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美国国家科学院院刊。2000年11月21日；97(24): 13227–13232.
2000年11月14日在线发布。 数字对象标识：10.1073/pnas.240444197
预防性维修识别码：PMC27207型
PMID：11078525

一种理解全球的化学基因组学方法雷帕霉素蛋白靶标（TOR）的功能

陈廷芳,* 约翰·卡瓦略,* 琳达·赖尔斯,†和X.F.史蒂文·郑*‡
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

雷帕霉素蛋白（TOR）的靶点是一个高度保守的共济失调毛细血管扩张相关蛋白激酶对细胞生长至关重要。新的证据表明，TOR信号非常复杂参与多种细胞过程。了解其概述功能，我们采用化学基因组学方法来探索基因TOR和其他酵母基因在基因组尺度上的相互作用。在本研究中，个体缺失突变体对雷帕霉素的敏感性由生成酵母菌属基因组删除项目进行了系统测量。我们的结果提供了对TOR的雷帕霉素敏感性功能。与传统相比遗传分析，这种方法提供了一种简单而彻底的分析基因组尺度上的遗传相互作用和测量遗传在不同可能的层面上进行互动。它可以用于研究其他药物靶点的功能及新蛋白的鉴定保守核心生物过程的组成部分，如DNA损伤受细胞渗透物干扰的检查点/修复化合物。

雷帕霉素是一种大环免疫抑制抗生素。当与它复合时免疫亲和素受体FKBP12，雷帕霉素抑制两种冗余相关蛋白、雷帕霉素蛋白（Tor）1p靶点和酵母中的Tor2p及其哺乳动物细胞中的同源FRAP/RAFT/mTOR（由参考文献审查）。1和2). 在酵母中，保守丝氨酸的突变残基，Tor1p中的Ser-1972或Tor2p中的Ser-1975，具有优势雷帕霉素抗性(三–6). 这些突变发生在FKBP12-雷帕霉素结合域并破坏FKBP12-雷帕霉素(7–9). 这些结果确定了Tor1p和Tor2p是雷帕霉素的生理靶点，并证明在雷帕霉素敏感性生长中具有冗余功能。最好的TOR的特征功能是平移控制，即在哺乳动物细胞和酵母中保存（参考文献综述）。1和2). 然而，证据表明TOR信号是高度复杂的可能参与许多细胞过程。在酵母中酿酒酵母、雷帕霉素治疗导致饥饿反应，包括G1细胞周期停滞，糖原积累(三,10)，自噬细胞增多(11)，蛋白质合成减少(10,12)和孢子形成(13). 最近研究表明，TOR调节参与核糖体生物发生(14,15)酵母的营养反应(16–19).了解TOR的一般作用对于剖析细胞内信号网络及雷帕霉素的进一步评价作为一种治疗药物。

遗传分析酿酒酵母做出了很大贡献我们对真核细胞调控的认识。通过使用表型读数，如细胞活力和形态学改变两个基因之间的遗传相互作用可以通过基因突变来检测这两种基因，在酵母中是一种强有力的工具，可以发现和表征生物途径。功能有条件丧失化学抑制剂的蛋白质大大促进了这种遗传分析（由参考文献审查）。20和21). 相对灵敏度药物酵母突变体已广泛用于基因鉴定以及表征各种重要的细胞过程。对于酵母突变体对苯诺明相对敏感性的研究导致识别微管网络组件和发现主轴检查点(22,23). 在这些研究中，一种蛋白质的功能丧失突变，作为药物靶蛋白的功能导致药物超敏反应。相反，靶点抑制剂的突变导致阻力。基因突变的鉴定药物敏感性表型导致了许多生物途径或过程。

完成酿酒酵母基因组序列以酵母为模型生物，彻底改变了研究分析基因表达的新工具，蛋白质全基因组基础上的相互作用和酶活性(24–27).这个酵母菌属基因组删除项目正在进行中致力于生产全套酵母突变菌株的联盟每个单独的ORF都被完全删除(28). 在这里，我们描述了TOR基因交互作用的全基因组分析，基于系统生成的酵母菌属缺失突变体。我们通过测量TOR与其他酵母基因的相互作用酵母缺失突变体对雷帕霉素的相对敏感性构建了TOR的全基因组遗传连锁图。我们的结果提供TOR可能的全局功能的全局视图。

材料和方法

酵母缺失突变体的来源和处理。

单倍体MATa公司非必需酵母缺失菌株为从Research Genetics（亚利桑那州亨茨维尔）购买。收集MATa公司和MATa/α杂合缺失第八号染色体的菌株是马克·约翰斯顿（华盛顿圣路易斯大学）。缺失菌株由用卡那霉素抗性盒KanMX4替换目标基因(28). 这个MATa公司和MATa/α删除菌株由亲本菌株BY4741和BY4743产生，分别(28). 在整个主屏幕中，所有缺失菌株由研究遗传学提供的内部代码识别和马克·约翰斯顿。相应基因的身份是只有在筛选过程完成后才能检索到。所有菌株对200毫克/升Geneticin（G418硫酸盐）进行了耐药性测试在雷帕霉素敏感性试验。

先前已知的雷帕霉素过敏（RH）和-抗性（RR）突变体。

过夜酵母提取物/蛋白胨/葡萄糖（YPD）培养物含野生型菌株BY4741、RR菌株任务大纲1相对应力表达Tor1p（S1972I），以及缺失菌株gln3Δ,rrd2Δ,bmh2Δ,脲2Δ、和托1Δ是以10倍的增量连续稀释，并点在YPD+/−25上nM雷帕霉素。所有缺失菌株的生长速度都相当YPD上有野生型。缺失菌株在30°C下生长后在服用雷帕霉素的YPD治疗的4天中，对他们进行评分“−”表示过敏，“+”表示过敏与野生型（得分为0）相比的抗性。每个“−”或“+”表示大约减少或雷帕霉素耐药性增加一个数量级。gln3Δ得分为“+++”。因此，根据此刻度，删除GLN3号机组通过以下方式赋予雷帕霉素耐药性≈1000倍（与野生型相比）。

主屏幕。

在筛选的初始阶段，所有缺失菌株均为用野生型BY4741或BY4743（如适用）作为控制。培养皿在30°C持续4天。只有当菌株表现出以下特征时，才将其标记为RH或RR在YPD平板上与野生型相比，生长有显著差异雷帕霉素，但不单独在YPD板上。第二阶段包括将分数分配给假定的RH和RR菌株。隔夜培养以10倍增量连续稀释并在YPD板上发现+/−25 nM雷帕霉素。这些平板在30°C下培养4天。在本研究中，我们重点关注得分为“++”的菌株或“−−”或更大。因此，只有那些更敏感的人雷帕霉素与bmh2Δ（得分为“−”）和对雷帕霉素具有同等或更高抗性的菌株与…相比rrd2Δ（得分为“++”）保留。少数缺失菌株在YPD上生长缓慢盘子。通过减去野生型和慢生长突变体在YPD+/-上的差异雷帕霉素可反映雷帕霉素的真实敏感性。

TOR依赖性和特异性的确认。

用表达RR的质粒pYDF80转化所有RH菌株Tor1p（S1972I）或携带野生型的对照质粒pYDF81任务大纲1。首先在合成定义的Leu−琼脂平板，然后将复制品镀到YPD+/-25 nM上雷帕霉素。平板在30°C下培养4天。如果RH菌株对雷帕霉素确实过敏，因为TOR，Tor1（S1972I）应恢复其超敏表型。

雷帕霉素与其细胞内受体FKBP12结合并抑制TOR。由于FKBP12涉及其他生物过程RH或RR表型仅仅是副作用的可能性FKBP12缺失，所有RH和RR菌株都被标记到YPD+/−25 nM FK506，在30°C下培养4天。应变显示FK506存在时的超敏反应被消除。要测试RH或RR表型是否只是次要影响，因为(我)雷帕霉素抑制蛋白质合成，或(ii（ii）)激活一般多药耐药反应雷帕霉素处理，菌株被划线到YPD+/-100 nM环己酰亚胺，在30°C下培养4天，并对敏感。

突变体的鉴定和功能群分类。

在这一阶段，RH和RR菌株的身份都被发现了。这个检索这些RH和RR基因的报告或预测功能来自酵母蛋白质组数据库(http://www.proteome.com/databases/index.html) (29). 基因报告或预测在相同的生物过程中发挥作用被分类到相同的功能组中。最后，有八个功能组（组I至VIII）以及组IX，由无法分类的基因或没有分类的基因组成已知功能。

结果

我们已经启动了大规模全基因组遗传通过测量TOR的相对灵敏度研究TOR的相互作用雷帕霉素的单个酵母缺失突变体。删除TOR信号传导抑制物或细胞过程中的基因负性据预测，由TOR调节的药物会产生部分雷帕霉素耐药性。相反，TOR信号中的增强子或TOR正调控的细胞过程产生雷帕霉素超敏反应（图。​（图11一).已经描述了雷帕霉素敏感性表型的这些例子在几项研究中bmh1、bmh2、gln3、和脲2，TOR信号的重要参与者(16,18,30). 为了简单起见，我们将这种全基因组遗传分析称为化学抑制剂a化学基因组学方法。因为细胞生长在这里用作屏幕上的读数显示，非必需基因可以用它们的单倍体或纯合二倍体缺失株，而基本基因可以用它们的杂合二倍体缺失株进行检测。这个每个突变体的雷帕霉素敏感性根据其野生型相对生长率TOR1（S1972I）(任务大纲1相对应力)和托1Δ应变雷帕霉素的缺乏和存在。我们选择了“−”或“+”描述雷帕霉素的相对敏感性。我们的大多数突变体在不存在雷帕霉素的情况下没有表现出生长缺陷。这个生长缓慢的少数菌株的得分与无雷帕霉素或有雷帕霉素的野生型菌株。由在一系列稀释实验中，我们定量地估计了每一个“−”或“+”表示大约增加/减少药物敏感性提高一个数量级。我们选择进一步只分析得分至少为“−−”或“++”（雷帕霉素敏感性变化100倍）。此外大多数阳性突变体（>95%）生长缓慢在正常条件下。因此，药物敏感性的提高或我们阳性突变体的耐药性反映了它们的遗传相互作用TOR而不是相关突变的加性效应雷帕霉素对细胞生长的影响。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为pq2404441001.jpg

酵母缺失菌株的雷帕霉素敏感性试验。(一)遗传相互作用的简化模型雷帕霉素敏感途径中的TOR和其他成分。(b条)酵母缺失的雷帕霉素敏感性检测已知在雷帕霉素敏感信号传导中起作用的基因突变。野生型酵母（WT），RR菌株(任务大纲1相对应力),表达Tor1p（S1972I）或缺失的菌株GLN3、RRD2，BMH2、URE2、，或任务大纲1被划到YPD上，YPD+25 nM雷帕霉素或YPD+25nM FK506平板，并在30°C下培养。(c（c）)雷帕霉素敏感性评分b条.

到目前为止，我们主要关注非必需单倍体突变体和筛选出2216个非必需缺失突变体。这些突变体代表酵母中超过一半的非必需基因(28). 我们有还进行了50个杂合必需基因的小规模筛选来自第八染色体基因的二倍体缺失菌株。它是值得注意的是，已知参与TOR信号传导的基因是正确评分，包括宝马2Δ (−) (30),rrd2型Δ (++) (31),gln3号机组Δ（+++），以及尿素2Δ (−−−−) (16,18)（图。​（图11 b条和c（c）)为我们的方法。我们鉴定了100个单倍体突变体2216个缺失突变体的雷帕霉素敏感性表型筛选出73个RH突变体和27个RR突变体。为了简单起见，它们相应的基因统称为RH和RR基因。我们还发现了6株RH二倍体杂合缺失菌株分析了50个突变体的表型（见表3，该表已发布作为PNAS网站上的补充材料，网址：www.pnas.org). 因此，化学基因组学适用于必需和非必需缺失突变体。

为了直接证明RH突变体对雷帕霉素是由于TOR的抑制，我们检测了它们的有无RR TOR1时雷帕霉素敏感性（S1972I）（TOR1相对应力). 我们发现所有表达RH的突变体TOR1（S1972I）对雷帕霉素不再过敏（示例如下在图中。​图2）。2). 此外，没有RH菌株对FK506过敏，只有9株RH菌株，环己酰亚胺（见表3）。因此，RH的RH表型突变体忠实地反映了TOR和RH基因，而非一般药物效应。因为基因突变某些基因可以引起多药耐药性(20)，我们问是否有RR突变体表现出这种表型。我们检查了环己酰亚胺（一种抑制蛋白质的抗生素）的RR突变体合成，雷帕霉素也是如此，这已被用于许多研究涉及多药耐药性。我们发现没有RR突变体对环己酰亚胺具有抗性（数据未显示）。因此，RR所有RR突变体的表型都是雷帕霉素特有的。拿总之，这些结果确定了RH和RR基因的遗传与TOR互动。

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RH突变体的雷帕霉素超敏反应是由于遗传RH基因与TOR的相互作用。每一种的选择性RH突变体携带表达RR TOR1（S1972I）的pYDF80的功能基团或对照质粒被复制到YPD或YPD+25nM雷帕霉素和在30°C下培养。

在所有RH和RR基因中，91个（86%）具有已知功能，这很有趣，因为只有一半的非必需基因具有已知功能。这种情况类似于基因，其中大多数具有已知功能。一直以来这表明已知的基因是在更早的时候被鉴定出来的，因为细胞生长的重要性(28). 虽然我们目前的分析涵盖了仅略多于酵母总基因的三分之一采样足以提供总体视图TOR的潜在功能。大多数已知的RH和RR基因根据他们之前的经历将其分为八组以细胞角色为特征（见表3）。这是预期结果，因为不止一个基因应该表现出显著的遗传相互作用TOR在涉及TOR的途径中。因此，这些基因簇表明TOR在各自的细胞中的作用过程。我们将每个基因簇称为TOR功能群方便进一步讨论其与TOR的潜在联系功能。

营养依赖功能。

功能组I（蛋白质合成）包含七个基因，包括五个核糖体蛋白基因。TOR最近被证明是核糖体生物生成所必需的(15). 雷帕霉素超敏反应r蛋白突变体与TOR的证据一致积极调节核糖体的生物发生(15). 有趣的是，来自筛选出45个r蛋白突变体，只有4个表现出显著的RH表型（表​（表2）。2). 因此，这些RH核糖体基因可能发挥独特作用在TOR依赖性蛋白质合成/核糖体中的重要作用生物成因。

表2

雷帕霉素对蛋白质合成缺失的敏感性基因

ORF公司基因名称分数ORF公司基因名称分数
翻译起始因子
 YJL138C型畅通节能法0YMR012瓦CLU1号机组0
平移延伸系数
 YDR385W型出口20289瓦GUF1公司0
 YKL081W型TEF4型0约尔133WEFT1型0
核糖体蛋白质
 YPL220W型RPL1A型0YGR214W型RPS0A型0
 198W型RPL7B型0YLR048W型RPS0B型0
 YLL045C型转速8b0YML063W型RPS1B型0
 YGR085C型RPL11B型0YBR181C型RPS6B系列0
 YEL054C（黄色054C）RPL12A型0约尔293WRPS10A型0
 YDR418W型RPL12B型−−−230瓦RPS10B型0
 YKL006W型RPL14A型0约尔369CRPS12型0
 YNL301C型18亿卢比0YJL191W型RPS14B型0
 公元242C年RPL20A型0143瓦RPS16A型0
 约尔312CRPL20B型0YML024W型RPS17A型0
 YLR061W型RPL22A型0YML026C型18亿卢比0
 YGR148C型RPL24B型0炔302c放射性同位素19B0
 YGR034W型RPL26B型+YHL015W型RPS20型−−−−
 是R056C-ARPL34A型0YJL190C型RPS22A型0
 1949瓦RPL36A型0YGR118W型RPS23A型0
 185瓦RPL37A型0132瓦RPS23B型0
 YJL189W型RPL39型0叶074wRPS24A型0
 YOL039W公司RPP2A型0YGR027C型RPS25A系列0
 YDR382W型RPP2B型−−YKL156W型RPS27A型0
 YDR115W型0YHR021C型RPS27B型−−−−
 YDR116C型0约尔167C转速28a0
264瓦RPS28B型0
YLR287C-A型RPS30安0
约尔182CRPS30B型0

功能组II（营养感应/信号）有10个基因：6个参与氮分解代谢阻遏，有四个参与碳分解代谢抑制（CCR）。该结果与一些报告表明TOR信号与氮营养有关涉及GATA-转录因子的传感和基因表达甘氨酸3p(16–19). TOR直接与Gln3p相互作用并调节通过磷酸化实现Gln3p的核质易位(16). 尿素2p通过结合并抑制Gln3p的去磷酸化(16). 与上述内容一致调查结果Δgln3突变授予部分雷帕霉素抗性，而Δ尿素2呈现突变超敏反应。TOR信号也可以调节葡萄糖依赖性基因的表达，如参与三羧酸循环（未发表的结果；参考。17). 然而相关的信号成分和转录因子尚未已确定。Ccr4p是参与中央控制室(32). 葡萄糖脱压需要Snf7p(33). 因此，Ccr4p和Snf7p是介导TOR信号传导至调节CCR敏感基因。

功能组III（代谢生物合成）包含八个基因编码与氨基酸、核苷酸和脂质有关的酶生物合成。Ser1p和Ser2p是转换中间产物的关键酶从糖酵解到丝氨酸和半胱氨酸前体的分子(34).Hom2p和Hom3p是合成所必需的早期酶通向缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸和苏氨酸(35,36). 同样的途径也为嘌呤和脂类的生物合成。因为雷帕霉素治疗通过提高一般氨基酸的表达增加氨基酸的摄取酸渗透(16–19)，这些突变体的超敏反应是不太可能是细胞内耗竭的间接影响氨基酸。我们的结果还表明TOR在氨基酸、核苷酸和脂质的生物合成。

功能组IV（线粒体生物发生和功能）包括线粒体蛋白质合成、生物发生、，和呼吸。这些基因的缺失通常导致部分RR，表明TOR在正常情况下对这些基因进行负调控生长条件。哈德威克等。最近有报道称雷帕霉素提高了许多与三羧酸循环(17). 我们的结果提供了进一步的证据TOR广泛参与线粒体形态发生/功能。

综上所述，这些结果表明TOR广泛参与碳和氮营养素调节的细胞过程，包括代谢生物合成、呼吸、翻译和营养调节转录。我们的数据进一步支持了这一概念TOR是调节细胞的营养信号传导的关键成分生长和功能对养分可用性的响应。

转录调控。

功能群V（一般转录）由12个组成编码基本转录复合物成分的基因，激活剂、阻遏剂和染色质沉默剂（表3）。最近的基因表达谱研究表明，雷帕霉素引起快速各种各样的基因(16,17,19). 确定的一般转录调节因子这与TOR作为积极和消极调节器的作用是一致的普通基因转录。这些转录因子很可能参与TOR和可能会为这一领域的未来研究提供一个重要的链接。

液泡生物发生、功能和蛋白质靶向。

功能组VI（空泡功能）有11个基因参与从高尔基体到液泡的蛋白质分类靶向性、液泡生物发生和功能。这与液泡在自噬细胞增多症中的作用由TOR规定(11,37). 自噬作用是一个产生通过降解细胞溶质实现小分子营养物质的内部供应碳氮循环中的细胞器、蛋白质和核糖体饥饿(38). 因为所有这些液泡突变体都是超敏的对于雷帕霉素，它们的相应基因与依赖于任务大纲的过程（表3）。因此，TOR似乎参与了液泡功能的积极和消极方面。酵母液泡是储存营养和其他物质的重要隔间小分子和维持生物合成之间的动态平衡和降解（参考文献。39). 液泡功能的调节TOR也可能在其调节细胞对养分有效性的反应。

泛素依赖性蛋白水解。

官能团VII（泛素依赖性蛋白水解）包含泛素依赖性蛋白水解的三个基因途径：两个蛋白质体亚单位（Pre9p和Rpn1p）（参考文献综述）。40和41)和后期促进复合物的一个亚基（Cdc23p）或环体（参见参考文献。42). 该组中的突变导致对雷帕霉素过敏，提示泛素依赖性需要使用降解装置来实现任务大纲。在T淋巴细胞中，细胞周期素依赖性激酶的降解抑制剂p27Kip1由泛素依赖性蛋白水解介导被雷帕霉素抑制(43). 因此，泛素依赖性蛋白水解似乎对TOR的保守功能很重要。

微管相关功能。

功能组VIII（纺锤功能/稳定性）有六个基因有丝分裂纺锤体组装和稳定性所必需的。符合这一发现，我们最近表明Tor1p和Tor2p都相互作用Bik1p是一种微管相关蛋白(44). 雷帕霉素治疗迅速导致微管不稳定和缺陷微管相关功能，如纺锤伸长和取向、染色体分离、核迁移和核配(44). 雷帕霉素治疗也会导致哺乳动物细胞和酵母(44,45). 染色体不稳定性（CIN）是导致人类癌症的重要因素（参考文献。46). 这些观察结果表明，CIN可能对雷帕霉素，因此可能限制其作为免疫抑制药物。从这个意义上讲，这种方法也提供有关以下潜在副作用的宝贵信息治疗药物。

讨论

我们采用化学基因组学方法系统应用于大规模遗传互作分析产生雷帕霉素敏感性的酵母缺失菌株。到目前为止，我们已经鉴定出106个表现出雷帕霉素敏感性的突变体超过2266个酵母基因的表型或超过总数的三分之一酵母基因。大多数RH和RR基因具有已知的功能并聚集成八个功能群：蛋白质合成、碳和氮分解代谢阻遏、代谢生物合成、线粒体生物发生和功能、一般转录、液泡生物发生功能、泛素依赖性蛋白水解和纺锤稳定性和功能（表3）。这些结果提供了对TOR的潜在功能。此外，RH和RR基因可能提供与未来TOR作用机制研究的重要联系以及这些基因在各种细胞内过程中的作用。

许多具有重要细胞功能的基因在TOR功能组。例如，在筛选出的13个细胞周期蛋白突变体中，包括6个G1周期蛋白和5个Clbs公司，只有clb5类Δ应变对雷帕霉素（−−）（表​（表1）。1). 因为Clb5p在调节Cdc28p激酶过程中与其他Clb是多余的有丝分裂（参考文献综述。47)雷帕霉素敏感性clb5类Δ必须归因于Clb5p的独特功能。一个这种看似合理的功能是其在有丝分裂纺锤体稳定性中的作用(48).Cln3p被认为是TOR信号的重要介导者(10). 然而，令人惊讶的是，这三个都没有cln公司突变体(cln1型Δ,氯离子2Δ和第3类Δ)对雷帕霉素的敏感性明显增强。在每个单独的雷帕霉素敏感官能团，仅高度我们在屏幕上对选择性基因进行了评分。只有五种核糖体蛋白在突变体中分离出包括45个核糖体蛋白和六个平移起始和延伸因子（表​（表2）。2). 因此，这种方法是特定的似乎揭示了可能在涉及TOR的路径/过程。因此，进一步研究相对湿度每个功能组中的RR突变体应提供机制深入了解TOR的功能及其独特作用。这些结果还表明，这种方法是特定的随机识别任何对细胞生长重要的基因。

表1

细胞周期蛋白缺失的雷帕霉素敏感性突变体

ORF公司基因名称分数
G1/S-特异性细胞周期蛋白
 1999瓦CLN1型0
 YPL256C型CLN2型0
 雅尔040cCLN3号机组0
G2/M-特异性细胞周期蛋白
 YGR108W型CLB1级0
 119瓦CLB2类0
 210瓦CLB4级0
 120C扬程CLB5类−−
 YGR109C型CLB6类0
G1/S特异性细胞周期蛋白；Pho85p相关
 YNL289W型PCL1系列0
 yil050瓦PCL7系列0
 YPL219W型PCL8系列0
其他Pho85p相关细胞周期蛋白
 YGL215W型CLG1级0
 YOL001W公司电话800

与任何方法一样，这种方法也有其局限性。Tor1p和Tor2p具有对雷帕霉素敏感的多余功能(6,8).Tor2p还具有雷帕霉素敏感性的独特基本功能正常肌动蛋白细胞骨架所必需的(8,49). 因为这个该方法基于雷帕霉素敏感性，不会暴露Tor1p和/或Tor2p的雷帕霉素敏感性功能。同意根据之前的发现，删除ROM1（只读存储器1）和ROM2（只读存储器2）雷帕霉素敏感性的两个重要效应物Tor2p的独特功能(49)不影响雷帕霉素敏感性（未显示数据）。此外，某些基因功能的突变众所周知，线粒体和液泡对药物敏感性。尽管TOR与这些功能相关细胞器(11,17)，在解释与这些细胞器相关的突变表型。

传统的基因筛查有助于我们了解生命的分子控制。然而，在介绍遗传学方法。在传统酵母基因筛查中突变体的收集需要通过诱变产生，这往往有偏见和不完整。许多基因可能由于它们的弱表型或部分失活。此外，激活或功能缺失突变通常会使屏幕复杂化。一旦突变体是孤立的，必须进行复杂的杂交消除显性突变和同一基因座上的突变。最后，a质粒库必须转化为每个突变菌株互补性鉴定相关基因。甚至筛选部分酵母基因组的研究通常需要相当大的努力。最近的一个新转座子插入突变技术(50)以改进鉴定突变基因的效率。我们的方法很有优势提供了一个简单、彻底和在基因组尺度上相对公正的方法。每个缺失突变包含完整删除整个ORF，并且定义良好。由于每个缺失菌株都是条形码的，因此该程序可以很容易地高吞吐量屏幕的自动化(28,51,52). 这种方法测量不同可能水平的遗传相互作用，弱的或强的。它测试所有基因的相互作用美国。酿酒.随着新兴新药的设计和筛选技术，许多重要的保守蛋白质已经或将要特定化学抑制剂。这种方法应该会发现在理解重要调节蛋白和细胞调控网络。此外，它可以用于评估治疗药物对细胞生长和发挥作用，并提供有关潜力的宝贵信息药物的副作用和额外益处。

补充材料

补充表：

致谢

我们感谢M.Johnston博士为我们提供Zheng实验室的酵母缺失菌株和其他阅读这份手稿。这项工作得到了国家霍华德·休斯医学院研究员奖（X.S.Z.）。X.S.Z.是科尔曼基金会的学者。

缩写

YPD公司酵母提取物/蛋白胨/葡萄糖
相对应力抗雷帕霉素
右侧雷帕霉素过敏

脚注

印刷前在线发布的文章：程序。国家。阿卡德。科学。美国,10.1073/pnas.240444197。

文章和出版日期见www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.24044197

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文章来自美国国家科学院院刊由以下人员提供美国国家科学院