋白表达(Schaafsma等人，1993年). 在一些样本中，波形蛋白染色广泛且遍及肿瘤的大部分，而在其他样本中，染色仅限于肿瘤-基质界面处或附近的基底细胞和副基底细胞的小簇。这表明波形蛋白在肿瘤“侵袭前沿”的表达可能特别高。纤连蛋白染色在一些宫颈癌中也有记录，但染色是弥漫性的，并不局限于浸润前沿。此外，纤维连接蛋白染色与肿瘤分级无关(Goldberg等人，1998年). 据报道，HPV16 E7可抑制纤维连接蛋白启动子(Rey等人，2000年)，但我们观察到纤维连接蛋白mRNA表达略有增加(图1)并显著增加HPV16 E7表达细胞中的纤维连接蛋白水平(图2).

癌症相关的EMT通常涉及钙粘蛋白开关；虽然E-cadherin表达降低，但N-cadherin在较高水平上表达。许多肿瘤中都有E-cadherin表达缺失的报道。在包括宫颈癌在内的一些肿瘤类型中，E-钙粘蛋白可能通过DNA超甲基化而被转录沉默(Chen等人，2003年;Dong等人，2001年;Kang等人，2005年;Narayan等人，2003年;Shivapurkar等人，2007年;Terra等人，2007年;Yang等人，2006年). 虽然表达HFK的HPV癌蛋白中E-cadherin表达降低的机制尚不清楚，我们的结果与最近的一份报告一致，即HPV16转化的人角质形成细胞中siRNA对HPV16 E7的缺失通过一种可能独立于转录因子slug和snail的机制恢复了正常的E-cadherin表达(Caberg等人，2008年). 此外，MDCK细胞中HPV16 E7相关SV40大肿瘤抗原的表达可诱导EMT和E-cadherin及角蛋白表达的缺失(Martel等人，1997年). 此外，siRNA介导的pRB耗竭（该pRB被HPV16 E7降解）导致MCF7乳腺癌细胞中E-cadherin表达被解除，细胞间粘附减少，EMT相关形态学改变。最引人注目的是，在间质样浸润性癌乳腺癌标本中，pRB和E-cadherin的表达同时下调(Arima等人，2008年). 确定HPV16 E7降低E-钙粘蛋白表达的能力是否与使pRB不稳定的能力有关将是令人感兴趣的。

N-钙粘蛋白表达与肿瘤中细胞运动性和侵袭性增加有关(Derycke等人，2004年)上皮细胞中异位的N-钙粘蛋白表达导致形态改变和运动增强(Hazan等人，1997年;Islam等人，1996年). 在我们的实验中，HPV16癌基因表达细胞中的N-cadherin mRNA水平未发生变化，蛋白水平仍低于我们测试的多个HFK人群中通过Western blotting一致可靠检测的水平。然而，通过免疫荧光，我们一致观察到与对照细胞相比，HPV16 E6和/或E7表达的HFK中的N-钙粘蛋白水平增加(图3).

总之，我们的数据表明，HPV16 E7对上皮细胞中EMT相关过程的诱导起着重要作用。与这一观点一致，先前对转基因小鼠的研究表明，HPV16 E7的表达与低剂量雌激素的联合应用足以诱导浸润性宫颈癌(莱利等人，2003年)这可能涉及EMT。虽然HPV16 E6癌基因的共同表达导致了更大、更广泛的癌的形成，但表达HPV16 E6的小鼠仅出现癌前病变(Riley等人，2003年). 由于观察到的HPV16 E7蛋白中E-cadherin、纤维连接蛋白和波形蛋白表达的变化比我们的mRNA表达分析预测的要剧烈得多，我们假设HPV16 E7可能影响EMT，至少部分是通过非转录机制。事实上，HPV16 E7可以稳定p53肿瘤抑制因子和cdk抑制剂p21CIP1级(Jones等人，1997年;Jones等人，1999年)并以肿瘤抑制蛋白pRB和相关的p107和p130蛋白为降解靶点(Boyer等人，1996年;Gonzalez等人，2001年;Jones等人，1997年;Zhang等人，2006年). 因此，可以想象E7可能会直接改变这些EMT相关蛋白的稳定性，或通过（去）稳定调节其表达的因子间接调节蛋白水平。

致谢

我们感谢Amy Baldwin在生成表达HPV16癌基因的角质形成细胞培养物方面提供的建议，Kristina M.Holton和Renee Rubio在生成微阵列数据方面提供的帮助，Adrian Marino Enriquez提供的技术建议，Margaret E.McLaughlin Drubin对本手稿提供的有益建议。我们还感谢两位匿名审稿人对该手稿早期版本的建设性批评。KM和KH感谢Kay Feenby-Skcubrats在整个研究过程中提供的宝贵支持。由PHS拨款HG004233（JQ，KM）、CA081135（KM）和CA06698（KM。KH得到了德国联邦科学院（DFG HE5494/1-1）博士后奖学金的支持。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们提供这份手稿的早期版本。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

工具书类

  • Arima Y、Inoue Y、Shibata T、Hayashi H、Nagano O、Saya H、Taya Y。Rb耗竭导致E-cadherin的放松调节和细胞表型的诱导，这是上皮-间充质转化的特征。癌症研究。2008;68(13):5104–12.[公共医学][谷歌学者]
  • Boyer SN，Wazer DE，Band V.人乳头状瘤病毒-16的E7蛋白通过泛素蛋白酶体途径诱导视网膜母细胞瘤蛋白降解。癌症研究。1996;56(20):4620–4.[公共医学][谷歌学者]
  • Brazma A、Hingamp P、Quackenbush J、Sherlock G、Spellman P、Stoeckert C、Aach J、Ansorge W、Ball CA、Causton HC、Gaasterland T、Glenisson P、Holstege FC、Kim IF、Markowitz V、Matese JC、Parkinson H、Robinson A、Sarkans U、Schulze-Kremer S、Stewart J、Taylor R、Vilo J、Vingron M。微阵列实验的最小信息（MIAME）-朝向微阵列数据的标准。自然遗传学。2001;29(4):365–71.[公共医学][谷歌学者]
  • Caberg JH、Hubert PM、Begon DY、Herfs MF、Roncarati PJ、Boniver JJ、Delvenne PO。沉默E7癌基因可恢复人乳头瘤病毒16型转化的角质形成细胞中功能性E-cadherin的表达。致癌。2008;29(7):1441–7.[公共医学][谷歌学者]
  • Chamulirat W、Schmidt R、Chunglok W、Kohl A、Tomakidi P。慢性乙醇治疗后，源自HPV16 E6/E7的上皮和成纤维细胞样表型使人牙龈角质形成细胞永生化。欧洲细胞生物学杂志。2003;82(6):313–22.[公共医学][谷歌学者]
  • Chen CL，Liu SS，Ip SM，Wong LC，Ng TY，Ngan HY。宫颈癌细胞系和肿瘤中的DNA甲基化使E-cadherin表达沉默。《欧洲癌症杂志》。2003;39(4):517–23.[公共医学][谷歌学者]
  • Derycke LD，Bracke ME.N-钙粘蛋白在细胞间粘附、分化、胚胎发生、侵袭和信号传导中的作用。国际开发生物学杂志。2004;48(56):463–76.[公共医学][谷歌学者]
  • Dong SM，Kim HS，Rha SH，Sidransky D.子宫颈癌多基因启动子高甲基化。临床癌症研究。2001;7(7):1982–6.[公共医学][谷歌学者]
  • Duffy CL、Phillips SL、Klingelhutz AJ。微阵列分析确定由人乳头瘤病毒16型E6调节的分化相关基因。病毒学。2003;314(1):196–205.[公共医学][谷歌学者]
  • Dyson N、Guida P、Munger K、Harlow E.腺病毒E1A和人乳头瘤病毒E7蛋白中的同源序列介导与同一组细胞蛋白的相互作用。《维罗尔杂志》。1992;66(12):6893–902. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Dyson N，Howley PM，Munger K，Harlow E.人乳头状瘤病毒-16 E7癌蛋白能够与视网膜母细胞瘤基因产物结合。科学。1989;243(4893):934–7.[公共医学][谷歌学者]
  • Eisen MB、Spellman PT、Brown PO、Botstein D.全基因组表达模式的聚类分析和显示。美国国家科学院院刊。1998;95(25):14863–8. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Gilles C、Piette J、Peter W、Fusenig NE、Foidart JM。HPV-33-和HPV-33+ras-转染角质形成细胞的分化能力和致癌潜力。国际癌症杂志。1994年a；58(6):847–54.[公共医学][谷歌学者]
  • Gilles C，Polette M，Piette J，Birembaut P，Foidart JM。HPV-33转染的宫颈角质形成细胞的上皮-间质转化与明胶酶A的侵袭性和表达增加有关。国际癌症杂志。1994年b；59(5):661–6.[公共医学][谷歌学者]
  • Gilles C、Polette M、Piette J、Delvigne AC、Thompson EW、Foidart JM、Birembaut P.Vimentin在宫颈癌中的表达：与侵袭和迁移潜能的关系。病理学杂志。1996;180(2):175–80.[公共医学][谷歌学者]
  • Goldberg I，Davidson B，Lerner-Geva L，Gotlieb WH，Ben-Baruch G，Novikov I，Kopolovic J.宫颈鳞状细胞癌中细胞外基质蛋白的表达——一项临床病理学研究。临床病理学杂志。1998;51(10):781–5. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Gonzalez SL、Stremlau M、He X、Basile JR、Munger K。人乳头瘤病毒16型E7癌蛋白对视网膜母细胞瘤抑癌因子的降解对功能失活很重要，可与E7的蛋白酶体降解分离。《维罗尔杂志》。2001;75(16):7583–91. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hagemann T、Bozanovic T、Hooper S、Ljubic A、Slettenar VI、Wilson JL、Singh N、Gayther SA、Shepherd JH、Van Trappen PO。宫颈癌进展的分子分析。Br J癌症。2007;96(2):321–8. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Han SW，Roman J.纤维结合蛋白诱导人支气管上皮细胞增殖并抑制凋亡：PI3-激酶和NF-κB介导的致癌作用。致癌物。2006;25(31):4341–9.[公共医学][谷歌学者]
  • Hazan RB、Kang L、Whooley BP、Borgen PI。N-钙粘蛋白促进浸润性乳腺癌细胞与基质之间的粘附。细胞广告通讯。1997;4(6):399–411.[公共医学][谷歌学者]
  • Hirohashi S，Kanai Y。细胞粘附系统与人类癌症形态发生。癌症科学。2003;94(7):575–81. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Howie HL、Katzenellenbogen RA、Galloway DA。乳头瘤病毒E6蛋白。病毒学。2009;384(2):324–34. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Irizarry RA、Bolstad BM、Collin F、Cope LM、Hobbs B、Speed TP。Affymetrix基因芯片探针级数据摘要。核酸研究。2003;31（4） ：e15。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Islam S，Carey TE，Wolf GT，Wheelock MJ，Johnson KR。人类鳞癌细胞N-钙粘蛋白的表达诱导了分散的成纤维细胞表型，细胞间粘附受到破坏。细胞生物学杂志。1996;135（第6部分第1节）:1643–54。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Jeanes A、Gottardi CJ、Yap AS。钙粘蛋白与癌症：钙粘蛋白功能障碍如何促进肿瘤进展？致癌物。2008;27(55):6920–9. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Jones DL，Munger K.对表达人乳头瘤病毒16型E7癌蛋白的细胞中p53介导的G1生长抑制途径的分析。《维罗尔杂志》。1997;71(4):2905–12. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Jones DL、Thompson DA、Suh-Burgmann E、Grace M、Munger K。HPV E7癌蛋白的表达模拟但不激发p53依赖的细胞DNA损伤反应途径。病毒学。1999;258(2):406–14.[公共医学][谷歌学者]
  • Kang S、Kim JW、Kang GH、Park NH、Song YS、Kang SB、Lee HP。子宫颈癌中叶酸和蛋氨酸代谢酶的多态性和异常的CpG岛高甲基化。妇科肿瘤。2005;96(1):173–80.[公共医学][谷歌学者]
  • Kiyono T、Hiraiwa A、Fujita M、Hayashi Y、Akiyama T、Ishibashi M。高危人乳头瘤病毒E6癌蛋白与果蝇盘大肿瘤抑制蛋白的人类同源物的结合。美国国家科学院院刊。1997;94(21):11612–6. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Klingelhutz AJ、Foster SA、McDougall JK。人乳头瘤病毒16型E6基因产物对端粒酶的激活。自然。1996;380(6569):79–82.[公共医学][谷歌学者]
  • Kokkinos MI、Wafai R、Wong MK、Newgreen DF、Thompson EW、Waltham M.Vimentin和人乳腺癌上皮-间质转化——体内外观察。细胞组织器官。2007;185(13):191–203.[公共医学][谷歌学者]
  • Lee MY，Chou CY，Tang MJ，Shen MR.子宫颈癌上皮-间质转化：与肿瘤进展、表皮生长因子受体过度表达和蜗牛上调的关系。临床癌症研究。2008;14(15):4743–50.[公共医学][谷歌学者]
  • Lee SS，Weiss RS，Javier RT。人类病毒癌蛋白与hDlg/SAP97的结合，hDlg/SAP97是果蝇盘大肿瘤抑制蛋白的哺乳动物同源物。美国国家科学院院刊。1997;94(13):6670–5. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Mani SA、Guo W、Liao MJ、Eaton EN、Ayyanan A、Zhou AY、Brooks M、Reinhard F、Zhang CC、Shipitsin M、Campbell LL、Polyak K、Brisken C、Yang J、Weinberg RA。上皮-间充质转化产生具有干细胞特性的细胞。单元格。2008;133(4):704–15. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Martel C、Harper F、Cereghini S、Noe V、Mareel M、Cremisi C。SV40 T抗原对视网膜母细胞瘤家族蛋白的灭活导致肝细胞生长因子/分散因子自分泌环的产生，与上皮-纤维母细胞转化和侵袭性相关。细胞生长差异。1997;8(2):165–78.[公共医学][谷歌学者]
  • McLaughlin-Drubin ME，Munger K。人类乳头瘤病毒E7癌蛋白。病毒学。2009;384(2):335–44. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Michaels GS、Carr DB、Askenazi M、Fuhrman S、Wen X、Somogyi R.大规模基因表达数据的聚类分析和数据可视化。太平洋交响乐生物计算机。1998:42–53.[公共医学][谷歌学者]
  • Munger K、Baldwin A、Edwards KM、Hayakawa H、Nguyen CL、Owens M、Grace M、Huh K。人乳头瘤病毒诱导肿瘤发生的机制。《维罗尔杂志》。2004;78(21):11451–60. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Munger K、Phelps WC、Bubb V、Howley PM、Schlegel R。人类乳头瘤病毒16型的E6和E7基因一起对原代人类角质形成细胞的转化是必要的和充分的。《维罗尔杂志》。1989;63(10):4417–21. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Narayan G、Arias-Pulido H、Koul S、Vargas H、Zhang FF、Villella J、Schneider A、Terry MB、Mansukhani M、Murty VV。宫颈癌中CDH1、DAPK、RARB和HIC1基因频繁启动子甲基化：与临床结果的关系。摩尔癌症。2003;2:24. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Piboonniyom SO、Duensing S、Swilling NW、Hasskarl J、Hinds PW、Munger K。角质形成细胞永生化过程中视网膜母细胞瘤抑癌检查点的去除不足以诱导中心体介导的基因组不稳定性。癌症研究。2003;63(2):476–83.[公共医学][谷歌学者]
  • Rey O、Lee S、Park NH。人乳头瘤病毒16型E7癌蛋白抑制人纤维连接蛋白的转录。《维罗尔杂志》。2000;74(10):4912–8. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Riley RR、Duensing S、Brake T、Munger K、Lambert PF、Arbeit JM。子宫颈癌转基因小鼠模型中人类乳头瘤病毒E6和E7功能的解剖。癌症研究。2003;63(16):4862–71.[公共医学][谷歌学者]
  • Schaafsma HE、Van Der Velden LA、Manni JJ、Peters H、Link M、Rutter DJ、Ramaekers FC。细胞角蛋白8、18和波形蛋白在粘膜鳞状细胞癌浸润前沿的表达增加。病理学杂志。1993;170(1):77–86.[公共医学][谷歌学者]
  • Scheffner M、Werness BA、Huibregtse JM、Levine AJ、Howley PM。人类乳头瘤病毒16型和18型编码的E6癌蛋白促进p53的降解。单元格。1990;63(6):1129–36.[公共医学][谷歌学者]
  • Shivapurkar N、Sherman ME、Stastny V、Echebiri C、Rader JS、Nayar R、Bonfiglio TA、Gazdar AF、Wang SS。评估候选甲基化标记物检测宫颈肿瘤。妇科肿瘤。2007;107(3):549–53. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Terra AP、Murta EF、Maluf PJ、Caballero OL、Brait M、Adad SJ。异常启动子甲基化可作为宫颈上皮内瘤变III级患者复发疾病的标志物。图莫里。2007;93(6):572–9.[公共医学][谷歌学者]
  • Thiery JP，Sleman JP。复杂的网络协调上皮-间充质的转变。Nat Rev Mol细胞生物学。2006;7(2):131–42.[公共医学][谷歌学者]
  • Watson RA、Thomas M、Banks L、Roberts S。人乳头瘤病毒E6 PDZ结合基序的活性与永生化人角质形成细胞的增强形态转化相关。细胞科学杂志。2003;116（第24部分）：4925–34。[公共医学][谷歌学者]
  • Wen X，Fuhrman S，Michaels GS，Carr DB，Smith S，Barker JL，Somogyi R。中枢神经系统发育的大尺度时间基因表达图谱。美国国家科学院院刊。1998;95(1):334–9. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Yang HJ，Liu VW，Wang Y，Tsang PC，Ngan HY。妇科癌症的DNA甲基化差异及其与临床病理数据的相关性。BMC癌症。2006;6:212. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Zhang B，Chen W，Roman A.低风险和高风险人乳头瘤病毒的E7蛋白具有针对pRB家族成员p130进行降解的能力。美国国家科学院院刊。2006;103(2):437–42. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • zur Hausen H.乳头瘤病毒与癌症：从基础研究到临床应用。Nat Rev癌症。2002;2(5):342–50.[公共医学][谷歌学者]